CC BY
20
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 577.121 DOI 10.18522/0321-3005-2016-3-31-35
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС У RATTUS NORVEGICUS ПРИ СОЧЕТАННОМ ВЛИЯНИИ ТРАВМЫ И МОДЕЛЬНОЙ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ
© 2016 г. И.А. Аллилуев, Е.М. Вечканов, И.А. Сорокина, Ю.Н. Калюжная, В.В. Внуков
Аллилуев Илья Александрович - аспирант, кафедра биохимии Alliluev Il'ya Aleksandrovich - Post-Graduate Student, De-
и микробиологии, Академия биологии и биотехнологии им. partment of Biochemistry and Microbiology, Ivanovskii Acad-
Д.И. Ивановского Южного федерального университета, пр. emy of Biology and Biotechnology of the Southern Federal
Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, 344090, e-mail: University, Stachky Ave, 194/1, 344090, Russia, e-mail:
alliluev@sfedu.ru alliluev@sfedu.ru
Вечканов Евгений Михайлович - кандидат биологических наук, Vechkanov Evgenii Mikhailovich - Candidate of Biological
доцент, кафедра биохимии и микробиологии, Академия биоло- Science, Associate Professor, Department of Biochemistry
гии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского Южного федераль- and Microbiology, Ivanovskii Academy of Biology and Bio-
ного университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, technology of the Southern Federal University, Stachky Ave,
344090, e-mail: emvechkanov@sfedu.ru 194/1, 344090, Russia, e-mail: emvechkanov@sfedu.ru
Сорокина Ирина Алексеевна - кандидат биологических наук, Sorokina Irina Alekseevna - Candidate of Biological Sci-
доцент, кафедра биохимии и микробиологии, Академия биоло- ence, Associate Professor, Department of Biochemistry and
гии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского Южного федераль- Microbiology, Ivanovskii Academy of Biology and Biotech-
ного университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, nology of the Southern Federal University, Stachky Ave,
344090, e-mail: iasorokina@sfedu.ru 194/1, 344090, Russia, e-mail: iasorokina@sfedu.ru
Калюжная Юлия Николаевна - аспирант, кафедра биохимии Kalyuzhnaya Yuliya Nikolaevna - Post-Graduate Student,
и микробиологии, Академия биологии и биотехнологии Department of Biochemistry and Microbiology, Ivanovskii
им. Д.И. Ивановского Южного федерального университета, Academy of Biology and Biotechnology of the Southern
пр. Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, 344090, e-mail: Federal University, Stachky Ave, 194/1, 344090, Russia,
yuliyakalyuzhnaya @mail.ru e-mail:yuliyakalyuzhnaya@mail.ru
Внуков Валерий Валентинович - кандидат биологических наук, Vnukov Valerii Valentinovich - Candidate of Biological
профессор, кафедра биохимии и микробиологии, Академия Science, Professor, Department of Biochemistry and Micro-
биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского Южного фе- biology, Ivanovskii Academy of Biology and Biotechnology of
дерального университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов-на- the Southern Federal University, Stachky Ave, 194/1,
Дону, 344090, e-mail: vvvnukov@sfedu.ru 344090, Russia, e-mail: vvvnukov@sfedu.ru
Исследованы интенсивность продукции активных форм кислорода, скорость окисления липидов в плазме крови крыс и активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в печени животных при травме на фоне гипергомоцистеинемии. Показано увеличение интенсивности продукции активных форм кислорода наряду с растущей антиоксидантной активностью плазмы крови крыс с 3-х по 14-е сут после причинения механических повреждений на фоне гипергомоцистеинемии. Выявлена обратная корреляционная зависимость между активностью СУА и каталазы.
Ключевые слова: умеренная гипергомоцистеинемия, травма опорно-двигательного аппарата, тромбофилия, хемилю-минесценция, окислительный стресс.
Studied the intensity of the production of reactive oxygen species, the rate of lipid oxidation in rat plasma and the activity of SOD and catalase in the liver of animals in trauma on the background of hyperhomocysteinemia. The increase rate ofproduction of reactive oxygen species, along with increasing the antioxidant activity of rat plasma with a third at the 14th day after the occurrence of mechanical damage to the background hyperhomocysteinemia. There was an inverse correlation between the activity of catalase and SRA.
Keywords: medium hyperhomocysteinemia, trauma of the musculoskeletal system, thrombophilia, chemiluminescence, oxidative stress.
