CC BY
1300
ИАУННЫЕОБЗОРЫ
лабораторная диагностика вирусных гепатитов
К. К. Кюрегян1, А. Дьяррассуба2, М.И. Михайлов1, 2
1 ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
2 ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России, Москва
В обзоре описаны современные подходы к лабораторной диагностике вирусных гепатитов А, В, С, D и Е. Описаны основные серологические и генетические маркеры гепатитов, представлены методы их выявления, подходы к интерпретации полученных результатов и прогностическая значимость маркеров и их сочетаний.
Ключевые слова:
вирусные гепатиты,
диагностика,
маркеры
инфицирования,
этиология
Laboratory diagnostics of viral hepatitis
K. K. Kyuregyan1, A. Diarrassouba2, M.I. Mikhaitov1'2
1 Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, Moscow
2 People's Friendship University of Russia, Moscow
This review describes the current approaches to laboratory diagnosis of viral hepatitis A, B, C, D and E with main focus on various serological and genetic markers of viral hepatitis infections, methods of its detection, interpretation of the results and prognostic significance of these markers and its combinations.
Keywords:
viral hepatitis, diagnostics, infection markers, etiology
Лабораторная диагностика вирусных гепатитов -активно развивающаяся отрасль медицинской науки. На протяжении 50 лет, прошедших с открытия «австралийского антигена», открыты многочисленные вирусы, отвечающие за возникновение гепатитов. Многообразие серологических маркеров инфицирования, способы их выявления при помощи высокочувствительных и специфичных методов открыли возможность не только этиологической расшифровки острого или хронического вирусного гепатита, но и проведение мониторинга лечения и вакцинопрофилактики.
Традиционно методы лабораторной диагностики вирусных гепатитов делят на 2 группы: обнаружение вирусных антигенов и антител к ним и молекулярно-биологические методы детекции и анализа вирусных нуклеиновых кислот. Эволюционное развитие методической базы и диагностических препаратов в полной мере отразилось на лабораторной диагностике вирусных гепатитов. Накопленные знания по этиологии и патогенезу
этих инфекций человека служат основой современной диагностики.
Вместе тем в начале обзора мы считаем необходимым подчеркнуть, что данные обнаружения специфических маркеров инфицирования вирусными гепатитами являются важной, но частью общей системы постановки диагноза.
парентеральные вирусные гепатиты
Гепатит В
Основным диагностическим маркером гепатита В (ВГВ), появляющимся в сыворотке крови пациентов по окончании инкубационного периода (1-4 мес с момента инфицирования), является HBsAg. У большинства пациентов данный маркер исчезает из сыворотки крови через 4-6 мес с начала заболевания, чему предшествуют нормализация биохимических показателей функции
печени и клиническое выздоровление. Исчезновение HBsAg обычно сочетается с появлением нейтрализующих антител - анти-HBs. Наличие анти-HBs в сыворотке крови пациентов рассматривается либо как свидетельство проведенной вакцинации (при отсутствии антител к другим белкам ВГВ, в первую очередь к капсидному белку, анти-НВс), либо как следствие перенесенного ГВ (при наличии анти-НВс) [2]. Постоянное присутствие сывороточного HBsAg в течение более 6 мес является признаком хрони-зации инфекции (рис. 1).
Помимо анти-HBs в сыворотках крови людей, имевших контакт с ВГВ обнаруживаются антитела к капсидному белку, представленные двумя классами: анти-НВс 1дМ и анти-НВс ^ (рис. 1). Анти-НВс 1дМ определяются в сыворотке крови пациентов в течение «8 мес и являются маркерами недавнего инфицирования, в то время как анти-НВс как правило, сохраняются пожизненно [19]. Еще одним белком, выявляемым в сыворотке
крови пациентов в фазе активной репликации вируса, является НВеАд. Его функция в цикле вирусной репликации на настоящий момент не установлена. Исчезновение НВеАд из сыворотки крови пациентов обычно сопровождается появлением анти-НВе а также нормализацией уровня биохимических маркеров функции печени, однако в фазе реактивации хронического гепатита В (ХГВ) может происходить обратная сероконвер-сия с повторным появлением НВеАд [19].
Суммированные сведения о серологических маркерах гепатита В обобщены в табл. 1.
Важнейшим маркером ГВ является вирусная ДНК. Количественное определение концентраций ДНК ВГВ в сыворотке или плазме крови позволяет, во-первых, проводить мониторинг противовирусной терапии и оценивать ее эффективность, во-вторых, прогнозировать исход хронического гепатита, поскольку в крупных когортных исследованиях показана прямая связь между высокой
а _ б
Время с момента инфицирования Время с момента инфицирования
Маркер Описание
HBsAg Серологический маркер, появляющийся первым. Является скрининговым маркером острой и хронической инфекции. Инфекция считается хронической при выявлении HBsAg в течение >6 мес. Определение HBsAg в качестве маркера для диагностики хронической ВГВ-инфекции и для оценки распространенности ВГВ в популяции основано на высокой специфичности его детекции, длительной персистенции в сыворотке крови и редкой элиминации у лиц с хронической инфекцией
HBeAg Указывает на активную репликацию вируса; отсутствует или находится в низкой концентрации при мутациях в участках генома ВГВ precore или базального промотора core
Анти-HBe Обычно указывают на сероконверсию HBeAg на анти-HBe и снижение активности репликации вируса; также выявляются при HBeAg-негативном хроническом гепатите, при котором сохраняется активная вирусная репликация при наличии мутаций в участках precore или базального промотора core
Анти-HBs Выявляются после выздоровления (элиминации инфекции) и/или после вакцинации против ГВ
Анти-HBc суммарные Антитела к капсидному белку ВГВ классов IgG и IgM. Анти-HBc IgG определяют при подозрении на скрытую ВГВ-инфекцию и/или для выявления перенесенной ВГВ-инфекции
Анти-HBc IgM Маркер острой инфекции или реактивации хронической; содержатся в высокой концентрации при острой инфекции и могут присутствовать в более низкой концентрации при реактивации хронической инфекции
Рис. 1. Серологические профили течения острого (а) и хронического (б) гепатита В [19]
Таблица 1. Серологические маркеры гепатита В
вирусной нагрузкой ВГВ (более 104 копий/мл) и вероятностью прогрессирования заболевания в цирроз и гепа-тоцеллюлярную карциному (ГЦК) [33].
