CC BY
38
МИКРОБИОЛОГИЯ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
УДК 578.57.015.3
ВЛИЯНИЕ СЕРОКОНВЕРСИИ НА ИЗМЕНЕНИЯ В УЧАСТКЕ HVR1 БЕЛКА Е2 ВИРУСА ГЕПАТИТА С
© 2012 г. И.В. Астраханцева 1, Д. Кампо 2 В.В. Новиков 1, Ю.Е. Худяков 2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Центр по контролю и предотвращению заболеваний, г. Атланта, США
irenastr@rambler.ru
Поступила в редакцию 10.05.2012
Влияние сероконверсии на изменения в участке HVR1 вируса гепатита С было исследовано в изо-лятах восьми пациентов. Оценены гетерогенность вирусной популяции, частота аминокислотных замен и влияние положительного селекционного давления на вирусную популяцию. Для определения специфического анти-НУШ IgG ответа были использованы пептиды вариантов НУШ, выявленных в изолятах пациентов.
Ключевые слова: вирусный гепатит С, квазивиды, НУБ1, сероконверсия, дивергенция.
Введение
Около 170 миллионов человек в мире больны вирусным гепатитом С, который может быть причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Возбудитель этого широко распространенного заболевания - вирус гепатита С (ВГС) - передается парэнтерально и на сегодняшний день является основной причиной посттрансфузионных гепатитов [1].
ВГС представляет собой имеющий оболочку РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Flaviviridae [2]. РНК вируса гепатита С остается на детектируемом уровне в крови и печени на протяжении более чем 20 лет у 85% инфицированных пациентов [3]. Острая инфекция у большинства пациентов протекает бессимптомно, только около 25-30% пациентов с острым гепатитом С спонтанно элиминирует вирус
[4]. Если вирус персистирует в организме более чем 6 месяцев, то заболевание считается перешедшим в хроническую форму.
На всех стадиях заболевания вирус существует как гетерогенная популяция различных, но близкородственных вирусных частиц, относящихся к так называемым квазивидам [5]. Гетерогенность популяции способствует быстрой селекции мутантов, бо-
лее приспособленных к иммунному ответу организма хозяина и формированию хронической инфекции [6]. Наиболее высокая вариабельность характерна для региона, называемого НУБ1 (гипервариабельный участок 1) и локализованного на N-конце белка Е2
[5]. Данный регион содержит 27 аминокислот и формирует главный поверхностный антиген вируса, являющийся также доминантным эпитопом для нейтрализующих антител [7, 8]. Высокая вариабельность
ЫУЯ1-последовательностей коррелирует с появлением мутантов, позволяющих вирусу избегать действие иммунного ответа, и играет важную роль в поддержании перси-стенции вируса во время хронической инфекции [9, 10]. Кроме того, уровень и природа замен в НУБ1 в период ранней стадии инфекции коррелируют с исходом заболевания [11]. Считается, что вариабельность нейтрализующих эпитопов является одной из причин, осложняющих создание вакцины против вирусного гепатита С. То есть изменения в участке НУБ1 в течение серокон-версии являются важными для понимания развития ВГС-инфекции.
Цель работы - изучение влияния сероконверсии на изменения в участке ЫУЯ1 белка Е2 вируса гепатита С.
Материалы и методы
В работе использованы 8 коммерческих анти-ВГС сероконверсионных панелей, полученных от компании Zeptometrix (Buffalo, США) [кат. №: 6212, 6213, 6214, 6215, 6228 9041, 9047, 9058 - Z1-Z8 соответственно]. Каждая панель представляла собой образцы плазмы крови, взятые через определенные интервалы времени у доноров, у которых наблюдалась сероконверсия анти-ВГС антител. От каждой панели было отобрано по два образца: один образец до начала сероконверсии в период определяемой виремии и один после появления анти-ВГС антител (табл.
1). Синтезированы 70 пептидов, длиной в 31 аминокислоту, включающих в себя последовательности, соответствующие гипервариабельным участкам 1, принадлежащим разным вариантам квазивидов, выявленным в изолятах восьми сероконверсионных панелей (GenBank JQ 977754-JQ 978218). Пептиды, соответствующие регионам HVR1, были протестированы на реактивность с антителами класса IgG. Для контроля неспецифического связывания использовали 31 не-ВГС пептид.
