CC BY
10
Гетеровир-ГА - новый иммунобиологический препарат для диагностики и количественной оценки вирусных антигенов
А. 3. Абышев, Э. М. Агаев, А. А. Абдулла-заде
Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток, РФ Азербайджанский медицинский университет, г. Баку
ВВЕДЕНИЕ. При производстве противовирусных препаратов, в частности, противогриппозных вакцин, в ходе производственного цикла требуется проводить количественный анализ содержащегося в культуральной жидкости гемагглюти-нина вируса гриппа на разных стадиях технологического цикла, что осуществляется в соответствии с "Методическими указаниями по проведению контроля противогриппозных препаратов", утвержденными еще в 1984 г., по методу одиночной реакции иммунодиффузии в агаровом геле. Метод обладает рядом существенных недостатков, а именно: низкими чувствительностью, объективностью и точностью, а также длительностью анализа, поэтому, по мере совершенствования технологического процесса, в связи с возрастающими требованиями к качеству продукции, возникает необходимость замены устаревших методов, и в т. ч. аналитических, более совершенными новыми методами.
К настоящему времени разработано и широко используется большое количество методов выявления вирусоспецифических агентов. Эти методы, преимущественно, основаны на введении в компоненты иммунного комплекса антиген-антитело различных меток, которые могут быть радиоактивными изотопами, ферментами или флуоресцирующими веществами. Получивший наибольшее распространение на первых этапах метод радиоимунологического анализа (РИА) к настоящему времени уже практически полностью вытеснен методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [4, 7] который, обладая преимуществами РИА (высокая чувствительность и специфичность), не имеет его недостатков - низкой стабильности и неудобств, создаваемых работой с радиоизотопами. Широко используемый в настоящее время метод ИФА также уже исчерпал свои возможности. К недостаткам ИФА можно отнести относительно длительное время для проведения анализа, низкую точность и воспроизводимость измерений, высокую цену некоторых ферментов и их низкую стабильность, а также возможность перекрестных реакций.
В последнее время предложен ряд новых аналитических методов, основанных на выявлении специфических вирусных нуклеиновых кислот. Так метод, основанный на ферментативной амплификации нуклеиновых кислот, позволяет снизить предел обнаружения вплоть по одной молекулы нуклеиновой кислоты (8). Однако, метод имеет серьезный недостаток - необходимость использования специфических прайме-ров, которые могут быть сконструированы методами генной инженерии, если известна последовательность нуклеотидов в выявляемой нуклеиновой кислоте. Другой современный аналитический метод, позволяющий обнаруживать вирусные антигены в пикограммовых количествах, основан на точечной гибридизации вирусных нуклеиновых кислот (9). Существенным недостатком этого метода является необходимость использования высокоочищенных препаратов комплементарных нуклеиновых кислот к радиоактивной метки, что снижает практическую ценность этого метода. Как ясно из вышеизложенного, перечисленные методы по ряду присущих им недостатков не могут быть использованы для анализа вирусных антигенов в производственных условиях. Наиболее удобным методом количественного определения гемагглютинина (ГА) в производственных условиях является метод флуо-роимунного анализа (ФИА), который широко используется в прикладной иммунохимии (6) и вирусологии. Для этого метода характерна высокая чувствительность, достигающая пикограм-мовых количеств вирусных агентов, хорошая специфичность и малая продолжительность анализа, а также объективность полученных результатов. Однако, ФИА также не лишен некоторых недостатков, заключающихся в применении труднодоступных или дефицитных флуоресцентных меток и приборов для регистрации флуоресценции, что, однако, не является серьезным препятствием для использования этого метода в производственных условиях.