Оптимальным методом измерения вирусной нагрузки ВГВ является количественное определение вирусной ДНК ВГВ в сыворотке и/или плазме крови методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени (ПЦР в реальном времени). Определение концентрации ДНК ВГВ позволяет дифференцировать хронический НВеАд-негативный гепатит и стадию неактивного носительства (ДНК ВГВ <2000 МЕ/мл); проводить мониторинг ответа на противовирусную терапию на основании изменений вирусной нагрузки; отслеживать возникновение резистентных к терапии вариантов вируса, на которое указывает повышение уровней ДНК ВГВ. Стандартизованные количественные тесты являются важным инструментом мониторинга вирусной нагрузки при противовирусной терапии. Применение количественных тестов на ДНК ВГВ ранее было затруднено вследствие отсутствия стандартизации, однако в настоящее время доступны стандарты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для ДНК ВГВ. В настоящее время отсутствует консенсус по значению вирусной нагрузки, ниже которого уровень ДНК ВГВ указывает на «неактивное» носительство инфекции, а также по пороговому значению, указывающему на необходимость терапии. Однако ВОЗ рекомендует начинать противовирусную терапию для пациентов старше 30 лет, имеющих постоянно повышенные уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) и вирусную нагрузку >20 000 МЕ/мл [34]. НВеАд является суррогатным маркером виремии, однако наличие анти-НВе не обязательно указывает на прекращение репликации вируса.
Первичная диагностика ГВ традиционно строится на выявлении в сыворотке крови больного HBsAg, а не на определении ДНК ВГВ, что связано с существованием случаев выявления HBsAg при отрицательном результате теста на ДНК ВГВ. Действительно, продукция «пустых» частиц HBsAg на несколько порядков превышает продукцию зрелых вирионов, содержащих вирусную ДНК [19]. Однако с внедрением чувствительных тестов для выявления ДНК ВГВ, позволяющих выявлять вирусную ДНК в концентрациях менее 1000 копий/мл, ситуация изменилась кардинальным образом. Стало очевидно, что существует значительное количество случаев ВГВ-инфекции, ускользающих от диагностики при тестировании на HBsAg, но сопровождающихся присутствием в крови вирусной ДНК. Данное явление, называемое скрытой ВГВ-инфекцией, особое значение имеет с точки зрения инфекционной безопасности донорской крови, поскольку тестирование на ВГВ в службе крови строится на выявлении HBsAg. О несовершенстве диагностики ГВ в службе крови свидетельствует тот факт, что в США и Западной Европе частота развития посттрансфузионного ГВ составляет примерно 1 случай на 300 000 переливаний крови, что более чем в 3 раза превышает частоту посттрансфузи-онных гепатита С и ВИЧ-инфекции (1 случай на 1 000 000 переливаний крови) [20].
В 2008 г. группой экспертов на конференции Европейской ассоциации изучения печени понятие «скрытая ВГВ-инфекция» было определено как «присутствие ДНК ВГВ в печени пациентов, в сыворотке крови которых доступными методами не определяется HBsAg». Существует ряд причин, по которым в ткани печени или сыворотке крови HBsAg-негативных пациентов может выявляться ДНК ВГВ:
1. Невозможность детекции HBsAg по причине низкого уровня его экспрессии в фазе «серологического окна» ВГВ-инфекции.
2. Низкий уровень вирусной репликации у людей с хронической ВГВ-инфекцией, связанный с иммунным ответом хозяина или интерференцией с другими вирусами (например, ВГС, ВИЧ).
3. Наличие мутаций в участках генома вируса, кодирующих эпитопы HBsAg, определяемые в тест-системах, а также мутаций, связанных с угнетением вирусной репликации.
4. Нахождение HBsAg в составе иммунных комплексов.
5. Интеграция вирусной ДНК в геном гепатоцитов, сопровождающееся снижение репликативной активности ВГВ.
Скрытая ВГВ-инфекция нередко регистрируется у пациентов в фазе «серологического окна», предшествующей появлению анти-HBs. В этот период концентрация HBsAg в крови опускается ниже предела чувствительности тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА), а анти-HBs еще не выявляются. Технически такие случаи подпадают под определение «скрытой» ВГВ-инфекции, однако в последнее время в публикациях по данной теме истинно скрытой считается ВГВ-инфекция, длительное время сохраняющая свой серологический профиль (отсутствие HBsAg при наличии ДНК ВГВ в сыворотке крови и/или ткани печени) [14].
Наиболее часто формирование скрытой ВГВ-инфекции связывают с низким уровнем вирусной репликации и малым содержанием HBsAg в сыворотке крови. Причин для этого может быть несколько. Известно, что частота спонтанного исчезновения HBsAg в крови у пациентов с ХГВ составляет примерно 0,7-1,3% в год, что нередко сопровождается сероконверсией и выработкой анти-HBs [22]. Согласно классическим представлениям о течении ВГВ-инфекции, исчезновение HBsAg и выработка анти-HBs соответствуют критериям выздоровления, однако позднее было показано, что у таких пациентов даже при отсутствии сывороточных маркеров ВГВ-инфекции ДНК вируса может выявляться в ткани печени на протяжении всей жизни [13]. Весомым аргументом в поддержку снижения уровня вирусной репликации как основного фактора, обусловливающего формирование скрытой ВГВ-инфекции, является исследование, проведенное М. Hass и соавт., в ходе которого производилось транс-фецирование клеток НиН-7 клонированными последовательностями ВГВ, выделенными от пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией. Авторы наблюдали ингибирование репликативной активности вируса, а также снижение экспрессии HBsAg к клеточной культуре. Анализ последовательностей показал присутствие мутаций, обусловли-
вающих нарушение инкапсидации вирусной пгРНК и синтез ДНК ВГВ, а также мутаций, вызывающих нарушение экспрессии pre-S2/S и HBsAg [16].
О возможной связи скрытой ВГВ-инфекции с интерференцией, вызванной коинфекцией другими вирусами, свидетельствует высокая частота HBsAg-негативной инфекции у пациентов с коинфекцией ВГВ/ВГС. Оба вируса имеют общие пути передачи, и коинфекция встречается достаточно часто, особенно в высокоэндемичных областях и в группах риска. I. CaccioLa и соавт. были опубликованы данные обследования сывороток крови и био-птатов печени, взятых от 200 пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС), а также от 50 пациентов, не имевших серологических маркеров ГВ и ГС. Скрытая ВГВ-инфекция была выявлена у 33% пациентов с ХГС и 14% пациентов без ХГС [7].