Выделение нуклеиновых кислот из образцов плазмы крови было произведено с использованием аппарата Roche MagNa Pure LC и набора MagNa Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Diagnostic, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. кДНК была получена обратной транскрипцией с помощью универсального и специфичного праймеров, как описано ранее [12]. Полученная кДНК использовалась для дальнейшей амплификации.
Клонирование участков HVR1 проводили с помощью ПЦР с применением ограниченных разведений и гнездовой RT-ПЦР. Амплификацию проводили, используя разведение матрицы, при котором концентрация ДНК настолько мала, что часть образцов для анализа (около 50%) не содержит матричной молекулы и таким образом не производит ПЦР-продукта [13]. Условия ПЦР были оптимизированы посредством изменений концентрации праймеров и условий циклов ПЦР. Гнездовая ПЦР с «горячим стартом» проводилась в конечном объеме 20 мкл с использованием набора Qaunta Perfecta SYBR Fastmix Kit (Quanta Biosciences, Gaithersburg, США). Для первого раунда амплификации HVR1 использовались следующие праймеры: F1-TGGCTTGGGATATGATGATGAACT и R1-GCAGTCCTGTTGATGTGCCA. Затем проводили второй раунд ПЦР с использованием праймеров F2 -GGAT AT GAT GAT GAACT GGT и R2-
ATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT. Для проведения каждой реакции использовали по
0.75 мкМ праймера и реагентов набора Quanta SYBR GreenlMix. После стадии преинкубации при 95оС в течение 5 минут (активация Fast Start полимеразы) проводили 40 циклов амплифика-ци. Каждый цикл включал денатурацию (95оС, 10 сек), отжиг (58оС, 20 сек) с одним измерением флуоресценции в конце этой фазы и элонгацию (72оС, 14 сек). После амплификации проводили анализ кривой плавления, для чего температуру поднимали до 95оС на 1 секунду, затем выдерживали образец при 80оС в течение 60 секунд и при 96оС в течение 15 секунд, затем следовала фаза охлаждения до 40оС. Кривая плавления была получена с помощью программного обеспечения LightCycler.
Ампликоны секвенировали с использованием набора BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, США) и автоматического секвена-тора 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полученные последовательности выравнивали относительно друг друга и из них был выделен участок в 87 нуклеотидных оснований, соответствующий HVR1.
Антитела против HVR1 определяли с помощью иммуноферментного метода. Пептиды в концентрации 10 мкг/мл, разведенные в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСР-буфер), сорбировали в лунки 324-луночного планшетов (Corning Incorporated Costar, Нью-Йорк, США), которые инкубировали в течение 16 часов при температуре 4°С. После инкубации планшеты промывали пять раз ФСР-буфе-ром с 0.5% Твина-20. Разведенная в 500 раз плазма крови была добавлена в лунки планшета и инкубирована в течение 90 мин при температуре 37°С. После промывки добавляли мышиные антитела против IgG человека, меченые пероксидазой корня хрена (Сорбент-Сервис, Москва, Россия). Реакцию проявляли с помощью раствора тераметилбензидина. Оптическую плотность определяли при длине волны 450-605 нм.
При статистической обработке результатов предварительный анализ HVR1-последовательностей был произведен с помощью программного обеспечения Lasergene DNA & Protein analysis software (Version 8.0, DNASTAR Inc., Madison, WI). Для определения положительного давления эволюции использовали метод фиксированных эффектов и расчетный метод SLAC (Single-Likelihood Ancestor Counting) [14]. Для оценки степени гетерогенности квазивидов в каждом изоляте была рассчитана дивергенция методом Nei и Li [15], также известным как
анализ молекулярных дисперсий (AMOVA). Расчеты производились с помощью пакета программ ARLEQUIN [16]. С целью визуализации аминокислотных изменений между квазивидами внутри пациента были построены филогенетические деревья. Для этого был применен метод объединения соседей (MJN) с помощью пакета программ NETWORK 4.0 [17].
