CC BY
12
тогенезе ГА и парентарельных гепатитов (ГВ и ГС), мы полагали, что при ГВ и, в меньшей степени, при ГС, в вовлечение нервной системы в патологический процесс, в принципе, свой "вклад" может вносить еще один фактор - высокое содержание в крови ЦИК, которые способны альтерировать клетки внепеченочного типа. Возможно, что ЦИК оказывают такое действие если не на защищенные гематоэнцефалическим барьером нейроны и глиальные клетки, то на эн-дотелиоциты мозговых капилляров, вызывая, таким образом, нарушения микроциркуляции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блюгер А.Ф., Новицкий И.Н. Вирусные гепатиты. Рига: Звай-гзне, 1988; 2. Мамедова Т.Ш. О патогенезе неврологических нарушений при заболеваниях печени. - В кн.: Акт. вопр. гематологии и трансфузиологии. Баку, 2002, с.199-201; 3. Мамедова Т.Ш., Гудратов Н.О. О некоторых показателях азотистого обмена при вирусных гепатитах, сопровождающихся неврологическими проявлениями. - В кн.: Мат-лы научно-практ. конфер., посвященной 70-ти летию А.Т.Аббасова. Баку, 1998, с.22-23; 4. Мамедова Т.Ш., Магалов Ш.И. Клинические особенности неврологических нарушений у больных острыми вирусными гепатитами. Биомедицина, 2003, N.4, с.15-18; 5. Мамедова Т.Ш., Худавердиева Н.М. Урсодезоксихолевая кислота в лечении больных вирусным гепатитом В, имевших неврологическую симптоматику. - Здоровье, 2003,
N.10, с.25-26; 6. Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей. М.: Гэотар-Медицина, 1999; 7. Dollberg S. Seizures in the course of hepatitis A. - Amer.J. Dis. Child., 1990, v.144, p.140-141; 8. Koff R. Viral hepatitis. N.Y.: J. Wiley Med. Publ., 1979; 9. Kuntz E., Kuntz H. Hepatology. Berlin: Springer, 2002, p.233-254; 10. Mamedova T., Gudratov N. Some indices of the xenobiotics detoxication system function at viral hepatitis patients with neurological manifestation. - Azerb.J.oncology, 1999, v.5, p.96.
SUMMARY
Several pathogenetic factors of neurological disorders development at patients with acute viral hepatitis A, B and C T.Mamedova
The paper contains results obtained in labora-torial examination of blood of patients with acute viral hepatitis A, B and C who had some neurological disorders. The author demonstrates existing the substantivial differences between some biochemical parameters and level of circulated immune complexes in the blood serums at patients with and without neurological disorders. These data indicate the difference between pathogenesis of hepatitis A, B and C.
Поступила 10.12.2003
Синтез меченых антител к гемагглютинину вируса гриппа
Э. М. Агаев
Азербайджанский медицинский университет, г. Баку
При производстве противовирусных препаратов, в частности, противогриппозных вакцин в ходе производственного цикла требуется проводить количественный анализ содержащегося в культуральной жидкости гемагглютинина (ГА) вируса гриппа на разных стадиях технологического цикла, что осуществляется в соответствии с "Методическими указаниями по проведению контроля противогриппозных препаратов", утвержденными еще в 1984 г. по методу одиночной реакции иммунодиффузии в агаровом геле. Метод обладает рядом существенных недостатков, а именно: низкими чувствительностью, объективностью и точностью, а также длительностью анализа, поэтому по мере совершенствования технологического процесса в связи с возрастающими требованиями к качеству продукции, возникает необходимость замены устаревших методов, и в т. ч. аналитических более совершенными новыми методами.
К настоящему времени разработано и широко используется большое количество методов выявления вирусспецифических агентов. Эти методы преимущественно основаны на введении в компоненты иммунного комплекса антиген-антитело различных меток, которые могут быть радиоактивными изотопами, ферментами или флуоресцирующими веществами. Получивший наибольшее распространение на первых этапах метод радиоимунологического анализа (РИА) к настоящему времени уже практически полностью вытеснен методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИфА) [1, 2] который, обладая преимуществами РИА (высокая чувствительность и специфичность), не имеет его недостатков - низкой стабильности и неудобств, создаваемых работой с радиоизотопами. Широко используемый в настоящее время метод ИфА также уже исчерпал свои возможности. К недостаткам ИфА можно отнести относительно
длительное время для проведения анализа, низкую точность и воспроизводимость измерений, высокую цену некоторых ферментов и их низкую стабильность, а также возможность перекрестных реакций.