По сравнению с моноинфекцией ВГВ у людей, инфицированных одновременно ВГВ и ВГС, HBsAg появляется позже и детектируется в сыворотке крови в течение меньшего времени; вирусная нагрузка ВГВ в сыворотке крови ниже, как и уровни АЛТ. Кроме того, было показано, что соге-белок ВГС ингибирует репликацию ВГВ и экспрессию его генов, однако это наблюдение недавно было поставлено под сомнение P. BeLLecave и соавт., которые показали возможность репликации обоих вирусов in vitro на культуре клеток HuH7 без признаков взаимного ингибирования [6].
Другая возможная причина формирования скрытой ВГВ-инфекции - наличие в геноме вируса мутаций, обусловливающих невозможность выявления HBsAg при помощи тест-систем ИФА - так называемых мутаций иммунного бегства. Наиболее хорошо описанной из таких мутаций является замена глицина на аргинин в 145-й аминокислотной позиции а-детерминанты S-гена ВГВ (G145R) [9]. Показано, что G145R сохраняется в доминантной популяции ВГВ в течение нескольких лет, поскольку вирус, имеющий в геноме данную мутацию, сохраняет способность к репликации, обладает инфекционными и патогенными свойствами (по результатам экспериментального заражения шимпанзе). Эпидемиологические исследования показали, что вариант G145R является наиболее распространенным мутантом ВГВ, наблюдаемым как в естественной среде, так и в когортах людей после вакцинопрофилактики и терапии специфическим анти-ВГВ-иммуноглобулином [23].
Для объяснения причин развития скрытой ВГВ-инфекции, помимо очевидных случаев серологического окна или присутствия мутаций иммунного бегства, четкой концепции пока не предложено. Основными механизмами развития скрытой ВГВ-инфекции считаются накопление в популяции вируса мутаций, связанных с посттранскрипционным процессингом поверхностного белка и его секрецией, либо мутаций, связанных с угнетением вирусной репликации, а также особенности иммунной системы хозяина, приводящие к неполной элиминации вируса из организма в ходе естественного разрешения ХГВ [8].
Распространенность скрытой ВГВ-инфекции в различных странах варьирует в широких пределах в зависимости от эндемичности в отношении ГВ исследуемого региона, факторов риска трансмиссии вирусов с парентеральной передачей у обследуемых людей и используемых методов детекции HBsAg и ДНК ВГВ.
Частота выявления скрытой ВГВ-инфекции составляет от 0,1-2,4% среди анти-НВс-позитивных доноров крови в США, где только 5% населения в течение жизни встречаются с ВГВ, до 6-15% в схожих группах доноров, проживающих на эндемичных территориях, где с ВГВ встречаются 70-90% населения, о чем свидетельствуют соответствующие показатели распространенности анти-НВс. Распространенность скрытой ВГВ-инфекции среди людей, имеющих анти-HBc, выше, чем у серонегативных по этому антигену пациентов [31].
Вероятность выявления скрытой ВГВ-инфекции значительно повышается, если детекция ДНК ВГВ проводится не в сыворотке или плазме крови, а непосредственно в гепатоцитах, однако молекулярное исследование биоптатов печени, особенно у пациентов без выраженной патологии печени, проводится достаточно редко. I. Castillo и соавт. [10] определяли ДНК ВГВ и РНК ВГС в образцах биопсии печени 76 серонегативных по ГВ пациентов со стабильным повышением уровня АЛТ, наблюдавшихся в течение 2 лет. В указанной группе пациентов у 22% была выявлена скрытая ВГВ-инфекция, у 46% - ВГС, у 32% - скрытая коинфекция обоими вирусами. Таким образом, 54% пациентов имели ДНК ВГВ в ткани печени, что свидетельствует о необходимости учитывать возможность наличия скрытой ВГВ-инфекции у большого количества пациентов с гепатитом неясной этиологии или ВГС-инфекцией. В другом исследовании скрытая ВГВ-инфекция обнаруживалась в ткани печени у 16,3% из 98 пациентов, не имеющих каких-либо клинических или биохимических признаков заболевания печени, при этом у большинства таких пациентов (62,5%) выявлялись анти-HBc [28]. Данные о высокой частоте выявления ДНК ВГВ в ткани печени у пациентов с анти-НВс позволяют сделать предположение о невозможности полной элиминации ВГВ после клинического выздоровления и сероконверсии по HBsAg. Однако в силу малого количества данных о выявлении вирусной ДНК в биоптатах печени у выздоровевших пациентов это предположение пока не нашло подтверждения.
Таким образом, согласно данным литературы, скрытая ВГВ-инфекция наиболее часто выявляется у людей, находящихся в группах риска инфицирования ВГВ, а также людей, страдающих хроническим заболеванием печени (ХЗП) неуточненной этиологии.
Гепатит дельта
Вирус гепатита дельта (ВШ) способен размножаться только при наличии ВГВ-инфекции, после одновременного заражения двумя вирусами или в результате суперинфекции организма, уже инфицированного ВГВ [29]. Известно, что для коинфекции ВШ/ВГВ характерно более тяжелое протекание заболевания печени, более быстрое
прогрессирование в цирроз и более высокий риск развития декомпенсации и гибели пациента по сравнению с моноинфекцией ВГВ [29]. В связи с этим ранняя диагностика гепатита дельта (ГО) у людей с ВГВ-инфекцией имеет важнейшее значение для выбора тактики наблюдения и лечения. Поскольку при коинфекции ВГВ/ВГО патогенез определяется именно ВГО, а подходы к терапии ХГВ и ГО принципиально отличаются (агенты прямого действия, активные против ВГВ, не эффективны в отношении ВГО), ранняя диагностика ВГО-инфекции является критическим фактором успешной терапии.
При коинфекции ВГО/ВГВ судьба ВГО определяется иммунным ответом организма на ВГВ, у взрослых примерно в 95% случаев одновременное заражение заканчивается эрадикацией обоих вирусов. Острая коинфек-ция, как правило, протекает тяжелее, чем моноинфекция ВГВ, однако степень выраженности клинических проявлений может варьировать. Наоборот, суперинфекция ВГО у людей с хронической ВГВ-инфекцией в большинстве случаев приводит к развитию хронической ВГО-инфекции [17]. Клинически случаи суперинфекции могут выглядеть как острый гепатит у пациента с ранее не диагностированным носительством HBsAg, что зачастую приводит к неправильной постановке диагноза острого гепатита В или обострения ХГВ. Уже при первичном гистологическом обследовании пациенты с суперинфекцией ВГО зачастую имеют тяжелый гепатит с высокой степенью фиброза [17]. Несмотря на высокую частоту прогрессии в цирроз, при суперинфекции ВГО/ ВГВ не наблюдают повышенный риск развития ГЦК, возможно, из-за подавления ВГО репликации и, как следствие, онкогенного действия ВГВ [30].
