CC BY
11
УДК 577.113.4: 577.152.314.14
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФОСФОРИЛДИСУЛЬФИДНУЮ ГРУППИРОВКУ В ЗАДАННОМ ПОЛОЖЕНИИ УГЛЕВОДОФОСФАТНОГО ОСТОВА
А.С. Романенков, О.А. Борисова, Е.А. Кубарева, Т.С. Орецкая, В.Г. Метелев
(кафедра химии природных соединений, e-mail: roma_andr@mail.ru)
Оптимизирован синтез олигодезоксирибонуклеотидов с межнуклеотидной фос-форилдисульфидной группировкой. Понижение рН реакционной смеси до 4,55,0 позволило существенно сократить время реакции и повысить выход целевых соединений. Установлено, что модифицированные олигодезоксирибонукле-отиды легко вступают в реакцию дисульфидного обмена с тиоловыми группами дитиотреита и цистеина, но не взаимодействуют с лизином.
Олигонуклеотиды с химически активными группировками, направленно введенными в углеводофосфат-ный остов, нашли широкое применение при изучении механизмов действия различных белков и ферментов нуклеинового обмена [1, 2]. Такие ДНК-реагенты, способные образовать ковалентную связь с определенными аминокислотными остатками ДНК-узнающих белков, позволяют установить пространственную сближенность отдельных аминокислотных остатков с соответствующими нуклеотидными звеньями ДНК. Кроме того, селективные ДНК-реагенты могут служить основой для создания высокоспецифических ингибиторов отдельных ферментов.
Недавно в нашей лаборатории были предложены новые химически активные производные ДНК [3], содержащие единичные фосфорилдисульфидные группировки (ФДГ*) [-0-Р(-0-)(=0)-88-СН2-] вместо природных фосфодиэфирных [—О—Р(—0)(=0)—О—
СН-].
Особенностью введенной межнуклеотидной ди-сульфидной группировки является ее способность участвовать в тиол-дисульфидном обмене с тиолсо-держащими соединениями, что, в частности, позволяет ковалентно связать ДНК-узнающие белки, содержащие цистеин, с модифицированными олиго-нуклеотидами. Протекание реакции возможно при образовании специфического ДНК-белкового комплекса в водных буферных растворах при физиологических значениях рН.
Целью настоящей работы являлись разработка оптимальных методов синтеза и изучение свойств
ФДГ-содержащих олигонуклеотидов в реакциях с различными низкомолекулярными нуклеофилами. Полученные данные позволяют расширить возможности использования таких аналогов ДНК для изучения структуры цистеин-содержащих белков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами.
Экспериментальная часть
Буферные растворы. А: 50 мМ морфолиноэтан-сульфокислота (pH 7,0), 20 мМ MgCl2; Б: 0,015 M цитрат натрия (рН 4,5-7,8), 0,15 М NaCl, 0,02 М MgCl2; В: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 0,3 M NaCl, 1 мМ ЭДТА; ТБЕ: 50 мM Трис-HCl (pH 8,3), 50 мM H3BO3, 1 мM ЭДТА.
Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие 3'-ти-офосфатную или 5'-тритилмеркаптогруппировки, были синтезированы амидофосфитным методом на синтезаторе Applied Biosystems 380B (США) по методикам, опубликованным ранее [4-6].
УФ-спектры поглощения водных растворов оли-гонуклеотидов регистрировали на двулучевом спектрофотометре Hitachi 150-20 (Япония).
Масс-спектры регистрировали на приборе "Voyager DEVISION 2000" (PE Biosystems).
Электрофорез олигонуклеотидов в денатурирующих условиях проводили в плоском ПААГ (20%-й акриламид, 1%-й N^'-метиленбисакриламид, 7 М мочевина) в ТБЕ буфере при напряжении 1200 В. Реакционные смеси олигонуклеотидов наносили на гель в 5 мкл 80%-го водного раствора формамида. Положение олигонуклеотидных фрагментов определя-
* Принятые сокращения: ДТТ - дитиотреит, ДМФА - диметилформамид, ПААГ - полиакриламидный гель, Трис-2-амино-2-(гидрокси-метил)-1,3-пропандиол, ФДГ - фосфорилдисульфидная группировка. ЭДТА - динатривая соль этилентетрауксусной кислоты. При обозначении олигодезоксирибонуклеотидов индекс d опущен.
С х е м а 1
...-O-
W
0
1 -
0=P—O -
S
_ в.
0
1
0=P—O
O-...
N S_S" ^N*
SS
0
1
0=P—0
I
O-...
H202 метод 1
5'
...-0-
pH 8.0
N S H
,0.
w
0
-
0=P—0
I
S
в
S в2
0
w
0 I
0=P—0
I
0-...