Метод количественного ФИА ГА в вируссо-держащих жидкостях, излагаемый в настоящей работе, разработан применительно к производ-
ственным условиям (5). Его главным отличительным моментом является использование в качестве флуоресцентной метки белка нового отечественного флуоресцентного реагента, селективно и ковалентно присоединяющегося к белку по сульфгидрильной группе и представляющего собой малеимидное производное 2Н-1-бензопи-ран-2-она (МИМК), синтезированного в НПК ХТЛП СПбНИИВС (3). Он не обладает собственной флуоресценцией, однако, интенсивная флуоресценция возникает у иммунного комплекса антитело-МИМК (Гетеровир-ГА) после их конъю-гирования (1).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Предлогае-мый метод является вариантом твердофазного ФИА и основан на измерении флуоресценции иммунного комплекса, который включает в себя следующие основные стадии: адсорбцию антител на поверхности лунок полистиролового микропланшета, стадию специфического взаимодействия с участием меченого антитела, промежуточные стадии детекции флуоресценции и определения концентрации ГА по калибровочной кривой. В твердофазном ФИА детектируется фракция меченого соединения, связавшегося с иммуносорбентом, но для детекции вводится стадия десорбции меченого соединения с поверхности твердой фазы в объем. Это достигается за счет использования десорбирующего раствора.
ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА - ГЕТЕРОВИР-ГА. Антитела получают из очищенных сывороток крови кроликов, иммунизированных ГА вируса гриппа, конъюгирован-ным с синтетическим иммуномодулятором - им-мунокором или его аналогами по схеме, разработанной нами ранее (1, 3).
Мечение антител (иммуноглобулинов класса О) против ГА вируса гриппа определенного штамма, с использованием меток МИМК или МИ-ЭК (2) проводится по следующей схеме.
Раствор иммуноглобулинов известной концентрации в физиологическом растворе рН 7,2 -7,4 нейтрализуют добавлением 15% объема 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,5 (Карбонантно-бикарбонантный 0,1 М буфер рН 9,5: растворяют 21,2 г Nа2COз в 1 л дистилиро-ванной воды - раствор А; растворяют 16,8 г NaHCOз в 1 л дистилированной воды - раствор В. Смешивают 13 мл раствора А и 37 мл раствора Б и доводят дистиллированной водой до объема 100 мл). Затем белковый раствор в колбе объемом 50 мл помещают на магнитную мешалку и при постоянном легком перемешивании добавляют 1%-ный раствор МИМК в диметилфор-мамиде в количестве, необходимом для получения концентрационного соотношения белок -метка равного 1:10. Реакцию проводят в течении 18 час. при 4°С. После этого меченый белок очи-
щают от избытка не связавшейся метки, органических растворителей, избытка солей, перемеченных и поврежденных белковых частиц с помощью колоночной гель-хроматографии на Sephadex О-25. Объем колонки 100 мл. Хрома-тографируемый раствор белка не должен превосходить по концентрации - 10 мг белка на I мл и по объему - 5 мл. Контроль за выходом фракции меченых антител осуществляют спектрофо-тометрически при длине волны 280 нм. Титр антител в РТГА после мечения не менее 1/128. Концентрацию очищенных меченных антител и молярное соотношение антитело - метка определяют спектрофотометрически при длинах волн поглощения белка и МИМК - на 28О и 330 нм, соответственно.
Зависимость интенсивности флуоресценции меченных антител от их концентрации определяют на спектрофлуориметре "Hitachi-MРF - 4А". Параметры измерений представлены ниже: длина волн возбуждения - 340 нм; длина волны эмиссии - 400 нм; ширина щели - 16 нм; чувствительность - 3 или 4.
Меченные антитела разливают в ампулы по 1 мл и лиофильно высушивают и хранят при температуре не выше 10°С. Срок годности препарата устанавлен по определению специфической активности в РТГА и его флуоресценции на протяжении 16-ти месяцев (табл. 1).
