CC BY
81
УДК 577.29
Дезаминирование остатков 5-метилцитозина в клетках млекопитающих
Е.В. Громенко1, П.В. Спирин2, Е.А. Кубарева3, Е.А. Романова3, В.С. Прасолов2, О.В. Шпанченко1*, О.А. Донцова1, 3
1 Химический факультет МГУ, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3, ГСП-1, МГУ
2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
3 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИФХБ
*E-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Деметилирование ДНК в клетках млекопитающих происходит после оплодотворения и во время эмбриогенеза, сопутствует клеточному старению и раковой трансформации. С помощью реакции удлинения праймера, MALDI MS и расщепления ДНК тимин-ДНК-гликозилазой показано, что обработка модельных метилированных ДНК-дуплексов ядерными экстрактами клеток линий СНО, HeLa и Skov3 приводит к дезаминированию остатков 5-метилци-тозина. Высказано предположение о том, что дезаминирование 5-метилцитозина является первой стадией процесса деметилирования у млекопитающих. Ключевые слова: дезаминирование 5-метилцитозина, деметилирование 5-метилцитозина, реакция удлинения праймера, MALDI MS, тимин-ДНК-гликозилаза.
Список сокращений: тС — 5-метил-2'-дезоксицитидин, ПЦР — полимеразная цепная реакция, ПААГ — полиакриламидный гель, TDG — тимин-ДНК-гликозилаза, MALDI MS — масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной матричной десорбции.
ВВЕДЕНИЕ
Активное деметилирование ДНК у млекопитающих необходимо для правильного развития организма, формирования иммунного ответа и памяти. Деметилирование ДНК сопровождает возникновение различных болезней и старение организмов.
Глобальное деметилирование наблюдается в отцовском пронуклеусе в эмбрионах мышей [1], крыс, свиней, коров и человека [2], а также в их гоноцитах. Оно обеспечивает эпигенетическое репрограммирование и специфическую экспрессию генов.
Метилирование и деметилирование ДНК в клетках нервной системы влияют на синаптическую пластичность и формирование памяти. Метилирование ДНК необходимо для инактивации гена ppl, подавляющего процессы памяти, в то время как активное деметилирование ДНК связано с активацией гена рилина, способствующего формированию памяти у крыс [3]. Также активное деметилирование ДНК необходимо для нормального нейрогенеза в эмбрионах рыб вида Danio rerio. Подавление экспрессии Gadd45a (Growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45 alpha) или других белков, участвующих в процессе деметилирования, приводит к гибели нейронов в результате гиперметилирования и подавления экспрессии генов, обеспечивающих нейрогенез [4].
Метилирование и деметилирование ДНК является важной частью эпигенетического контроля при иммунном ответе [5]. Деметилирование промоторных участков генов цито-кинов il-2 и ifn-Y при контакте CD8 Т клеток с антигенами приводит к быстрой экспрессии цитокинов [6-8].
Деметилирование ДНК сопутствует клеточному старению [9]. При этом для крыс показана разница в степени деметилирования в различных тканях - в ткани мозга она выше, чем в ткани печени. Также было обнаружено возрастное снижение содержания 5-метилцитозина в ДНК для клеток легких и фибробластов кожи, причем для последних показана связь деметилирования со снижением возможности роста в культуре [10].
Глобальное деметилирование генома наблюдается во всех изученных раковых клетках [11-13]. При этом гипоме-тилированными участками оказываются многочисленные повторы, импринтированные гены, тканеспецифические гены, онкогены и гены, связанные с процессами инвазии и метастазирования опухолей [14, 13]. В то же время некоторые локусы, включая многие гены опухолевых супрес-соров, гиперметилированы, что приводит к подавлению их экспрессии [12, 15, 16].
Очевидно, что деметилирование ДНК играет огромную роль в жизнедеятельности клетки, при этом механизм де-метилирования ДНК и участники этого процесса у млекопитающих до сих пор не установлены. Целью настоящей работы являлось изучение механизма деметилирования ДНК в клетках млекопитающих.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Олигонуклеотиды I—III синтезированы амидофосфитным методом в автоматическом режиме на синтезаторе фирмы Applied Biosystems с использованием коммерческих реагентов и раство-
рителей по стандартному регламенту: 5'-CATGTCTAACmCGmCGmCGAGAAATGGTAATG TATGGAGT* (I)
5'-cATAcATTAccATTTcTmcGmcGmcGGTTAGAcAT GGC* (II)
5'-CATACATTACCATTTC (III), где * - аминогруппа, соединенная с З'-концом олигодезоксирибонуклеотидов линкером.