Результаты и их обсуждение
У восьми пациентов после развития серо-конверсии титр вируса упал в среднем на 0.49± ±19 log (табл. 1), что говорит об отрицательном влиянии сероконверсии на популяцию вируса. Для исследования влияния, оказываемого на участок HVR1 в процессе сероконверсии, мы проанализировали дивергенцию вирусной популяции, изменения в частоте встречаемости аминокислотных замен и действие положительного отбора.
Нами были получены 464 клона HVRl-последовательности от 16 исследованных образцов плазмы крови. Число амплифицированных клонов зависело от титра вируса в образце и в среднем составляло 29±9. Нуклеотидные последовательности HVR1 были транслированы в аминокислотные и проанализированы. До появления антител большинство квазивидов, клонированных из одного образца, имело идентичную аминокислотную последовательность, т.е. гетерогенность участка HVR1 была невысока. В среднем такая доминантная последовательность обнаруживалась у 79.3% общего числа полученных квазивидов для каждого изолята. После появления анти-ВГС антител у двух из 8 проанализированных пациентов (Z2, Z8), доминантная до сероконверсии последовательность HVR1 не была обнаружена (рисунок). Обнаруженные изменения в структуре популяций последовательностей HVR1 у двух пациентов после появления анти-ВГС антител свидетель-
ствуют об отрицательном влиянии иммунного ответа на популяцию вирусных частиц. Похожие результаты были описаны Farci и соавторами, которые обнаружили корреляцию между дивергенцией HVR1 белка Е2 квазивидов на начальной стадии инфекции и исходом заболевания [11]. Это также может являться доказательством описанного Bull и соавторами эффекта так называемого «бутылочного горлышка» ВГС-инфекции в момент появления анти-ВГС антител [18]. Однако в изолятах 6 пациентов (Z1, Z3-7) после появления антител доминантная последовательность HVR1 составляла 75. 9% от общего числа полученных квазивидов, т.е. дивергенция аминокислотных последовательностей HVR1 не изменилась.
В поиске доказательств адаптивных изменений под воздействием иммунного ответа, мы исследовали воздействие положительного эволюционного отбора. Было обнаружено, что у трех пациентов (Z3, 4, 7) одна или две аминокислотные позиции (8, 14, 16 и 21) находились под воздействием положительного отбора (табл.
2). Также был проведен анализ молекулярных дисперсий для выявления процента вариаций между участками HVR1 популяций квазивидов в изолятах до и после сероконверсии. Мы обнаружили статистически значимые вариации у 4 пациентов (Z2, Z4, Z7, Z8), значения вариаций варьировались от 9.4 до 80.4% (табл. 2). Были оценены вариации по индивидуальным аминокислотным позициям региона HVR1. Достоверные вариации были найдены в позициях 12 и
14. Позиции 12 и 14 принадлежат к антигенному эпитопу [6]. Это предполагает, что аминокислотные вариации в этих позициях могут происходить под воздействием отбора, связанного с влиянием иммунного ответа.
Участок HVR1 белка Е2 является мишенью для антител. Антитела против HVR1 были найдены in vivo, антитела с нейтрализующей активностью имеют тенденцию связываться с
Таблица 1
Характеристика вируса гепатита С в тестироваииых образцах плазмы крови
№ Источник Генотип Вирусная нагрузка (копий/мл) Время между получением образцов (сутки)
до появления антител после появления антител
Z1 Zepromitrix Corp. (6212) 1 1881000 466000 53
Z2 Zepromitrix Corp. (6213) 1a 20700000 12820000 18
Z3 Zepromitrix Corp. (6214) 1 11200000 2939000 28
Z4 Zepromitrix Corp. (6215) 1a 120000000 48140000 20
Z5 Zepromitrix Corp. (6228) 1a 2480000 396000 31
Z6 Zepromitrix Corp. (9041) 1a 120000000 66270000 33
Z7 Zepromitrix Corp. (9047) 1a 81760000 22770000 39
Z8 Zepromitrix Corp. (9058) 1a 85340000 29460000 81
Рис. Филогенетические деревья, построенные методом объединения соседей (МІМ). Белым цветом представлены квазивиды до появления антител, черным - после их появления
С-концом НУК1, тогда как антитела, не имеющие такой активности, обычно связываются с К-концом участка НУ^ [19]. По последним данным, выход вирусного генома в цитозоль требует ^Н-зависимого слияния вирусной и клеточных мембран. Предполагают, что антите-
ла хозяина против НУЮ могут подавлять процесс слияния и таким образом блокировать вирусную инфекционность [19].