Травма и оперативные вмешательства приво- ность тромбоэмболических осложнений. С дру-
дят к генерализованным повреждениям эндоте- гой стороны, немаловажную роль в патогенезе
лия сосудов и сдвигу системы гемостаза в сторо- сердечно-сосудистых заболеваний играют нару-
ну гиперкоагуляции, что увеличивает вероят- шения метаболизма гомоцистеина, являясь одним
из независимых факторов тромбофилии и дисфункции эндотелия, в том числе за счет развития окислительного стресса, окислительной модификации липидов и белков, изменения продукции антиоксидантных ферментов [1—6]. В научной литературе мало представлены исследования, направленные на биохимическую оценку интенсивности свободнорадикальных процессов и состояния антиоксидантных ферментов при соче-танном травматическом воздействии на организм на фоне уже существующей умеренной гиперго-моцистеинемии. В этой связи целью нашего исследования явилось изучение особенностей сво-боднорадикального окисления и функционирования антиоксидантных ферментов в тканях крыс на 3-и, 7-е и 14-е сут при травме опорно-двигательного аппарата в условиях умеренной экспериментальной гипергомоцистеинемии.
Индукцию гипергомоцистеинемии у крыс осуществляли путем ежедневного защёчного введения 1%-го раствора L-метионина в дистиллированной воде из расчета 0,04 г/100 г веса крысы в сутки [6]. Нанесение травмы проводилось под наркозом с использованием золетила в концентрации 5 мг/100 г с помощью специально разработанного механического устройства [7]. После окончания срока эксперимента животных декапитировали под наркозом с использованием золетила в концентрации 5 мг/100 г. В качестве биологического материала использовали плазму крови, полученную из гепа-ринизированной крови, и гомогенат ткани печени. Ткань печени гомогенизировали на холоде в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl рН 7,4 с добавлением до конечной концентрации 0,1 % TritonX100. Содержание гомоцистеина в плазме крови определяли с использованием набора реагентов Immulite 2000XPi (Siemens Healthcare Diagnostics, Германия). Интенсивность продукции активных форм кислорода (АФК) в плазме крови лабораторных животных регистрировали флуорометрически при
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на 64 белых крысах-самцах Rattus norvegicus массой 250+300 г в возрасте 6 мес. с учетом этических принципов экспериментирования на животных. Содержание животных осуществлялось в стандартных клетках в условиях 12-часового режима освещения и свободного доступа к корму и воде. Животные были рандомизированы на 8 групп по 8 особей в каждой: 1-я - интактные животные; 2-4-я - животным формировали закрытый перелом костей голени и выводили из эксперимента через 3, 7 и 14 сут; 5-я -животным в течение 30 сут ежедневно вводили метио-нин, после чего выводили из эксперимента; 6-я, 7-я и 8-я - животным в течение 30 сут ежедневно вводили метионин, формировали закрытый перелом костей голени, продолжая вводить метионин, и выводили из эксперимента через 3, 7 и 14 сут (таблица).
Xex = 488 нм и Xem = 524 нм, используя 2',7'-Dichlorofluorescein (DCFH) на спектрофлуориметре RF-5301 Shimadzu (Япония) [8]. Хемилюминесцен-цию (ХЛ) плазмы крови проводили в системе гемоглобин - Н2О2 - люминол на хемилюминометре SmartLum 5773 (Россия) [9], АОА представляли в виде концентрации эквивалентного раствора ас-корбата (аскорбатный эквивалент, мМ), а скорость окисления липидов (СОЛ) - по тангенсу угла наклона левого плеча медленной вспышки ХЛ (tg а). Интенсивность свободнорадикального окисления липидов определяли по содержанию его молекулярных продуктов: диеновых конъюгатов (ДК) [10], малонового диальдегида (МДА) [11] и шиф-фовых оснований (ШО) [12]. Общие липиды экстрагировали по методу Bligh [13]. Определение общего белка осуществляли методом Lowry в модификации Schacterle - Pollack [14]. Для измерения активности супероксиддисмутазы (СОД) применяли спектрофотометрический анализ конкурентного ингибирования СОД в условиях генерации супероксидного анион-радикала при аутоокислении ад-
Дизайн эксперимента
Количество дней, в течение которых вводили метионин Формирование перелома на 30-е сут от начала эксперимента Взятие биологического материала после травмы
Группа на 3-и сут (33-й день эксперимента) на 7-е сут (37-й день эксперимента) на 14-е сут (44-й день эксперимента)
Число особей
1 - - 8
2 - + 8
3 - + 8
4 - + 8
5 30+7 - 8
6 30+3 + 8
7 30+ + 8
8 30+14 + 8
реналина в адренохром [15]. Активность каталазы (КАТ) определяли спектрофотометрически по убыли субстрата (Н202), способного образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс [16]. Для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали параметрический критерий Стьюдента. Оценку соответствия типа распределения выборки нормальному проводили с использованием метода трех сигм. Разницу средних величин считали достоверной при р < 0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Адекватность моделирования умеренной гипер-гомоцистеинемии нами показана по содержанию гомоцистеина в плазме крови исследуемых групп животных. В контрольной группе крыс средний уровень гомоцистеина в плазме крови составил 7±0,3 мкмоль/л, во 2-4-й группах средняя его концентрация составила 8±1,2 мкмоль/л, в 5-8-й -47±1,6 мкмоль/л, что достоверно выше значений контрольной группы в 4 раза и соответствует ги-пергомоцистеинемии средней тяжести.