При коинфекции и суперинфекции ВГО наблюдается подавление репликации ВГВ как у пациентов, так и в экспериментах по моделированию инфекции. Примерно 70-90% пациентов с коинфекцией ВГО отрицательны по НВеАд (маркеру активной репликации ВГВ), и у большинства отмечают низкие уровни ДНК ВГВ в крови [35]. При инфицировании ВГО всегда развиваются антитела к капсидному белку вируса (анти-ВГО), поэтому каждый положительный по HBsAg пациент должен тестироваться на анти-ВГО ^ для выявления случаев коинфекции. После контакта с ГВО анти-ВГО ^ сохраняются длительное время даже после прекращения инфекции [17].
Раньше диагностика текущей ВГО-инфекции основывалась на определении анти-ВГО класса 1дМ (теста, обладающего относительно невысокой чувствительностью и специфичностью), в настоящее время для подтверждения инфекции применяется определение РНК ВГО в обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Скрытая (не выявляемая в серологических тестах) ВГО-инфекция не описана, поэтому тестирование РНК ВГО при отсутствии анти-ВГО не рекомендовано. По причине изменчивости вирусного генома тесты на РНК ВГО могут давать ложноотрицательные результаты - многие тест-системы имеют сниженную чувствительность при детекции новых генотипов ВГО, недавно открытых в Африке.
В 2013 г. появился Международный стандарт ВОЗ молекулярных тестов, аналогичный РНК ВИЧ, РНК ВГС и ДНК ВГВ, который позволил стандартизировать существующие тест-системы [11]. Однако определение анти-ВГО 1дМ по-прежнему актуально при обследовании пациентов, отрицательных по РНК ВГО, но имеющих клиническую картину ВГО-ассоциированного заболевания печени.
Гепатит С
Основным маркером инфекции, применяемым при проведении первичной диагностики гепатита С (ГС), являются антитела к вирусу гепатита С (ВГС) - анти-ВГС. Эти антитела являются следствием встречи организма с ВГС не могут рассматриваться как маркер текущей инфекции. Однако тот факт, что у большинства людей с анти-ВГС при последующем анализе выявляется вирусная РНК, позволяет рассматривать анти-ВГС как рутинный маркер инфицирования [2]. Вырабатывающиеся после встречи организма с ВГС антитела не обеспечивают защиту от повторного инфицирования даже ВГС того же генотипа. У людей, относящихся к группам повышенного риска инфицирования (например, инъекционных наркоманов), описано неоднократное инфицирование после спонтанной элиминации инфекции [5].
Серологические тесты не позволяют выявлять ВГС в предсероконверсионную фазу, которая может продолжаться в среднем 80 дней [15], а также иммунокомпро-метированных пациентов, не выработавших адекватный иммунный ответ к ВГС; не позволяют различать активную и прошедшую инфекцию. Для решения этой проблемы применяются различные диагностические подходы, одним из них является технология «SMARTube». Принцип действия «SMARTube»-технологии заключается в предварительной инкубации цельной крови пациента в специально изготовленном растворе, способствующем активному синтезу антител к ВГС.
Другим подходом для ранней диагностики ГС служат тесты для выявления антигена ВГС (точнее комбинированные тесты для выявления анти-ВГС и антигена ВГС) в большинстве своем не дали выраженного преимущества по сравнению с определением вирусной РНК с точки зрения сокращения серологического окна [15]. Поэтому для скрининга донорской крови и для подтверждения активной инфекции у людей с анти-ВГС преимущественно применяется определение РНК ВГС методом ОТ-ПЦР.
Количественное определение РНК ВГС для выявления исходной вирусной нагрузки до начала терапии, а также для мониторинга во время лечения широко применяется для оценки эффективности антивирусного ответа на комбинированную терапию пегилированным интерфероном и рибавирином, а также на терапию новыми препаратами прямого противовирусного действия. Современные методики по ведению и терапии ВГС-инфекции рекомендуют количественное определение РНК ВГС перед началом антивирусной терапии, во время (так называемая терапия, управляемая вирусологическим ответом) и через 24 нед по окончании терапии. Отрицательный результат выявления РНК ВГС в чувствительном тесте через 24 нед после окончания терапии является целью лечения и указывает
на достижение устойчивого вирусологического ответа (УВО) [15].
Во время двойной антивирусной терапии пегилирован-ным интерфероном и рибавирином обычно наблюдают ранний вирусологический ответ (РВО), определяемый как снижение на 2 или более десятичных логарифма (1д) уровней РНК ВГС через 12 нед терапии. Отсутствие РВО рассматривают как достоверный прогностический фактор недостижения УВО, в этом случае терапию пегилированным интерфероном и рибавирином рекомендуется прекращать. Быстрый вирусологический ответ (БВО), т.е. отсутствие выявляемых уровней РНК ВГС через 4 нед терапии, является определяющим прогностическим фактором достижения УВО [3]. Определение вирусной кинетики стало также применяться для выбора персонализированной продолжительности терапии при использовании новых антивирусных препаратов прямого действия для лечения ХГС в рамках тройной терапии с ингибиторами протеазы ВГС [18].
Помимо определения вирусной нагрузки важнейшим клинически значимым фактором является генотип ВГС, поскольку генотипы вируса различаются по степени чувствительности к интерферону и препаратам прямого действия. Подтверждено, что независимо от типа терапии (комбинированная терапия пегилированным интерфероном и рибавирином или монотерапия интерфероном) пациенты лучше всего отвечают на лечение, если они инфицированы генотипом 2, несколько хуже, если генотипом 3, и гораздо хуже, если присутствует инфекция генотипов ВГС 1 и 4. Для пациентов, инфицированных генотипами 2 и 3, рекомендуемая продолжительность терапии интерфероном составляет 24 нед, а для пациентов, инфицированных другими генотипами (в первую очередь генотипом 1) - 48 нед [3]. В свою очередь ингибиторы протеазы ВГС в основном направлены против вируса генотипа 1, хуже отвечающего на интерферон. Поэтому именно пациенты с инфекцией, вызванной ВГС генотипа 1, являются основными кандидатами на терапию препаратами прямого действия.