Среди полученных клонов НУ^1 70 имели уникальную аминокислотную последовательность, на основе которых были синтезированы
Таблица 2
Характеристика последовательностей HVR1
Образец Количество клонов Аминокислотная дивергенция Fst, (%) Fst, значение p Аминокислотные позиции, находящиеся под воздействием положительного отбора
до появления антител после появления антител до появления антител после появления антител
Z1 20 27 0,03 0,01 0.500 0.42S -
Z2 33 27 0,09 0,07 S0.40 0.000 -
Z3 43 42 0,03 0,03 1.260 0.171 21
Z4 27 34 0,09 0,03 10.05 0.017 14
Z5 22 24 0,01 0,01 1.610 0.350 -
Z6 27 37 0,07 0,03 1.770 0.100 -
Z7 44 26 0,11 0,07 9.400 0.007 S, 16
ZS 25 6 0,01 0,04 76.03 0.000 -
НУБ1 пептиды. Эти пептиды были протестированы против сывороток крови восьми пациентов с целью обнаружения антител против ИУЯ1. Антитела, присутствующие в плазме 3 доноров ^3^5) как до, так и после серокон-версии не реагировали ни с одним из 70 пептидов. В образцах плазмы крови доноров Z2 и Z8, отобранных после сероконверсии, детектировались антитела против главной (доминантной) последовательности НУБ1 изолята этого же донора, отобранного до сероконверсии. Это свидетельствует о влиянии иммунного ответа на структуру квазивидов, так как данная последовательность НУБ1 не детектировалась в изо-ляте, отобранном после сероконверсии. Кроссреактивности с другими пептидами не наблюдалось. У доноров Z1, Z6 и Z7 были обнаружены анти-НУБ1 IgG в изолятах как до, так и после сероконверсии. У всех детектировались IgG антитела против главной НУБ1-последовательности, присутствующей как до, так и после сероконверсии. Кроме того, у данных доноров присутствовали анти-НУБ1 IgG против минорных последовательностей, а изоляты, отобранные после сероконверсии, были кроссреактивны с пептидами, соответствующими последовательностям НУБ1, принадлежащим другим донорам.
Известно, что при ВГС-инфекции постоянно образуются новые последовательности НУБ1, которые слабо реагируют с имеющимися в этот момент в организме антителами [20]. Обычно доминируют последовательности, устойчивые к нейтрализации анти-НУБ1 антителами. Так как анти-НУБ1 антитела плазмы крови пациентов с хроническим гепатитом С могут нейтрализовать различные последовательности белков Е1 и Е2, то доминирующие при хронической ВГС-инфекции последовательности предположи-
тельно занимают такую нишу, в которой их сродство с нейтрализующими антителами невелико. То есть последовательности, чувствительные к нейтрализующим антителам, удаляются из популяции квазивидов [20].
В представленной работе сероконверсия ан-ти-ВГС антител не оказывала должного эффекта на изменения в сегменте HVR1 изолятов вируса. Отсутствие значимых изменений может объясняться: 1 - коротким временным промежутком между получением образцов плазмы крови от одного и того же пациента, изменения могут появиться позже [21]; 2 - отсутствием влияния сероконверсии на вирусную популяцию. В то же время в тех случаях, когда изменения все же происходили, они приводили к значительным изменениям в структуре популяции квазивидов вируса.
Список литературы
1. Alter M. Epidemiology of hepatitis C virus infection // World J. Gastroenterol. 2007. V. 13. № 17. P. 2436-2441.
2. Choo Q., Kuo G., Weiner A., Overby L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a bloodborne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. 1989. V. 244. P. 359-362.
3. Alberti A., Chemello L., Benvegnu L. Natural history of hepatitis C // J. Hepatol. 1999. V. 31. Supp1. P. 17-24.
4. Maheshawari A., Ray S., Thuluvath P.J. Acute hepatitis C // Lancet. 2008. V. 372. № 9635. P. 321-332.
5. Afonso A.M., Jiang J., Penin F., Tareau G., et al. Nonrandom diatribution of hepatitis C virus quasispecies in plasma and peripheral blood mononuclear cell subsets // J. Virol. 1999. V. 73. № 11. P. 9213-9222.