+
в
в
+
Bj - A, C, T или G, B2 - C или T
ли визуально при УФ-облучении. Гель фотографировали камерой МР-4 ("Polaroid", США). Для выделения олигонуклеотидов из геля использовали буфер В.
Восстановление димеров 3-тиофосфорилирован-ных олигонуклеотидов. К 15 нмоль олигонуклеотида в 100 мкл воды добавляли 25 мкл 0,05 М Трис-HCl (рН 7,5), 25 мкл 0,1 M ДТТ. Полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 40-50 мин, олигонуклеотид осаждали 600 мкл 2%-го раствора LiClO4 в ацетоне с последующим центрифугированием.
Удаление тритильной группы с 5' -дезокси-5' -тритилмеркаптопроизводных олигонуклеотидов. К 3-5 ОЕ260 5'-тритилмеркаптоолигонуклеоти-да в 100 мкл воды добавляли 6 мкл 0,15 М нитрата серебра. Полученный раствор выдерживали при комнатной температуре 1 ч, добавляли 30 мкл 0,1 М ДТТ, перемешивали, выдерживали 5 мин и центрифугировали. Осадок дважды промывали водой. Из объединенных растворов олигонуклеотид осаждали спиртом или раствором перхлората лития в ацетоне.
5'-Дезокси-5-(пирид-2-илдитио)олигонуклеоти-
ды получали обработкой соответствующих меркап-тосоединений 0,03 М 2,2' -дипиридилдисульфидом в буфере 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), содержащем 50% ДМФА, при 25° в течение 3 ч. Затем добавляли ацетат натрия до концентрации 0,3 М, олигонуклео-тиды осаждали добавлением 4-5-кратных объемов этилового спирта. Выход продукта реакции составлял 90-95%.
Синтез олигонуклеотидов с ФДГ Химическое лигирование в присутствии перекиси водорода (метод 1). 3 нмоль олигонуклеотид-3' -тиофосфосфата, 3 нмоль 5'-дезокси-5'-меркаптооли-гонуклеотида и 3 нмоль комплементарной матрицы растворяли в 40 мкл буфера А, содержащего 70 мМ Н202. Реакционную смесь инкубировали при 0° в течение 1 ч. Олигонуклеотиды осаждали 5-кратным избытком 2% раствора ЫС104 в ацетоне и анализировали в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину.
Химическое аутолигирование (метод 2). 3 нмоль олигонуклеотид-3'-тиофосфосфата и 2,7 нмоль
Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов лигирования при синтезе олигонуклеотида II. Исходный 3'-тиофосфорилированный олигонуклеотид (дорожка 6), он же в смеси с гомо-димером с 3'-3' дифосфорилдисульфидной связью (дорожка 7); исходный 5'-дезокси-5'-меркаптоолигонуклеотид (дорожка 1), он же в смеси с гомодимером с 5'-5' дисульфидной связью (дорожка 2). Продукты лигирования 3'-тиофосфорилированного и 5'-дезокси-5'-меркапто-компонента под действием 70 мМ Н202 в буфере А в отсутствие (дорожка 3) и в присутствии (дорожка 4) 23-звенной комплементарной матрицы ТОСАОТСААТАОССАООААСОТС. Контрольный немодифицированный 21-звенный олигонуклеотид (дорожка 5). Стрелками указано положение 8—26-звенных олигонуклеотидов, а также красителей бромфенолового синего (БФС) и ксиленцианола (КЦ)
5' -дезокси-5' -(пирид-2-илдитио)олигонуклеотида растворяли в 30 мкл буфера Б (рН 4,5). Полученную реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Олигонуклеотиды выделяли и анализировали, как в методе 1.
Реакции олигонуклеотидов, содержащих ФДГ, с низкомолекулярными нуклеофилами. 1,5 нмоль водного раствора ФДГ-содержащего олигонуклеотида инкубировали с ДТТ, цианидом калия, азидом натрия, водным раствором аммиака или аминокислотами (Ка-ацетил-Ь-лизином, Ь-цистеином). Значения рН и времени инкубации реакционных смесей указаны в таблице. Олигонуклеотиды осаждали 5-кратным избытком 2%-го раствора ЫС104 в ацетоне и анализировали в 20%-м ПААГ, содержащем 7 М мочевину.
Результаты и обсуждение
Для направленного введения фосфорилдисульфид-ной группировки в состав углеводофосфатного остова ДНК были использованы два различных метода (схема 1).
Метод 1 был предложен ранее [7] для получения олигонуклеотидов, содержащих дифосфорилдисуль-фидные группировки [—0—Р(—0-)(=0)—88—Р(—0)(=0)— 0—]. В настоящей работе он был применен для получения олигонуклеотидов с ФДГ. Суть этого метода заключается в химическом лигировании 3'-тиофосфо-рилированного и 5'-дезокси-5'-меркаптопроизводного составляющих компонентов олигонуклеотидной цепи под действием перекиси водорода, которая окисляет сульфгидрильные группы олигонуклеотидов с образованием дисульфидной связи (схема 1).