В последнее время предложен ряд новых аналитических методов, основанных на выявлении специфических вирусных нуклеиновых кислот. Так, метод, основанный на ферментативной амплификации нуклеиновых кислот, позволяет снизить предел обнаружения вплоть по одной молекулы нуклеиновой кислоты (3). Однако, метод имеет серьезный недостаток - необходимость использования специфических прайме-ров, которые могут быть сконструированы методами генной инженерии, если известна последовательность нуклеотидов в выявляемой нуклеиновой кислоте. Другой современный аналитический метод, позволяющий обнаруживать вирусные антигены в пикограммовых количествах, основан на точечной гибридизации вирусных нуклеиновых кислот (4). Существенным недостатком этого метода является необходимость использования высокоочищенных препаратов комплементарных нуклеиновых кислот к радиоактивной метки, что снижает практическую ценность этого метода. Как ясно из вышеизложенного, перечисленные методы по ряду присущих им недостатков не могут быть использованы для анализа вирусных антигенов в производственных условиях. Наиболее удобным методом количественного определения ГА в производственных условиях является метод флюороиммунного анализа (ФИА), который широко используется в прикладной иммунохимии (5) и вирусологии. Для этого метода характерна высокая чувствительность, достигающая пикограммовых количеств вирусных агентов, хорошая специфичность и малая продолжительность анализа, а также объективность полученных результатов. Однако, ФИА так-
же не лишен некоторых недостатков, заключающихся в применении труднодоступных или дефицитных флюоресцентных меток и приборов для регистрации флюоресценции, что, однако, не является серьезным препятствием для использования этого метода в производственных условиях.
Метод количественного ФИА ГА в вируссо-держащих жидкостях, излагаемый в настоящей работе, разработан применительно к производственным условиям (6), Его главным отличительным моментом является использование в качестве флюоресцентной метки белка нового отечественного флюоресцентного реагента, селективно и ковалентно присоединяющегося к белку по сульфгидрильной группе и представляющего собой малеимидное производное 2-Н-1-бензопи-ран-2-она (МИМК), синтезированного в НПК ХТЛП СПбНИИВС (7). Он не обладает собственной флуоресценцией, однако, интенсивная флуоресценция возникает у иммунного комплекса антитело-МИМК после их конъюгирования.
Метод является вариантом твердофазного ФИА и основан на измерении флуоресценции иммунного комплекса, который включает в себя следующие основные стадии: адсорбцию антител на поверхности лунок полистиролового микропланшета, стадию специфического взаимодействия с участием меченого антитела, промежуточные стадии детекции флюоресценции и определения концентрации ГА по калибровочной кривой. В твердофазном ФИА детектируется фракция меченого соединения, связавшегося с иммуносорбентом, но для детекции вводится стадия десорбции меченого соединения с поверхности твердой фазы в объем. Это достигается за счет использования десорбирующего раствора.
Методика отбора проб. Количественное определение ГА в жидкостях, в частности, в сыворотках, вирусных концентратах и др. объектах
Рис. 1. Неспецифические реакции АТ к гемагглютинину вируса гриппа штамма Х-79 с гетерологичными вирусами, выявляемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа.
1 - разведение ампулы 1/4; 2 - разведение ампулы 1/40; 3 - разведение ампулы 1/400
Рис. 2. Неспецифические реакции АТ к гемагглютинину вируса гриппа штамма А/Свинья/31 с гетерологичными вирусами, выявляемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа.
1 - разведение ампулы 1/4; 2 - разведение ампулы 1/40; 3 - разведение ампулы 1/400
апробировано с использованием метода твердофазного ФИА, при этом концентрация ГА в указанных жидкостях не должна превышать 100мкг/мл, что объясняется сорбционной емкостью лунки микропланшета, поэтому требуется предвартельное определение концентрации белка по Лоури в исследуемых объектах и приготовление соответсвующих разведений с помощью забуференного физиологического раствора.
Получение иммуноглобулинов класса Э, меченых флуоресцентной меткой. Мечение иммуноглобулинов класса О против ГА вируса гриппа определенного штамма, выделенных из сыворотки крови кролика (титр в РТГА 1/320) с использованием метки МИМК, проводится по следующей схеме.
Раствор иммуноглобулинов известной концентрации в физиологическом растворе рН 7,2 -7,4 нейтрализуют добавлением 15% объема 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,5 (карбонантно-бикарбонантный 0,1 М буфер рН 9,5: растворяют 21,2 г Nа2CO3 в 1 л дистилиро-ванной воды - раствор А; растворяют 16,8 г NaHCO3 в 1 л дистилированной воды - раствор В. Смешивают 13 мл раствора А и 37 мл раствора Б и доводят дистиллированной водой до объема 100 мл). Затем белковый раствор в колбе объемом 50 мл помещают на магнитную мешалку и при постоянном легком перемешивании добавляют 1%-ный раствор МИМК в диметилфор-мамиде в количестве необходимом для получения концентрационного соотношения белок -метка, равного 1:10. Реакцию проводят в течении 18 час. при 4°С. После этого меченый белок очищают от избытка несвязавшейся метки, органических растворителей, избытка солей, перемеченных и поврежденных белковых частиц с помощью колоночной гельхроматографии на Sephadex О-25. Объем колонки 100 мл. Хрома-тографируемый раствор белка не должен превосходить по концентрации - 10 мг белка на I мл и по объему - 5 мл. Контроль за выходом фракции меченых антител осуществляют спектрофо-тометрически при длине волны 280 нм. Титр антител в РТГА после мечения не менее 1/128. Концентрацию очищенных меченых антител и молярное соотношение антитело - метка определяют спектрофотометрически при длинах волн поглощения белка и МИМК - на 280 и 330 нм, соответственно. Зависимость интенсивности флуоресценции меченых антител от их концентрации определяют на спектрофлюориметре "Hitachi-MРF 4А". Параметры измерений представлены ниже:
- длина волн возбуждения - 340 нм;
- длина волны эмиссии - 400 нм;
- ширина щели - 16 нм;
- чувствительность - 3 или 4.