Олигонуклеотиды 5'-TT(Biotm-T)TTTTTTTGTCTACGATCGAACmCG mCGmCGAGAAGCTTGTAT* (IV), 5'-ATACAAGCTTCTm CGmCGmCGGTTCGATCGTAGACAAAAAAAAAA* (V) -коммерческие препараты («Синтол»).
Культивирование клеточных линий и приготовление ядерных экстрактов. Перевиваемые клетки яичников китайского хомячка линии СНО, карциномы шейки матки человека линии HeLa и аденокарциномы яичников человека линии Skov3 выращивали на стандартной среде DMEM, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки (FCS), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед./мл, соответственно, при температуре 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Для пересева клеток клеточный монослой промывали буфером PBS (10 мМ Na2HPO4, 1.5 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, pH 7.4), добавляли стандартный раствор трипсин-ЭДTA (Sigma) и помещали в СО2-инкубатор на 3-5 мин, добавляли среду с FCS и суспендировали пипетированием, клетки рассевали в необходимое количество культураль-ных флаконов. Клетки, выросшие до монослоя, собирали центрифугированием при 2300 об/мин в течение 10 мин при 4 °С. Затем клетки промывали несколько раз буфером PBS и лизировали в буфере L (20 мМ Hepes (pH 7.6), 10 мМ NaCl, 1.5 мМ MgCl2, 20 % глицерин, 0.1 % Triton X100, 1 мМ DTT, коктейль ингибиторов протеиназ). Через 2 мин лизат суспендировали и центрифугировали 20-30 с при 10000 об/мин. К осадку добавляли равный объем буфера NE (20 мМ Hepes (pH 7.6), 500 мМ NaCl, 1.5 мМ MgCL!, 20 % глицерин, 0.1 % Triton X100, 1 мМ DTT, коктейль ингибиторов протеиназ), тщательно суспендировали и помещали на качалку на 30-60 мин. Затем лизат центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин.
Формирование ДНК-дуплекса и обработка ядерным экстрактом клеток. Формирование ДНК-дуплекса I/II проводили на приборе для ПЦР, выдерживая 20 мкл реакционной смеси, содержащей 500 пмоль олигонуклеотида I и 550 пмоль олигонуклеотида II, при 95 °C 3 мин и далее охлаждая термостат с 95 до 35 °C со скоростью 0.5 °/мин и с 35 до 20 °C со скоростью 0.25 °/мин.
Далее 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер NE, 10 мкМ ДНК-дуплекса I/II и ядерный экстракт, соответствующий ~ 50 000 клеток, инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. После трехкратной фенольной депротеинизации ДНК-дуплекс осаждали 2.5 объемами этанола с добавлением 1/10 объема 3 М NaOAc (pH 5.5) в течение 2 ч при -20 °С. Осадок отделяли центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 10 мин, промывали 70 %-ным этанолом, высушивали в вакууме, растворяли в 20 мкл воды. Реакция удлинения праймера. Предварительно вводили радиоактивную метку на 5'-конец праймера III. Для этого 20 мкл реакционной смеси, содержащей буферный
раствор для Т4 полинуклеотидкиназы (5ОО hM Tris-HCl (pH 7.6), 1ОО mM MgCl2, 5О mM DTT, 1 mM спермидин, 1 mM ЭДТА, 1 mM ADP), 1О м^ праймера III, 5 единиц Т4-полинуклеотидкиназы (MBI Fermentas, 1О ед./мкл) и 1О mrM [y-32P]ATP (GE Healthcare, удельная активность 22О ТБк/ммоль или 6ООО Ки/ммоль), инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Фермент инактивировали нагреванием в течение 15 мин при 75 °C. 32Р-меченный праймер III очищали электрофорезом в денатурирующем 12 %-ном ПААГ. Зону с праймером III, содержащим радиоактивную метку, визуализовали с помощью радиоавтографии и вырезали. Праймер III элюировали из геля 4ОО мкл буфера GES (1О mM Tris-HCl (pH 8.