Основой метода 2 является тиофосфорил-дисуль-фидный обмен между тиофосфосфатом одного компонента и (пирид-2-ил)дисульфидной группировкой второго (схема 1). Этот метод уже был использован для введения ФДГ в состав олигонуклеотидов, однако 85—95%-й выход продукта реакции наблюдался лишь после 16-часовой инкубации реакционной смеси в буфере с рН 7,0 [3]. В данной работе были оптимизированы условия образования ФДГ на примере синтеза следующих олигонуклеотидов:
Рис. 2. Зависимость натурального логарифма константы скорости реакции (ln k2) образования ФДГ в составе олигонуклеотида III от рН
нентам, выход олигонуклеотидов с ФДГ повышался до 80-85% при инкубации реакционной смеси в течение 1 ч (рис. 1, дорожка 4).
Лигирование по методу 2 требовало активации тиоловой группы в составе 5'-дезокси-5'-меркапто-компонента 2,2'-дипиридилдисульфидом (схема 1).
Пиридилдисульфидные производные олигонуклео-тидов стабильны при хранении (-10°) в течение 2-3 недель.
Одним из продуктов реакции образования ФДГ по методу 2 является 2-тиопиридон (схема 1), который имеет максимум поглощения при 343 нм (е 343 = 7060 М~*см х), т. е. в той области спектра, где не поглощают пуриновые и пиримидиновые основания. Следовательно, за кинетикой реакции можно следить спектрофотометрически по количеству выделенного 2-тиопиридона. Этот подход успешно применялся в [8] и был использован в данной работе для определения константы скорости реакции образования ФДГ по методу 2 в составе олигонуклеотида III (к2) в зависимости от рН среды. Реакцию проводили в буфере Б с разными значениями рН (4,5; 5,0; 6,0; 7,0; 7,8) при использовании небольшого избытка 3'-тиофосфорилиро-ванного компонента олигонуклеотида III по отношению к 5'-дезокси-5'-(пирид-2-илдитио)олигонуклеотиду (1,2:1,0). В результате исследования была получена зависимость 1п к2 от рН реакционной смеси (рис. 2).
Рис. 3. Электрофоретический анализ реакционной смеси, полученной при синтезе олигонуклеотида II (дорожка 2). Исходные олигонуклеотид-3'-тиофосфат (дорожка 1) и 5'-дезокси-5'-(пирид-2-илдитио)олигонуклеотид (дорожка 3), контрольный немодифицированный 21-звенный оли-гонуклеотид (дорожка 4). Стрелками указано положение олигонуклеотидов и красителей БФС и КЦ
АССТСООАААОТр88ССССТСТ, I
АСОТТССТООСТАр88ТТОАСТОС, II
ТСООТТСр88СТООСТСТ, III
р88 - фосфорилдисульфидная группировка.
Лигирование по методу 1 позволило получить продукты реакции, содержащие ФДГ, с выходами 510% (рис. 1, дорожка 3). В присутствии матрицы, комплементарной тиофосфатному и меркапто-компо-
Рис. 4. Электрофоретический анализ продуктов реакции оли-гонуклеотида I с 50 мМ раствором ДТТ (дорожка 1) и с 500 мМ раствором азида натрия NN (дорожка 3). Исходный оли-гонуклеотид I (дорожка 2). Стрелками указано положение олигонуклеотидов и красителей БФС и КЦ
Результаты расщепления ФДГ в составе олигонуклеотида под действием различных низкомолекулярных
нуклеофилов
Нуклеофил Концентрация нуклеофила в реакционной смеси рН реакционной смеси Время реакции, ч % расщепления ФДГ
SH-группа ДТТ 0,05 М 7,5 1 100
CN- 0,25 М 8-10 1 100
N3- 0,5 М 7,5 1 ~30
NH3 2,5 М 11 1 ~50
£-NH2-rpynna лизина 8 мМ 7,5 5 ~3
SH-группа цистеина 8 мМ 7,5 1 100
C х е м а 2
Nu:
5'
о
-O—P-S"
I.
о
5'
II ^
-O—P-S-S-
-CH-,
3'
+
Nu—s—CH2
3'
о
о
Проведенные исследования показали, что с уменьшением рН скорость реакции образования ФДГ возрастает. При рН 4,5 и 25° через 30 мин выходы оли-гонуклеотидов I-III составляли 95-98% (рис. 3). Исходя из значений констант диссоциации функциональных групп, участвующих в образовании ФДГ [8], можно полагать, что реакция осуществляется за счет атаки моноаниона тиофосфорилированного компонента на монокатион 2-пиридилдисульфидного производного олигонуклеотида. Протонирование атома азота пиридинового цикла увеличивает электрофильность атома серы в составе дисульфида и делает протони-рованный 2-тиопиридон хорошей уходящей группой.