В связи с этим принципиально важным моментом является точность генотипирования ВГС. «Золотой стандарт» определения генотипа ВГС - анализ нуклеотидной последовательности участка NS5B вирусного генома, однако в рутинной диагностике применять данный подход затруднительно. Многие коммерческие тесты, основанные на ПЦР с генотип-специфичными праймерами, а также на обратной гибридизации, в качестве матрицы используют 5'-нетранслируемую область генома ВГС. Однако оказалось, что тесты, основанные на анализе изменчивости этого участка, неправильно классифицируют новые генотипы 7, 8 и 9 как генотип 1, а также во многих случаях не способны правильно дифференцировать субтипы 1а и 1Ь. Последнее особенно не приемлемо, поскольку показано, что широко распространенные субтипы 1а и 1Ь по-разному отвечают на антивирусные препараты прямого действия [15]. Таким образом, вопрос о наиболее адекватном методе генотипирования ВГС в рутинной клинической практике остается открытым. По-видимому, сочетанием наиболее высоких показателей чувствитель-
ности и специфичности определения генотипов ВГС обладают тесты, мишенью которых является участок core вирусного генома.
энтеральные вирусные гепатиты
Гепатит А
Так же как при парентеральных вирусных гепатитах, лабораторная диагностика гепатита А (ГА) основана на обнаружении маркеров инфицирования в сочетании с обнаружением вирусной РНК и последующим анализом нуклеотидных последовательностей. При этом могут быть решены различные задачи, к которым можно отнести лабораторную диагностику ГА, определение ранее перенесенной инфекции, идентификацию вируса в выделениях пациента или в объектах внешней среды; определение пре- или поствакцинального статуса на основании определения концентрации анти-ВГА.
Для ГА характерно последовательное появление и исчезновение серологических маркеров инфицирования ВГА (рис. 2).
Основным маркером острого ГА являются антитела класса IgM, которые часто обозначают «золотым маркером» ГА. Появление этого термина связано с обязательным присутствием этих антител при инфекции. Обычно позитивный результат обнаружения анти-ВГА IgM регистрируют в первые дни заболевания. Концентрация этих антител возрастает на протяжении 4-6 нед. В дальнейшем эти антитела циркулируют в пределах 3-6 мес с постепенным снижением концентрации до недектируемой. В научных публикациях имеются единичные сообщения о регистрации позитивного результата обнаружения анти-ВГА IgM более одного года [26].
Случаи, когда анти-ВГА IgM не выявляются у больных острым ГА, крайне редки. Обычно при исследовании образцов сывороток крови, собранных в динамике заболевания, регистрируется позитивный результат. У J/3 вакцинированных против ГА также могут быть обнаружены анти-ВГА IgM в низких концентрациях.
Анти-ВГА класса IgG в процессе заболевания начинают обнаруживать параллельно с обнаружением анти-ВГА IgM. Это связано с тем, что современные диагностические препараты одновременно выявляют оба класса антител. В период реконвалесценции ГА происходит постепенное увеличение их концентрации с последующим снижением. Однако анти-ВГА IgG сохраняются у переболевшего на протяжении многих лет и даже пожизненно.
При решении вопросов, связанных с вакцинопрофи-лактикой ГА, используют количественный тест обнаружения антител. Считается, что защитная концентрация анти-ВГА IgG составляет 20 МЕ/л.
За годы, прошедшие с момента открытия вируса ГА и обнаружения его серологических маркеров, произошла эволюция методов их тестирования. На самых начальных этапах для выявления анти-ВГА использовали иммунную электронную микроскопию. Сегодня основным методом является ИФА, который используется для решения науч-
РНК В ГА в фекалиях 105-109 копий/мл
РНК ВГА в сыворотке крови 102-105 копий/мл
РНК ВГА в слюне 102-103 копий/мл Симптомы
ЕЕ
со
Недели после заражения Рис. 2. Динамика обнаружения маркеров при остром гепатите А [26]
ных и практических вопросов. В Российской Федерации зарегистрированы диагностические препараты как отечественного, так и западного производства.
Молекулярные методы, в первую очередь ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией, позволяют выявлять РНК ВГА в клинических образцах (сыворотке крови, фекалиях, слюне) для подтверждения диагноза. Однако молекулярные исследования не имеют большого значения для диагностики ГА и ведения пациентов с этим заболеванием, поскольку определение анти-ВГА класса 1дМ позволяет эффективно диагностировать инфекцию, а терапия ГА не подразумевает применение противовирусных препаратов и, следовательно, не нуждается в мониторинге вирусной нагрузки и выявлении устойчивых к антивирусным препаратам вариантов ВГА. Тем не менее контроль ГА невозможен без внедрения методов молекулярной эпидемиологии. Выявление ВГА в крови заболевших и документированные случаи посттрансфузионного ГА являются предпосылкой для внедрения детекции РНК ВГА в службу крови. Присутствие ВГА в образцах внешней среды можно эффективно контролировать только методами молекулярной диагностики, так как определение вирусного антигена в смывах с предметов или образцах воды в ИФА обладает значительно меньшей чувствительностью по сравнению с выявлением РНК ВГА методом ОТ-ПЦР [25]. Без анализа нуклеотидных последовательностей РНК ВГА невозможен полноценный эпидемиологический анализ, направленный на выявление источников и путей передачи инфекции. В результате этого молекулярная эпидемиология стала необходимым инструментом при расследовании вспышек ГА и эпидемиологического анализа случаев передачи ВГА.
Ключевыми элементами молекулярно-эпидемиологи-ческого анализа являются определение генотипа и генетической взаимосвязи между изолятами ВГА, выделенными от заболевших, а также тщательное эпидемиологическое расследование. Для обеспечения достоверности молекулярного анализа, амплификация и секвенирование должны проводиться для участка генома ВГА, для которого существует наибольшее количество сравнительных данных. В настоящее время в большинстве молекулярно-эпидемиологических исследований для анализа используется фрагмент величиной 390 нуклеотидов, соответствующий участку генома VP1-P2B, включающий 2А, один из наиболее изменчивых участков в геноме ВГА [25]. ВГА стабилен в окружающей среде, особенно в ассоциированном с органическим материалом состоянии, и устойчив к нагреванию и низким значениям рН. Эти свойства вируса обеспечивают высокую вероятность его передачи через контаминированную воду или пищу, они же повышают вероятность выявления ВГА в образцах внешней среды, в том числе в питьевой воде и сточных водах. Применявшиеся ранее иммунологические тесты для выявления антигена ВГА в клинических образцах и объектах внешней среды обладают невысокой чувствительностью и, как правило, дают положительный результат только при высокой концентрации вируса в образце, что случается редко при выявлении ВГА в образцах воды или пищи. Таким образом, применение чувствительных методов детекции вирусной РНК позволяет с большей достоверностью выявлять потенциальные факторы передачи инфекции.