О), 1 % SDS, О.5 % Triton Х1ОО, 5О mM ЭДTA) с добавлением 4ОО мкл фенола при интенсивном перемешивании в течение ночи. Водную фазу отделяли центрифугированием при 14 ООО об/мин в течение 5 мин, праймер III осаждали, как описано выше, и растворяли в 2О мкл воды. Количество праймера III оценивали либо по радиоактивности, либо спектрофотометрически по поглощению раствора при длине волны 26О нм. Далее к 3 мкл 32Р-меченного очищенного праймера III (3.3 мкM) добавляли 4 мкл раствора ДНК-дуплекса I/II (2.5 мкM) и 1 мкл 1Ох реакционного буфера (5ОО mM Tris-HCl (pH 8.О), 5О mM MgCl2, 1О mM DTT), гибридизацию проводили на приборе для ПЦР при охлаждении термостата с 7О до 42 °C со скоростью О.4 °/мин с выдерживанием температуры 21 с и увеличением каждого следующего времени цикла на 1 с. Затем к реакционной смеси добавляли 5 единиц фрагмента Кленова, лишенного экзонуклеазной активности (MBI Fermentas, 1О ед./мкл), и 1 мкл смеси dATP, dCTP, dTTP (1 mM каждого), ddNTP (О.О1 mM). Реакционную смесь инкубировали при 37 °C в течение 1О мин. Реакцию останавливали нагреванием до 75 °C в течение 1О мин. Анализ продуктов реакции удлинения праймера проводили электрофорезом в денатурирующем 1О %-ном ПААГ. Гель высушивали под вакуумом, экспонировали на экран BAS CASSETTE 234О, информацию с экрана считывали на приборе FUJIFILM FLA 3ООО с помощью программы BASReader 3.14. Обработка ДНК-дуплексов тимин-ДНК-гликозилазой (TDG). 2О мкл реакционной смеси, содержащей О.5 мкM ДНК-дуплекса I/II, 32Р-меченного по одной из цепей, 1О единиц TDG (R&D Systems, 5 ед./мкл) и буфер (1О mM Hepes (pH 7.4), 1ОО mM KCl, 1О mM EДTA), инкубировали при 65 °C в течение 1 ч. Далее добавляли 1О мкл 3-кратного щелочного буфера (3ОО mM NaOH, 97 % формамид, О.2 % бромфеноловый синий), инкубировали при 95 °C в течение 1О мин и быстро охлаждали до 2-8 °C. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 2О %-ном ПААГ. Гель высушивали с помощью вакуумной сушки, экспонировали на экран BAS CASSETTE 234О, информацию с экрана считывали на приборе FUJIFILM FLA 3ООО с помощью программы BASReader 3.14.
Анализ фрагментов ДНК с помощью масс-спектрометрии.
Биотинилированный ДНК-дуплекс IV/V формировали, как описано выше, для дуплекса I/II, обрабатывали ядерным экстрактом клеток и проводили очистку на стрептавидин-сефарозе. Cтрептавидин-сефарозу предварительно уравновешивали в буфере R (1ОО mM Tris-HCl (pH 7.5), 1О mM MgCl2, 1ОО mM HCl, О.1 мг/мл БCА). Для этого смешивали 1ОО мкл 5О %-ной суспензии стрептавидин-сефарозы
№ 3 2ОО9 I ACTA NATURAE | 135
Рис.1. Реакция удлинения прайме-ра без dGTP для метилированного олигодезоксирибонуклеотидного дуплекса, обработанного буфером для экстрактов (контроль) (1), ядерным экстрактом клеток линии СНO (2). Справа приведен фрагмент последовательности модельного олигодезок-сирибонуклеотидаI
и 200 мкл буфера R, инкубировали при слабом перемешивании в течение 10-15 мин. Стрептавидин-сефарозу осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3-4 мин, заменяли буфер и ресуспендировали. Вышеописанную процедуру повторяли 5 раз. К уравновешенной сефарозе добавляли 500 пмоль биотинилированного ДНК-дуплекса IV/V. Связывание дуплекса с сефарозой проводили при мягком перемешивании при 4 °С в течение 2-12 ч. После этого смолу промывали 6 раз 1 мл буфером R, как описано выше. Далее к реакционной