При необходимости содержимое ампулы растворяют в 1,0 мл дистиллированной воды и используют для иммунофлуоресцентного определения ГА в биологических средах. Меченные антитела, полученные по данной технологии, обладают активностью в РТГА с гомологичным вирусом не менее 1:64 и с гетерологичными вирусами не более 1:10, флуоресцируют в Уф-области спектра позволяют определять ГА до 10 нг/мл.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ. Количественное определение ГА в вируссодержащих жидкостях определяют с использованием твердофазного иммунофлуоресцентного метода на полистироловых планшетах. При этом установлено, что концентрация ГА в указанных жидкостях не должна превышать 100мкг/мл, что объясняется сорбци-онной емкостью лунки микропланшета, поэтому требуется предвартельное определение концентрации белка по Лоури в исследуемых объектах и приготовление соответсвующих разведений с помощью забуференного физиологического раствора.
Данный метод заключается в том, что на планшет сорбируют антитела против ГА вируса гриппа определенного штамма, затем их конъю-гируют с любым вируссодержащим гриппозным материалом, в котором нужно определить исследуемый антиген, а затем конъюгируют с меченным антителом против того же антигена т. е.
Таблица 1. Определение срока годности меченных антител к ГА вируса гриппа
Сероподтип Время наблюдения, мес. Специфический титр в РТГА ^ возб., НМ ^•эмис,, нм
4 1:64 340 400
H3N2 8 - « - - « - - « -
12 - « - - «— - «—
16 - « - - « - - « -
HSwN1 4 1:64 340 400
8 - « - - « - - « -
12 - « - - « - - « -
16 - « - - « - - « -
гетеровиром-ГА. Метод осуществляется тремя этапами:
1) В лунки планшета разливают по 0,2 мл иммуноглобулинов в карбонатно-бикорбонатном буфере, с концентрацией белка I мг/мл. Планшет инкубируют I час при 37°С, затем 18 час при 4°С. После инкубации лунки промывают не менее двух раз забуференным физиологическим раствором. Свободные центры сорбции блокируют, добавляя в лунки по 0,2 мл 0,3%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) с последующей инкубацией в течение I часа при 37°С. Затем каждую лунку промывают не менее 2-х раз забуференным физиологическим раствором.
2) В каждую лунку добавляют по 0,2 мл исследуемого вируссодержащего материала (вирусного концентрата, вакцины) и инкубируют 1 час при 37°С, после чего лунки промывают не менее 2-х раз забуференным физиологическим раствором.
3) В лунки добавляют по 0,2 мл раствора меченных антител в концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 1 час при 37°С, затем лунки промывают не менее 4-х раз забуференным физиологическим раствором для удаления несвязавшихся меченых антител. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл десорбирующего раствора -0,1 М раствора гидроокиси натрия для десорбции иммунного комплекса антиген-антитело. После легкого встряхивания планшета раствор из лунки переносят в кювету для измерений и доводят объем до 3 мл карбонатно-биакорбонат-
ным буфером.
Интенсивность флуоресценции измеряют на спектрофлуориметре "Hitachi - MPF 4A" при чувствительности 3 или 4. Согласно полученным результатам определяют концентрацию ГА в исследуемых материалах.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА. По измеренной интенсивности флуоресценции полученного раствора определяют количество ГА в образце.
Пример расчета. Экспериментально определено, что интенсивность флуоресценции образца на шкале чувствительности "3" прибора -1фл. = 16 (относ. ед.), lg 1 фл.=1,20, что соответствует lg С=1,48, т.е. концентрация ГА составляет С= 240 мкг/мл.
Основные показатели метода:
1. Продолжительность эксперимента - рабочий день.
2. Производительность по определению концентрации ГА - 96 проб/день.
3. Минимально определяемая концентрация ГА в образце составляет менее 10 нг/мл.