Строение полученных по методу 2 модифицированных олигонуклеотидов было подтверждено данными масс-спектрометрии: для олигонуклеотида I -
М+ 5756,8/5763,87, а для олигонуклеотида II -М+ 6436,3/6436,5.
Таким образом, было установлено, что для быстрого и эффективного введения ФДГ в состав оли-гонуклеотидов по методу 2 рационально использовать буферный раствор с рН 4,5. Использование метода 1 также оправдано, так как позволяет сразу получать ФДГ-содержащие олигонуклеотидные дуплексы с достаточно высоким выходом (80-85%) без предварительной активации 5'-дезокси-5'-мер-каптокомпонента модифицируемой олигонуклеотид-ной цепи.
Введение ФДГ в состав олигонуклеотида приводит к появлению дополнительного электрофильного центра [3]. Нуклеофильной атаке подвергается атом серы, связанный с метиленовой группой 5'-компонен-
та олигонуклеотидной цепи (схема 2). В этом случае уходящей группой будет являться более сильная 3'-тиоалкилфосфорная кислота.
В данной работе была изучена устойчивость оли-гонуклеотидов, содержащих ФДГ, к действию таких низкомолекулярных нуклеофилов, как ионы СК и N3 , аммиак, а также аминогруппы Ка-ацетил-Ь-лизи-на и тиолят-аниона ДТТ и Ь-цистеина [9]. Все проведенные реакции сопровождались расщеплением ФДГ, однако процент расщепления был различен для разных нуклеофилов. Полученные результаты представлены в таблице.
Как и следовало ожидать, ФДГ в составе олиго-нуклеотида количественно расщеплялась раствором 50 мМ ДТТ, т. е. проявляла свойства дисульфид-со-держащей группы (рис. 4, дорожка 1) [10], а под действием 0,5 М азида натрия расщепление ФДГ составило лишь 30% (рис. 4, дорожка 3). Полученные данные по расщеплению ФДГ под действием нуклео-фильных групп аминокислот лизина и цистеина (таблица) позволяют предположить, что ФДГ в составе ДНК-белкового комплекса будет преимущественно взаимодействовать с остатками цистеина белка, но не с е-аминогруппой лизина.
Работа выполнена при поддержке грантов "Университеты России" (№УР 03.05.010) и РФФИ (№ 01-0448605).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kozlov I.A., Kubareva E.A., Ivanovskaya M.G., Shabarova Z.A. //
Antisense Nucleic Acid Drug. Dev. 1997. 7. P.279.
2. Purmal A.A., Shabarova Z.A., Gumport R.I. // Nucleic Acids Res.
1992. 20. P. 3713.
3. Metelev V.G., Borisova O.A., Volkov E.M. et al. // Nucleic Acids
Res. 2001. 29. P. 4062.
4. МетелевВ.Г., Орецкая Т.С. // Биоорган. химия. 1999. 25. P. 490.
5. Burgin A.BJr., Huizenga B.N., Nash H.A. // Nucleic Acids Res.
1995. 23. P. 2973.
6. Sproat B.S., Beijer B., Rider. P., Neuner P. // Nucleic Acids Res.
1987. 15. P. 4837.
7. Dolinnaya N.G., Metelev V.G., Oretskaya T.S. et al. // FEBS Lett.
1999. 444. P. 285.
8. Wu C.-W., Eder P.S., Gopalan V. and Behrman E.J. // Bioconjug.
Chem. 2001. 12. P. 842.
9. Хаскин Б.А. // Усп. хим. 1994. 53. С. 1325.
10. PackerL. // Methods Enzymol. 1995. 251. P.361
Поступила в редакцию 24.12.02
SYNTHESIS AND PROPERTIES OF OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDES CONTAINING PHOSPHORYLDISULFIDE MOIETY IN THE PREDETERMINED POSITION OF CARBOHYDRATE-PHOSPHATE BACKBONE
A.S. Romanenkov, O.A. Borisova, E.A. Kubareva, T.S. Oretskaya, V.G. Metelev
(Division of Chemistry of Natural Compounds; e-mail: roma_andr@mail.ru)
The synthesis of oligodeoxyribonucleotides with internucleotide phosphoryldithio group was optimized. The lowering of incubation mixture pH to 4.5 - 5.0 allowed to lessen substantively the reaction time and to increase the yield of target compounds. It was demonstrated that modified oligodeoxyribonucleotides are able to interact easily with mercapto groups of dithiotreitol and cysteine via thiol-disulfide exchange, but they are stable to lysine treatment.