Молекулярная эпидемиология стала особенно важным инструментом при расследовании пищевых вспышек. Близкое сходство или идентичность изолятов ВГА,
К.К. Кюрегян, А. Дьяррассуба, М.И. Михайлов
лабораторная диагностика вирусных гепатитов
выделенных от пациентов при географически разъединенных случаях заболевания, указывает на возможную связь между этими случаями, которые могли бы рассматриваться как спорадические и независимые. Кроме того, увеличение базы данных последовательностей ВГА позволяет выявлять регион - источник вирусной контаминации, как это было описано при расследовании вспышек в Европе и Австралии, связанных с импортированными вялеными томатами [27]. Выявление связи между географически разрозненными пищевыми вспышками и потенциальным источником инфекции позволяет ускорить принятие мер органами здравоохранения для ограничения и прекращения таких вспышек. Однако выявление ВГА в пищевых продуктах даже с применением чувствительных молекулярных тестов не стало частью рутинного анализа при расшифровке пищевых вспышек ГА. В первую очередь это связано с длительным инкубационным периодом заболевания, поскольку к моменту развития вспышки потенциально контамини-рованные вирусом продукты обычно уже все съедены или выброшены. Все вышеприведенное справедливо и для выявления ВГА при водных вспышках, кроме случаев продолжительной контаминации водных источников. В связи с этим источник инфекции при пищевых и водных вспышках зачастую определяют на основании косвенных свидетельств, методом анализа факторов риска. Тем не менее в литературе описаны случаи, когда благодаря применению высокочувствительных методов выявления РНК ВГА в образцах воды удается определять источник инфекции [32].
Гепати т Е
Диагностика гепатита Е (ГЕ) зачастую основана на клинико-эпидемиологических данных. Диагноз подтверждается обнаружением анти-ВГЕ класса 1дМ и РНК
ВГЕ в сыворотке крови или РНК ВГЕ в фекалиях. Динамика маркеров ГЕ приведена на рис. 3.
Антитела к ВГЕ класса ^ появляются в сыворотке крови через несколько недель после заражения и сохраняются длительное время после исчезновения вируса из организма, обеспечивая защиту от повторного инфицирования [4]. Серологическое обследование людей, перенесших ГЕ, показало сохранение анти-ВГЕ ^ на протяжении как минимум 15 лет [1].
Важным вопросом при выявлении анти-ВГЕ, как 1дМ, так и является чувствительность и специфичность тест-систем ИФА, применяемых для анализа, поскольку эти показатели определяют качество диагностики ГЕ и надежность результатов сероэпидемиологических исследований. Сравнительные испытания, проводившиеся с помощью панелей образцов сыворотки крови от пациентов, инфицированных ВГЕ разных генотипов, а также пациентов с заболеваниями печени другой этиологии и здоровых людей, продемонстрировали преимущества тест-систем, в которых применяются синтетические пептиды, соответствующие эпитопам капсидного белка ВГЕ [12].
Возможности диагностики ГЕ на основании определения вирусной РНК в сыворотке крови ограничены коротким периодом виремии. Результаты наблюдения пациентов, а также моделирования ВГЕ-инфекции на приматах, продемонстрировали довольно продолжительный период выделения ВГЕ с фекалиями (более месяца), однако продолжительность присутствия выявляемых уровней РНК ВГЕ в крови варьирует и может составлять всего 1-2 нед [4]. По-видимому, именно с этим фактом связано значительное количество случаев ГЕ, при которых у анти-ВГЕ 1дМ-положительных пациентов не удается выявить РНК ВГЕ, поскольку рутинная диагностика строится преимущественно на анализе образцов крови, но не стула заболевших [21].
ВГЕ-инфекция
I
М
тГ
____ //
АЛТ
Л
?' Д
// n
их \ ¡г \
анти-ВГЕ ^
________________
■Г
анти-ВГЕ ^
V
___
у
"Г
10
11
12
13
Недели после заражения
рис. 3. Динамика обнаружения маркеров при остром гепатите Е [1]
4
Аналогично ГА определение РНК ВГЕ имеет большое значение не только и не столько для постановки диагноза, сколько для эпидемиологических исследований, расследования вспышек и спорадических случаев ГЕ, а также надзора за вирусом в объектах внешней среды. РНК ВГЕ выявляют в сточных водах свиноводческих ферм, скотобоен и в городских канализационных сто-
ках, а также в пищевых продуктах (свиной печени и изделиях из нее, морепродуктах) [24]. Кроме того, именно анализ геномной РНК штаммов ВГЕ, выделенных от заболевших людей и животных, позволил пересмотреть представления об эпидемиологии ГЕ и доказать зоо-нозную природу инфекции, вызываемой генотипами 3 и 4 ВГЕ.
сведения об авторах
Кюрегян Карен Каренович - доктор биологических наук, заведующий лабораторией этиологии, диагностики, эпидемиологии и профилактики вирусных гепатитов, заместитель директора ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» по научной работе, Москва E-mail: karen-kyuregyan@yandex.ru
Дьяррассуба Абдулайе - аспирант кафедры микробиологии и вирусологии ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России, Москва
Михайлов Михаил Иванович - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, директор ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии медицинского факультета ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России, Москва
литература_
1. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г. Энтераль-ные вирусные гепатиты (этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика). М. : ВУНМЦ Росздрава, 2007.
2. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М. : ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. 384 с.
3. AASLD/IDSA/IAS-USA. Recommendations for testing, managing, and treating hepatitis C. URL. www.hcvguidelines.org. Accessed on January 29, 2014.
4. Aggarwal R., Kini D., Sofat S. et al. Duration of viraemia and faecal viral excretion in acute hepatitis E // Lancet. 2000. Vol. 356. P. 1081-1082.
5. Aitken C.K. et al. Consecutive infections and clearances of different hepatitis C virus genotypes in an injecting drug user // J. Clin. Virol. 2008. Vol. 41, N 4. P. 293-296.
6. Bellecave P., Gouttenoire J., Gajer M. et al. Hepatitis B and C virus coinfection: a novel model system reveals the absence of direct viral interference // Hepatology. 2009. Vol. 1. P. 46-55.
7. Cacciola I., Pollicino T., Squadrito G. et al. Occult hepatitis B virus infection in patients with chronic hepatitis C liver disease // N. Engl. J. Med. 1999. Vol. 1. P. 22-26.