6. Penin F., Combet C., Germanidis G., Frainais P., et al. Conservation of the conformation and positive charges of hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein
hypervariable region 1 points to a role in cell attachment // J. Virol. 2001. V. 75. № 12. P. 5703-5710.
7. Farci P., Shimoda A., Wong D., Cabezon T., et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein // PNAS. 1996. V. 93. № 26. P. 15394-15399.
8. Shimizu Y.K., Igarashi H., Kanematu T., Fujiwara K., et al. Sequence analysis of the hepatitis C virus genome recovered from serum, liver, and peripheral blood mononuclear cells of infected chimpanzees // J. Virol. 1997. V. 71. № 8. P. 5769-5773.
9. Erickson A.L., Kimura Y., Igarashi S., Eichelberger J., et al. The outcome of hepatitis C virus infection is predicted by escape mutations in epitopes targeted by cytotoxic T lymphocytes // Immunity. 2001. V. 15. № 6. P. 883-895.
10. McAllister J., Casino C., Davidson F., Power J., et al. Long-term evolution of the hypervariable region of hepatitis C virus in a common-source-infected cohort // J. Virol. 1998. V. 72. № 6. P. 4893-4905.
11. Farci P., Shimoda A., Coiana A., Diaz G., et al. The outcome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the viral quasispecies // Science. 2000. V. 288. № 5464. P. 339-344.
12. Ramachandran S., Xia G.L., Ganova-Raeva L.M., Nainan O.V., Khudyakov Y. End-point limiting-dilution real-time PCR assay for evaluation of hepatitis C virus quasispecies in serum: performance under optimal and suboptimal conditions // J. Virol. Methods. 2008. V. 151. № 2. P. 217-224.
13. Kraytsberg Y., Khrapko K. Single-molecule PCR: an artifact-free PCR approach for the analysis of
somatic mutations // Exp. Rev. Mol. Diagn. 2005. V. 5. № 5. P. 809-815.
14. Kosakovsky S., Frost S. Datamonkey: rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments // Bioinformatics. 2005. V. 21. № 10. P. 2531-2533.
15. Nei M., Li W. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // PNAS. 1979. V. 76. P. 5269-5273.
16. Schneider S., Roessli D., Excoffier L. ARLEQUIN version 2000: Software for population genetic data analysis // Genetic abd Biometry Lab< Dept of Anthrtopology. University of Geneva, 2000.
17. Bandelt H., Forster P., Rohl A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies // Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. № 1. P. 37-48.
18. Bull R.A., Luciani F., McElroy K., Gaudieri S., et al. Sequential bottleneck drive viral evolution in early acute hepatitic C virus infection // PLoS Pathogens. 2011. V. 7. № 9.
19. Edwards V.C., Tarr A.W., Urbanowicz R.A., Ball J.K. The role of neutralizing antibodies in hepatitis C virus infection // J. Gen. Virol. 2012. V. 93. № 1. P. 1 -19.
20. von Hahn T., Yoon J., Alter H., Rice C., et al. Hepatitis C virus continuously escapes from neutralizing antibody and T-cell responses during chronic infection in vivo // Gastroenterology. 2007. V. 132. № 2. P. 667678.
21. Pfafferott K., Gaudieri S., Ulsenheimer A., James I., et al. Constrained pattern of viral evolution in acute and early HCV infection limits viral plasticity // Plos ONE. 2011. V. 6. № 2.
EFFECT OF SEROCONVERSION ON CHANGES IN HVR1 REGION OF E2 PROTEIN OF HCV
I.V. Astrakhantseva, D. Campo, V. V. Novikov, Yu.E. Khudyakov
The effect of seroconversion on changes in HCV was studied in intra-host HVR1 variants of 8 patients. Diversity of the viral population, the frequencies of amino acid substitution and influence of the positive selective pressure have been evaluated. We have used autologous HVR1 peptides for detecting specific anti-HVR1 IgG response in 8 patients.
Keywords: viral hepatitis C, quasispecies, HVR1, seroconversion, heterogeneity.