Следует отметить, что настоящий иммуноф-луоресцентный метод количественного определения гемагглютинина вируса гриппа по сравнению с существующим методом имеет высокую чувствительность определения (табл. 2), сокращает время анализа и повышает объективность полученных результатов, поэтому он прежде всего рекомендуется для контроля за количественным содержанием ГА в вируссодержащих препаратах в производственных условиях на
Таблица 2. Параметры флуоресценции и пределы детекции конъюгатов иммуноглобулина (1дЭ) с
некоторыми флуоресцентными реагентами
Конъюгаты Параметры флуоресценции, нм Смин
^ех ^ет Д нМ мкг/мл
Флуоресцеин - IgG 491 517 26,0 0,25 0,04
М-(3-пиренил)-мапеинимид - IgG 340 392 52,0 12,5 2,0
МИЭК-lgG 395 475 80,0 0,01 0,002
МИМК-lgG 340 400 60,0 0,06 0,01
Примечания: IgG - иммуноглобулин G, 1 нМ - 0,16 мкг/мл; СМИн. - предел детекции; АХ - сдвиг Стокса
предприятии по производству бактерийных препаратов медицинской промышленности России.
При этом следует отметить, что МИЭК обладает очень высокой собственной флуоресценцией, тогда как МИМК собственной флуоресценцией не обладает, однако, интенсивная флуоресценция возникает у иммунного комплекса антитело-МИМК после их конъюгирования. Результаты сравнительного изучения этих реагентов с известными аналогами представлены в таблице 2.
Разработанный нами метод также пригоден для диагностики не только вируса гриппа (с использованием препарата гетеровир-ГА), но и для других вирусных антигенов (например, гепатита В - с применением препарата гетеровир-HBs и др.), как самостоятельно, так и в сочетании с методом иммуноглобулина G, так как меченные антитела проявляют достаточно высокую специфичность в отношении к антигенам различных вирусов.
Таким образом, как видно из данных, представленных в настоящей работе, в итоге проведенных теоретических и прикладных исследований нами впервые разработан достаточно высокоэффективный меченный иммуноген - гетеро-вир-ГА (IgG-МИМК), необходимый для количественной оценки содержания ГА в биологических средах и объективной диагностики инфекций, вызванных различными штаммами вируса гриппа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абышев А.З., Агаев Э.М., Абдулла-заде A.A. Конъюгирован-ные антигены на основе синтетических иммуномодуляторов. - В кн.: Материалы международной научно-практической конферен-
ции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии. 2004, с.325-329; 2. Абышев А.З., Агаев Э.М., Абдулла-заде А.А. Синтез меченных антител к гемагглютинину вируса гриппа. - В кн.: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии. 2004, с.209-213; 3. Абышев А.З., Венедиктова Н.А., Нежинская Г.И. и др. Сополимер N - винилпирролидона и 7-(2-малеимидэтокси) - 2-Н-1-бензопиран-2-она в качестве иммуностимулятора. - Ав.с. №1702665 (1990); 4. Веселов С.Ю., Синяков Н.С., Харитоненков И.Г. и др. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественной индикации гемагглютинина вируса гриппа в биологических образцах. - Вопросы вирусологии, 1985, N.6, c.672-679; 5. Крашенюк А.И., Филиппова М.Л., Абы-шеа А.З. и др. Способ очистки вирусной суспензии от надмолекулярных образований. - Ав.с. №1632039 (1988); 6. Кубица Ю.Ф. Иммунофлуресценция. - М.:Медицина, 1967, 255 с.; 7. Чард Т. Радиоиммунологические методы. - М.: Мир, 1981, 246 с.; 8. Carman W.T. Kidd A.A. An assessment of optimal conditions for amplification of HIV CINA using Thermus aguaticus polimerase. - J. of Viral Meth., 1989, v.23, p.277-290; 9. Norval M., Binghom R.W. Advances in the use of nucleic acid probes in diagnosis of viral diseases of man. - Arch. Virol., 1987, v.97, p.151-165.
SUMMARY
Heterovir-HA - new immunobiological preparation for diagnostic and quantitative estimation of viral antigens A.Abishev, E.Agayev, A.Abdulla-zadeh
In the presented article authors shows the results of experimental study on synthesis of new immunobiological preparation.
As a result of this theoretical and practical research was originated new immunobiological preparation (Heterovir-HA). This preparation is high efficacy marked immunogen for quantitative estimation of hemagglutinin in biological mediums and can be used for diagnostics of infections, caused by different types of influenza virus.
Поступила 14.03.2006