8. Candotti D., Lin C.K., Belkhiri D., Sakuldamrongpanich T. et al. Occult hepatitis B infection in blood donors from South East Asia: molecular characterisation and potential mechanisms of occurrence // Gut. 2012. 61 (12): 1744-53.
9. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral Hepat. 1997. Vol. 4. P. 1120.
10. Castillo I., Rodriguez-Inigo E., Lopez-Alcorocho J. et al. Comparative study on the clinical and virological characteristics among patients with single occult hepatitis B virus (HBV), single occult hepatitis C virus (HCV) and occult HBV and HCV dual infection // J. Med. Virol. 2007. Vol. 3. P. 236-241.
11. Chudy M., Hanschmann K.M., Bozsayi M., Kreb J. et al. Collaborative Study to Establish a World Health Organization International Standard for Hepatitis D Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Technology (NAT)-Based Assays // WHO Report. 2013.
12. Drobeniuc J., Meng J., Reuter G. et al. Serologic assays specific to immunoglobulin M antibodies against hepatitis E virus: pangenotypic evaluation of performances // Clin. Infect. Dis. 2010. Vol. 51, N 3. P. e24-e7.
13. EL-Sherif A., Abou-Shady M., Abou-Zeid H. et al. Antibody to hepatitis B core antigen as a screening test for occult hepatitis B virus infection in Egyptian chronic hepatitis C patients // J. Gastroenterol. 2009. Vol. 4. P. 359-364.
14. Gerlich W.H., Brener C., Saniewski M. et al. Occult hepatitis B virus infection: detection and significance // Dig. Dis. 2010. Vol. 1. P. 116-125.
15. Ghany M.G., Strader D.B., Thomas D.L. et al. Diagnosis, management and treatment of hepatitis C: an update // Hepatology. 2009. Vol. 49. P. 1335-1374.
16. Hass M., Hannoun C., Kalinina T. et al. Functional analysis of hepatitis B virus reactivating in hepatitis B surface antigen-negative individuals // Hepatology. 2005. Vol. 1. P. 93-103.
17. Hughes S.A., Wedemeyer H., Harrison PM. Hepatitis delta virus // Lancet. 2011. Vol. 378, N 9785. P. 73-85.
18. Jacobson I.M., McHutchison J.G., Dusheiko G. et al. Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C virus infection // N. Engl. J. Med. 2011. Vol. 364. P. 2405-2416.
19. Kao J. Diagnosis of hepatitis B virus infection through serological and virological markers // Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2008. Vol. 4. P. 553-562.
20. Li L., Chen P.J., Chen M.H., Chak K.F. et al. A pilot study for screening blood donors in Taiwan by nucleic acid amplification technology: detecting occult hepatitis B virus infections and closing the serologic window period for hepatitis C virus // Transfusion. 2008 Jun. Vol. 48, N 6. P. 1198-1206.
21. Maylin S., Stephan R., Molina J.M., PeraldiM.N. et al. Prevalence of antibodies and RNA genome of hepatitis E virus in a cohort of French immunocompromised // J. Clin. Virol. 2012. Vol. 53, N 4. P. 346-349.
22. McMahon B.J., Holck P., Bulkow L., Snowball M. Serologic and clinical outcomes of 1536 Alaska Natives chronically infected with hepatitis B virus // Ann. Intern. Med. 2001. Vol. 9. P. 759-768.
23. Mederacke I., Bremer B., Heidrich B. et al. Establishment of a novel quantitative hepatitis D virus (HDV) RNA assay using the Cobas TaqMan platform to study HDV RNA kinetics // J. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48. P. 2022-2029.
24. Meng X.J. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk // Vet. Microbiol. 2010. Vol. 140. P. 256-265.
25. Nainan O.V., Xia G., Vaughan G., Margolis H.S. Diagnosis of Hepatitis A virus infection: a molecular approach // Clin. Microbiol. Rev. 2006. Vol. 19. P. 63-79.
26. de Paula V.S. Laboratory diagnosis of hepatitis A // Future Virol. 2012. Vol. 7, N 5. P. 461-472.
27. Petrignani M., Harms M., Verhoef L., van Hunen R. et al. Update: a food-borne outbreak of hepatitis A in the Netherlands related to semi-dried tomatoes in oil, January-February 2010 // Euro Surveill. 2010. Vol. 15, N 20. pii: 19572.
28. Pollicino T., Raimondo G., Navarra G. et al. Occult hepatitis B virus in liver tissue of individuals without hepatic disease // J. Hepatol. 2008. Vol. 5. P. 743-746.
29. Rizzetto M. Hepatitis D: thirty years after // J. Hepatol. 2009. Vol. 50. P. 1043-1050.
30. SagnelliE., Sagnelli C., Pisaturo M., Macera M. et al. Epidemiology of acute and chronic hepatitis B and delta over the last 5 decades in Italy // World J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20, N 24. P. 7635-7643.
31. Seo D.H., Whang D.H., Song E.Y., Han K.S. Occult hepatitis B virus infection and blood transfusion // World J. Hepatol. 2015. Vol. 7, N 3. P. 600-606.
32. Tallon L.A., Love D.C., Moore Z.S., Sobsey M.D. Recovery and sequence analysis of hepatitis a virus from springwater implicated in an outbreak of acute viral hepatitis // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 74, N 19. P. 6158-6160.
33. Tillmann H.L. Antiviral therapy and resistance with hepatitis B virus infection // World J. Gastroenterol. 2007. Vol. 13. P. 125-140.
34. WHO: Guidelines for the prevention, care and treatment of persons with chronic hepatitis B infection. Geneva. : World Health Organization, 2015.
35. Zachou K., Yurdaydin C., Drebber U. et al., for the HIDT-1 Study Grou P. Quantitative HBsAg and HDV-RNA levels in chronic delta hepatitis // Liver Int. 2010. Vol. 30. P. 430-437.
references_
1. Mikhaylov M.I., Shakhgil'dyan I.V., Onishchenko G.G. Enteric hepatitis viruses (etiology, epidemiology, diagnosis, prevention). Moscow, 2007. (in Russian)
2. Shakhgil'dyan I.V., Mikhaylov M.I., Onishchenko G.G. Parenterally transmitted hepatitis viruses (epidemiology, diagnosis, prevention). Moscow, 2003: 384 P. (in Russian)
3. AASLD/IDSA/IAS-USA. Recommendations for testing, managing, and treating hepatitis C. URL. www.hcvguidelines.org. Accessed on January 29, 2014.