Повышенный уровень гомоцистеина в плазме крови опосредует гиперпродукцию реакционно-способных метаболитов кислорода, приводя к окислительному стрессу. Активные формы кислорода и азота оказывают выраженное негативное воздействие на эндотелиальную регуляцию сосуди-
стого тонуса, систему тромбогенеза и коагуляции крови [2-4, 17]. В связи с этим представляется важным определение интенсивности продукции АФК и уровня антиоксидантной активности (АОА) в плазме крови при травме на фоне гипергомоци-стеинемии с привлечением флуоресцентного и хе-милюминесцентного методов анализа. На рис. 1 представлены обобщённые данные (% изменения относительно контроля) по интенсивности продукции АФК, уровню АОА и tga в плазме крови крыс в ходе эксперимента.
Интенсивность продукции АФК у животных с травмой опорно-двигательного аппарата (2-4-я группы) и ее сочетанием с умеренной гипергомо-цистеинемией (6-8-я группы) имеет тенденцию к увеличению, при этом в 4-й и 8 -й группах данный показатель статистически значимо отличается от контроля на 83,9 и 94,5 % соответственно. АОА плазмы крови также увеличивается с течением времени после формирования травмы (2-4-я группы) и травмы на фоне повышенного содержания гомоцистеина (6-8-я группы) и достигает максимума в 86,7 (4-я) и 155,1 % (8-я группа) на 14-й день после нанесения травмы. Наблюдается обратная зависимость между уровнем АОА в плазме крови крыс и СОЛ, что выражается в достоверном снижении угла а в плазме крови исследуемых групп животных при травме и травме на фоне умеренной гипергомоцистеинемии на 32,9 % в 4-й группе и на 29,7 - в 8-й.
Рис. 1. Изменения относительно контроля интенсивности продукции АФК, АОА и СОЛ в плазме крови крыс в ходе эксперимента; * - достоверные изменения (р < 0,05)
Интенсификация свободнорадикальных процессов неизбежно приводит к инициации и развитию цепного процесса свободнорадикального окисления липидов, способствуя накоплению его молекулярных продуктов. Нами определен уровень содержания первичных продуктов перикисного окисления липидов (ПОЛ) - ДК, вторичного молекулярного продукта - МДА, конечных продуктов -ШО, а также активность СОД и КАТ в печени исследованных крыс (рис. 2).
Об интенсивности протекания окислительного стресса при механической травме можно судить по накоплению продуктов ПОЛ и по состоянию анти-
оксидантной системы. В группе животных с повреждением опорно-двигательного аппарата на 3-и, 7-е и 14-е сут в печени наблюдается резкое повышение уровня МДА на 33, 15 и 66 % без статистически значимого изменения уровня ДК и ШО. Активность СОД в печени снижена на всём протяжении исследования на 25, 23 и 15 % соответственно на фоне значительного роста активности КАТ на 7-е (74,3) и 14-е (41,5 %) сут эксперимента. Несомненно, травматическое воздействие приводит к развитию окислительного стресса, осложнённого рассогласованием в работе сопряжённых ферментов СОД и КАТ.