Концентрацию ГА в вируссодержащих жид-
костях определяют с использованием твердофазного иммунофлуоресцентного метода на полистироловых планшетах. Метод заключается в том, что на планшет сорбируют антитела против ГА вируса гриппа определенного штамма, затем их конъюгируют с любым вируссодержа-щим гриппозным материалом, в котором нужно определить исследуемый антиген, а затем конъ-югируют с меченым антителом против того же антигена. Метод осуществляется тремя этапами:
1. В лунки планшета разливают по 0,2 мл иммуноглобулинов в карбонатно-бикорбонатном буфере, с концентрацией белка I мг/мл. Планшет инкубируют I час при 37°С, затем 18 час при 4°С. После инкубации лунки промывают не менее двух раз забуференным физиологическим раствором. Свободные центры сорбции блокируют, добавляя в лунки по 0,2 мл 0,3%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) с последующей инкубацией в течение I часа при 37°С. Затем каждую лунку промывают не менее 2-х раз забуференным физиологическим раствором.
2. В каждую лунку добавляют по 0,2 мл исследуемого вируссодержащего материала (вирусного концентрата, вакцины) и инкубируют 1 час при 37°С, после чего лунки промывают не менее 2-х раз забуференным физиологическим раствором.
3. В лунки добавляют по 0,2 мл раствора меченых антител в концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 1 час при 37°С, затем лунки промывают не менее 4-х раз забуференным физиологическим раствором для удаления несвязавшихся меченых антител. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл десорбирующего раствора -0,1 М раствора гидроокиси натрия для десорбции иммунного комплекса антиген-антитело. После легкого встряхивания планшета раствор из лунки переносят в кювету для измерений и доводят объем до 3 мл карбонатно-биакорбонат-ным буфером.
Интенсивность флуоресценции измеряют на спектрофлуориметре "Hitachi-МPF 4А" при чувствительности 3 или 4. Согласно полученным результатам определяют концентрацию ГА в исследуемых материалах.
РЕЗУЛЬТАТЫ. По измеренной интенсивности флуоресценции полученного раствора определяют количество ГА в образце.
Основные показатели метода:
1. продолжитительность эксперимента - рабочий день;
2. производительность по определению концентрации ГА - 96 проб/день;
3. минимально определяемая концентрация ГА в образце составляет менее 10 нг/мл.
В заключение следует отметить, что настоящий иммунофлюоресцентный метод количественного
определения гемагглютинина вируса гриппа по сравнению с существующим методом имеет высокую чувствительность определения, сокращает время анализа и повышает объективность полученных результатов, поэтому он рекомендуется для контроля за количественным содержанием ГА в вируссодержащих препаратах в производственных условиях на предприятии по производству бакпрепаратов медицинской промышленности России. Данный метод также пригоден для диагностики вируса гриппа, как самостоятельно, так и в сочетании с методом иммуноглобулина, так как меченые антитела проявляют достаточно высокую специфичность в отношении к антигену вируса гриппа - гемагглютинину (рис. 1 и 2).
ЛИТЕРАТУРА
1. Чард Т. Радиоиммунологические методы. - М.: Мир - 1981, 246 с. 2. Веселов С.Ю., Синяков Н.С., Харитоненков И.Г. и др. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественной инди-
кации гемагглютинина вируса гриппа в биологических образцах. -Вопросы вирусол, 1985, N.6, c.672-679; 3. Carman W.T. Kidd A.A. An assessment of optimal conditions for amplification of HIV CINA using Thermus aguaticus polimerase. - J. of Viral Meth., 1989, v.23, p.277-290; 4. Norval M., Binghom R.W. Advances in the use of nucleic acid probes in diagnosis of viral diseases of man. - Arch. Virol., 1987, v.97, p.151-165; 5. Кубица Ю.Ф. Иммунофлуресценция. - M.: Медицина, 1967, 255 с.; 6. Крашенюк А.И., Филиппова М.Л., Абышеа А.З. и др. Способ очистки вирусной суспензии от надмолекулярный образований. - Ав.св. №1632039 (1988); 7. Абышев А.З., Венедиктова Н.А., Нежинская Г.И. и др. Сополимер N - ви-нилпирролидона и 7-(2-малеимидэтокси) - 2-Н-1-бензопиран-2-она в качестве иммуностимулятора. - Ав. св. №1702665 (1990).
SUMMARY
Synthesis of labelled antibodies to influenza virus hemagglutinin E.Agayev
The article contains data concerning methotds of immunoglobulin G labelled with fluorochrome to influenza virus hemagglutinin for it's quantitation with the help of the fluorescent-immune-assay.
Поступила 06.11.2003