4. Aggarwal R., Kini D., Sofat S. et al. Duration of viraemia and faecal viral excretion in acute hepatitis E. Lancet. 2000; Vol. 356: 1081-2.
5. Aitken C.K. et al. Consecutive infections and clearances of different hepatitis C virus genotypes in an injecting drug user. J Clin Virol. 2008; Vol. 41 (4): 293-6.
6. Bellecave P., Gouttenoire J., Gajer M. et al. Hepatitis B and C virus coinfection: a novel model system reveals the absence of direct viral interference. Hepatology. 2009; Vol. 1: 46-55.
7. Cacciola I., Pollicino T., Squadrito G. et al. Occult hepatitis B virus infection in patients with chronic hepatitis C liver disease. N Engl J Med. 1999; Vol. 1: 22-6.
8. Candotti D., Lin C.K., Belkhiri D., Sakuldamrongpanich T. et al. Occult hepatitis B infection in blood donors from South East Asia: molecular characterisation and potential mechanisms of occurrence. Gut. 2012. 61 (12): 1744-53.
9. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. J Viral Hepat. 1997; Vol. 4: 11-20.
10. Castillo I., Rodriguez-Inigo E., Lopez-Alcorocho J. et al. Comparative study on the clinical and virological characteristics among patients with single occult hepatitis B virus (HBV), single occult hepatitis C virus (HCV) and occult HBV and HCV dual infection. J Med Virol. 2007; Vol. 3: 236-41.
11. Chudy M., Hanschmann K.M., Bozsayi M., Kreb J. et al. Collaborative Study to Establish a World Health Organization International Standard for Hepatitis D Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Technology (NAT)-Based Assays. WHO Report. 2013.
12. Drobeniuc J., Meng J., Reuter G. et al. Serologic assays specific to immunoglobulin M antibodies against hepatitis E virus: pangenotypic evaluation of performances. Clin Infect Dis. 2010; Vol. 51 (3): e24-7.
13. El-Sherif A., Abou-Shady M., Abou-Zeid H. et al. Antibody to hepatitis B core antigen as a screening test for occult hepatitis B virus infection in Egyptian chronic hepatitis C patients. J Gastroenterol. 2009; Vol. 4: 359-64.
14. Gerlich W.H., Brener C., Saniewski M. et al. Occult hepatitis B virus infection: detection and significance. Dig Dis. 2010; Vol. 1: 116-25.
15. Ghany M.G., Strader D.B., Thomas D.L. et al. Diagnosis, management and treatment of hepatitis C: an update. Hepatology. 2009; Vol. 49: 1335-74.
16. Hass M., Hannoun C., Kalinina T. et al. Functional analysis of hepatitis B virus reactivating in hepatitis B surface antigen-negative individuals. Hepatology. 2005; Vol. 1: 93-103.
17. Hughes S.A., Wedemeyer H., Harrison PM. Hepatitis delta virus. Lancet. 2011; Vol. 378 (9785): 73-85.
18. Jacobson I.M., McHutchison J.G., Dusheiko G. et al. Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2011; Vol. 364: 2405-16.
19. Kao J. Diagnosis of hepatitis B virus infection through serological and virological markers. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; Vol. 4: 553-62.
20. Li L., Chen P.J., Chen M.H., Chak K.F. et al. A pilot study for screening blood donors in Taiwan by nucleic acid amplification technology: detecting occult hepatitis B virus infections and closing the serologic window period for hepatitis C virus. Transfusion. 2008; Vol. 48 (6): 1198-206.
21. Maylin S., Stephan R., Molina J.M., Peraldi M.N. et al. Prevalence of antibodies and RNA genome of hepatitis E virus in a cohort of French immunocompromised. J Clin Virol. 2012; Vol. 53 (4): 346-9.
22. McMahon B.J., Holck P., Bulkow L., Snowball M. Serologic and clinical outcomes of 1536 Alaska Natives chronically infected with hepatitis B virus. Ann Intern Med. 2001; Vol. 9: 759-68.
23. Mederacke I., Bremer B., Heidrich B. et al. Establishment of a novel quantitative hepatitis D virus (HDV) RNA assay using the Cobas TaqMan platform to study HDV RNA kinetics. J Clin Microbiol. 2010; Vol. 48: 2022-9.
24. Meng X.J. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk. Vet Microbiol. 2010; Vol. 140: 256-65.
25. Nainan O.V., Xia G., Vaughan G., Margolis H.S. Diagnosis of Hepatitis A virus infection: a molecular approach. Clin Microbiol Rev. 2006; Vol. 19: 63-79.
26. de Paula V.S. Laboratory diagnosis of hepatitis A. Future Virol. 2012; Vol. 7 (5): 461-72.
27. Petrignani M., Harms M., Verhoef L., van Hunen R. et al. Update: a food-borne outbreak of hepatitis A in the Netherlands related to semi-dried tomatoes in oil, January-February 2010. Euro Surveill. 2010; Vol. 15 (20). pii: 19572.
28. Pollicino T., Raimondo G., Navarra G. et al. Occult hepatitis B virus in liver tissue of individuals without hepatic disease. J Hepatol. 2008; Vol. 5: 743-6.
29. Rizzetto M. Hepatitis D: thirty years after. J Hepatol. 2009; Vol. 50: 1043-50.
30. SagnelliE., SagnelliC., Pisaturo M., Macera M. et al. Epidemiology of acute and chronic hepatitis B and delta over the
last 5 decades in Italy. World J Gastroenterol. 2014; Vol. 20 (24): 7635-43.
31. Seo D.H., Whang D.H., Song E.Y., Han K.S. Occult hepatitis B virus infection and blood transfusion. World J Hepatol. 2015; Vol. 7 (3): 600-6.
32. Tallon L.A., Love D.C., Moore Z.S., Sobsey M.D. Recovery and sequence analysis of hepatitis a virus from springwater implicated in an outbreak of acute viral hepatitis. Appl Environ Microbiol. 2008; Vol. 74 (19): 6158-60.
33. Tillmann H.L. Antiviral therapy and resistance with hepatitis B virus infection. World J Gastroenterol. 2007; Vol. 13: 125-40.
34. WHO: Guidelines for the prevention, care and treatment of persons with chronic hepatitis B infection. Geneva.: World Health Organization, 2015.
35. Zachou K., Yurdaydin C., Drebber U. et al., for the HIDT-1 Study Grou P. Quantitative HBsAg and HDV-RNA levels in chronic delta hepatitis. Liver Int. 2010; Vol. 30: 430-7.