ЙДК □ МДА ИШО 0СОД и КАТ
Рис. 2. Изменения относительно контроля интенсивности свободнорадикального окисления липидов по уровню продукции ДК, МДА и ШО и активность СОД и КАТ; * - достоверные изменения (р < 0,05)
В печени животных с умеренной гипергомоци-стеинемией (5 -я группа) не отмечено статистически значимого увеличения продуктов ПОЛ, возможно, из-за повышенной активности КАТ (34,8 % по отношению к контрольной группе).
Заключение
Таким образом, окислительный стресс при травме на фоне гипергомоцистеинемии на 7-е сут достигает пика своей выраженности при недостаточной работе основного регулятора процесса сво-боднорадикального окисления - фермента СОД на фоне выраженной активности КАТ. Спустя две недели после травмы отмечается некоторая нормализация параметров процессов ПОЛ, выраженная в снижении МДА и ШО, что предположительно свя-
зано с изменением уровня антиоксидантов, повышающих АОА.
Литература
1. Brattstrom L.,Wilcken D.E. Homocysteine and cardiovascu-
lar disease: cause or effect? // Am. J. Clin. Nutr. 2000. Vol. 72. P. 315-323.
2. Болдырев А.А. Молекулярные механизмы токсичности
гомоцистеина // Биохимия. 2009. Т. 74, вып. 6. С. 725736.
3. Кураян К.М., Березовский Д.П., Микашинович З.И. Осо-
бенности окислительного стресса и морфометрические показатели сосудов микроциркуляторного русла при экспериментальной умеренной гомоцистеинемии // Ва-леология. 2012. № 3. С. 7-12.
4. Kolling J., Scherer E., da Cunha A. Homocysteine induces
oxidative-nitrative stress in heart of rats: prevention by folic acid // Cardiovasc. Toxicol. 2011. Vol. 11, № 1. P. 67-73.
5. Tousoulis D., Bouras G., Antoniades C. The activation of
endotelhelin-1 pathway during methionine-induced homocysteinemia mediates endothelial dysfunction in hypertensive individuals // J. Hypertens. 2010. Vol. 28, № 5. P. 925-930.
6. Dayal S., Lentz S.R. Murine Models of Hyperhomocys-
teinemia and their Vascular Phenotypes // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008. Vol. 28, № 9. Р. 1596-1605.
7. Березовский Д.П., Мажугин В.Ю., Кураян К.М., Кура-
ян М.Б., Крайнова Н.Н., Хабарова О.В., Варавва Т.А., Корниенко И.В. Экспериментальная модель умеренной гипергомоцистеинемии для изучения патогенеза тромботиче-ских осложнений при травме опорно-двигательного аппарата // Кубанский науч. мед. вестн. 2011. № 5. С. 21-24.
8. Cathcart R., Schwiers E., Ames B.N. Detection of pico-mole
levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluo-rescein assay // Anal. Biochem. 1983. Vol. 134. Р. 111-116.
9. Тесёлкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Клеба-
нов Г.И., Владимиров Ю.А. Определение антиоксидант-ной активности плазмы крови с помощью системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол // Вопросы мед. химии. 1998. Т. 44, № 1. С. 70-76.
10. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюга-
ции ненасыщенных жирных кислот // Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 63-64.
11. Стальная И.Д., Горишвили Т.Г. Метод определения ма-
лонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 66-68.
12. Bidlack W.R., Тappel A.L. Fluorescent products of phospho-
lipids during lipid peroxidation // Lipids. 1973. Vol. 68, № 4. Р. 203-209.
13. Bligh E.J., Dyer W.J. Rapid methods of total lipid extraction
and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. Vol. 37, № S. P. 911-917.
14. Shacterle G.R., Pollack R.L. A simplified method for the
quantitative assay of small amounts of protein in biological material // Anal. Biochem. 1973. Vol. 51. P. 654-655.
15. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса
аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы мед. химии. 1999. № 3. С. 14 - 15.
16. КоролюкМ.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е.
Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 19SS. № 1. С. 16-19.
17. Zgraham I.M., Daly L.E., Refsum H.M. Plasma homo-
cysteine as a risk factor for vascular disease // The Eur. Conc. Act. Rep. JAMA. 1997. Vol. 277. P. 1775-1781.
References
1. Brattstrom L., Wilcken D.E. Homocysteine and cardiovas-
cular disease: cause or effect? Am. J. Clin. Nutr., 2000, vol. 72, pp. 315-323.