смеси добавляли по 30 единиц эндонуклеаз рестрикции HindIII (MBI Fermentas, 10 ед./мкл) и Pvul (MBI Fermentas, 10 ед./мкл) и выдерживали при слабом перемешивании при 37 °С в течение 16 ч. Стрептавидин-сефарозу осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Полученные фрагменты разделяли электрофорезом в денатурирующем 20 %-ном ПААГ. Гель окрашивали SYBR Green в буферном растворе ТВЕ (100 мМ Tris-HCl, 100 мМ H3BO3, 2 мМ ЭДТА). Анализируемый фрагмент элюировали из геля согласно методике, описанной для праймера. Далее образцы концентрировали и обессоливали на ZipTip С18 (Millipore). Промывку сорбента проводили 50 мМ водным раствором цитрата аммония, олигонуклеотид элюировали 25 мМ раствором цитрата аммония в 50 %-ном ацетонитриле. На матрице для MALDI MS смешивали по 1 мкл образца, 0.5 мкл 50 мМ раствора цитрата аммония и 0.5 мкл раствора 3-гидроксипиколино-вой кислоты (Fluka, 20 мг/мл в ацетонитриле), полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов в линейной моде.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ВЫВОДЫ
Для изучения процесса деметилирования ДНК были сконструированы и синтезированы комплементарные олигоде-зоксирибонуклеотиды I и II, которые содержали по 3 остатка 5-метилцитозина в составе динуклеотидов 5'-mCpG, что
характерно для генома млекопитающих. Для защиты от нуклеаз, содержащихся в лизатах клеток, на выступающих З'-концах образующийся ДНК-дуплекс 1/11 имел защитные группы.
Для наблюдения за изменениями в последовательности нуклеотидов использовали реакцию удлинения праймера III, комплементарного З'-концевой области олигонуклеоти-да I. При проведении реакции в отсутствие в среде dGTP и в присутствии ddNTP удлинение праймера должно проходить до первого остатка 5-метилцитозина (дорожка 1, рис. 1). Обработка ДНК-дуплекса VII ядерным экстрактом клеток линии СНО приводит к появлению более длинных продуктов удлинения праймера (дорожка 2, рис. 1). Это явление можно объяснить превращением 5-метилцитозина в тимин, т.е. протеканием процесса дезаминирования при обработке ДНК-дуплекса VII экстрактом клеток СНО.
Для проверки этого предположения ДНК-дуплекс VII с тремя участками 5'-mCpG последовательно обрабатывали ядерным экстрактом клеток линий (СНО, HeLa или Skov3) и тимин-ДНК-гликозилазой, которая узнает Т^-мисматчи и разрезает цепь ДНК, содержащую Т (рис. 2, дорожки 2, 3, 4, соответственно). После разделения продуктов реакции на радиоавтографе геля наблюдается появление полос, соответствующих положению остатков 5-метилци-тозина, что свидетельствует об их дезаминировании.
Дезаминирование ДНК-дуплексов при обработке ядерными экстрактами клеток было показано методом MALDI MS. Для этого был использован олигодезоксирибонуклео-тидный дуплекс IV/V, содержащий динуклеотиды 5'-mCpG, участки узнавания эндонуклеаз рестрикции Ш^Ш и PvuI, фланкирующие анализируемый фрагмент (подчеркнут), а также остаток биотина на 5'-конце для возможности очистки ДНК-дуплекса на стрептавидин-сефарозе.
Размер анализируемого участка, содержащего три сайта 5'-mCpG, составляет 14 нуклеотидов, расчетная молекулярная масса - 4404,8 Да (рис. 3, а).
Спектры анализируемого фрагмента, полученного из ДНК-дуплекса после обработки ядерным экстрактом клеток линий (СНО, HeLa или Skov3), содержат сигнал 4408 Да (рис. 3, б-г), соответствующий дезаминированию трех остатков 5-метилцитозина.