2. Boldyrev A.A. Molekulyarnye mekhanizmy toksichnosti
gomotsisteina [Molecular mechanisms of toxicity of homocysteine]. Biokhimiya, 2009, vol. 74, no 6, pp. 725-736.
3. Kurayan K.M., Berezovskii D.P., Mikashinovich Z.I. Oso-
bennosti okislitel'nogo stressa i morfometricheskie po-kazateli sosudov mikrotsirkulyatornogo rusla pri eksperi-mental'noi umerennoi gomotsisteinemii [Features of oxida-tive stress and morphometric parameters microvascular in
Поступила в редакцию_
experimental mild homocysteinemia]. Valeologiya, 2012, no 3, pp. 7-12.
4. Kolling J., Scherer E., da Cunha A. Homocysteine induces
oxidative-nitrative stress in heart of rats: prevention by folic acid. Cardiovasc. Toxicol., 2011, vol. 11, no 1, pp. 67-73.
5. Tousoulis D., Bouras G., Antoniades C. The activation of
endotelhelin-1 pathway during methionine-induced homo-cysteinemia mediates endothelial dysfunction in hypertensive individuals. J. Hypertens., 2010, vol. 28, no 5, pp. 925-930.
6. Dayal S., Lentz S.R. Murine Models of Hyperhomocys-
teinemia and their Vascular Phenotypes. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 2008, vol. 28, no 9, pp. 1596-1605.
7. Berezovskii D.P., Mazhugin V.Yu., Kurayan K.M.,
Kurayan M.B., Krainova N.N., Khabarova O.V., Varavva T.A., Kornienko I.V. Eksperimental'naya model' umerennoi gipergomotsisteinemii dlya izucheniya patogeneza trom-boticheskikh oslozhnenii pri travme oporno-dvigatel'nogo apparata [The experimental model of moderate hyperhomo-cysteinemia for the study of the pathogenesis of thrombotic complications after trauma of the musculoskeletal system]. Kubanskii nauch. med. vestn., 2011, no 5, pp. 21-24.
8. Cathcart R., Schwiers E., Ames B.N. Detection of picomole
levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluo-rescein assay. Anal. Biochem., 1983, vol. 134, pp. 111-116.
9. Teselkin Yu.O., Babenkova I.V., Lyubitskii O.B., Klebanov
G.I., Vladimirov Yu.A. Opredelenie antioksidantnoi akti-vnosti plazmy krovi s pomoshch'yu sistemy gemoglobin -peroksid vodoroda - lyuminol [Determination of the anti-oxidant activity of blood plasma through a system hemoglobin - hydrogen peroxide - luminol]. Voprosy med. khimii, 1998, vol. 44, no 1, pp. 70-76.
10. Stal'naya I.D. [Method for determination of conjugated die-
ne unsaturated fatty acids]. Sovremennye metody v bio-khimii [Modern methods in biochemistry]. Moscow, 1977, pp. 63-64.
11. Stal'naya I.D., Gorishvili T.G. [Method for determination of
malondialdehyde via thiobarbituric acid]. Sovremennye metody v biokhimii [Modern methods in biochemistry]. Moscow, 1977, pp. 66-68.
12. Bidlack W.R., Tappel A.L. Fluorescent products of phos-
pholipids during lipid peroxidation. Lipids, 1973, vol. 68, no 4, pp. 203-209.
13. Bligh E.J., Dyer W.J. Rapid methods of total lipid extraction
and purification. Can. J. Biochem. Physiol., 1959, vol. 37, no 8, pp. 911-917.
14. Shacterle G.R., Pollack R.L. A simplified method for the
quantitative assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Biochem., 1973, vol. 51, pp. 654-655.
15. Sirota T.V. Novyi podkhod v issledovanii protsessa auto-
okisleniya adrenalina i ispol'zovaniya ego dlya izmereniya aktivnosti superoksiddismutazy [A new approach to the study of auto-oxidation process of adrenaline and use it to measure the activity of superoxide dismutase]. Voprosy med. khimii, 1999, no 3, pp. 14-15.
16. Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Maiorova I.G., Tokarev V.E.
Metod opredeleniya aktivnosti katalazy [The method for determining the activity of catalase]. Lab. delo, 1988, no 1, pp. 16-19.
17. Zgraham I.M., Daly L.E., Refsum H.M. Plasma
homocysteine as a risk factor for vascular disease. The Eur. Conc. Act. Rep. JAMA, 1997, vol. 277, pp. 1775-1781.
1 июня 2016 г.