Клеточные линии СНО, HeLa и Skov3 являются производными раковых клеток, в которых, как известно, наблюдается глобальное деметилирование всего генома. Возможно, наблюдаемое в результате обработки ядерными экстрактами клеток этих линий дезаминирование 5-метилцитозина
Рис. 2. Действие тимин-ДНК-гликозилазы на метилированный олиго-дезоксирибонуклеотид-ный дуплекс 1/11, обработанный буфером для экстрактов (контроль)
(1), ядерным экстрактом клеток линий СНO
(2), Ь^а (3), Skov3 (4). Стрелками обозначено положение образующихся фрагментов ДНК
х104 1.2
m/z
Рис. 3. Масс-спектры MALDI метилированного фрагмента ДНК, обработанного буфером для экстрактов (контроль) (а), ядерным экстрактом клеток линий СНO (б), Ь^а (в), Skov3 (г)
4000 4200 4400 4600 4800 m/z
4000 4200 4400 4600
m/z
4800
служит первой стадией процесса деметилирования ДНК у млекопитающих. Известно, что в эмбрионах рыб вида Danio rerio деметилирование ДНК является многоступенчатым процессом, включающим дезаминирование 5-метил-цитозина с помощью дезаминаз AID (Activation Induced deaminase)/Apobec (Apolipo-protein B RNA-editing catalytic component), удаление тимина с помощью гликозилазы MBD4 и BER-репарацию [4, 17]. В клетках млекопитающих существуют подходящие кандидаты из семейства цитозин-дезаминаз - AID и Apobec1, которые коэкспрессируются с полипотентными генами в ооцитах, эмбриональных зародышевых клетках и эмбриональных стволовых клетках [18]. Однако известно, что эти ферменты осуществляют де-заминирование только в одноцепочечных РНК (Apobec1) или ДНК (AID). Кроме того, AID и Apobec дезаминируют остатки цитозина намного эффективнее, чем 5-метилци-тозина. ДНК-метилтрансфераза Dnmt3b также может выполнять роль 5-метилцитозиндезаминазы в условиях низкой концентрации S-аденозилметионина (AdoMet) [19], но эта реакция проходит с очень низкой эффективностью, что делает маловероятным ее участие в глобальном деме-тилировании. Более того, концентрация AdoMet в клетке обычно достаточно высока.
Хорошим кандидатом на роль тимингликозилазы является гликозилаза MBD4, которая содержит метилсвязы-вающий и гликозилазный домен и обеспечивает удаление тимина из T/G-мисматча [20]. Хотя мыши с недостатком MBD4 жизнеспособны, у них чаще встречаются мутации в CpG-сайтах [21]. Однако MBD4 удаляет тимины из T/G-мисматчей с образованием апуриновых сайтов, которые
сразу разрезаются эндонуклеазой АР. В симметрично метилированных CpG-сайтах дезаминирование в обеих цепях ДНК должно приводить к образованию участка TG/ GT. Даже если MBD4 может узнать такой участок, то после действия эндонуклеазы АР должен образоваться двойной разрыв, что привело бы к потере генетического материала. Кроме того, MBD4 удаляет урацил из и^-мисматча быстрее, чем тимин из Т^ [20].
Известен и другой механизм деметилирования ДНК, который наблюдается у растений вида АгаЫйорз1з ЛаНапа и предполагает прямое удаление основания 5-метилцитози-на с помощью бифункциональных гликозилаз/лиаз (ROS1, DML2, DML3, DME) и последующую ВЕГ-репарацию [2225]. У млекопитающих существуют две подходящие гликозилазы на эту роль: тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) и метилсвязывающий белок MBD4. Однако и TDG, и MBD4 обладают слабой 5-метилцитозин-гликозилазной активностью по сравнению со способностью вырезать тимин [26]. Кроме того, активное деметилирование отцовского хроматина наблюдали в мышиных эмбрионах с нокаутированным геном mbd4 [21].
Следует также сказать о других теоретически возможных механизмах деметилирования 5-метилцитозина. Это прямое удаление метильной группы с образованием цито-зина и вырезание одного или более нуклеотидов, в составе которых есть 5-метилцитозин (ЫЕГ-репарация). У позвоночных существуют ортологи бактериальной деметилазы (оксидоредуктазы) А1кВ, осуществляющей прямое удаление метильной группы у 1-метиладенина и 3-метилци-тозина в прокариотах [2]. Однако нет никаких сведений о
№ 3 2009 | ACTA NATURAE | 137
том, что хотя бы один из ортологов может осуществлять деметилирование 5-метилцитозина. Также бактериальной А1кВ гомологично семейство гистоновых деметилаз (HDMs) [27], но ни одна из них не участвует в деметилировнии ДНК. Ранее в работе [28] было показано, что метилсвязывающий белок MBD2b может непосредственно удалять метиль-ную группу 5-метилцитозина с образованием С и метанола в качестве продуктов реакции. Однако этот результат не удалось воспроизвести в других лабораториях. Более того, мыши, лишенные MBD2b, имели нормальный фенотип и нормальный паттерн метилирования ДНК. Что касается механизма деметилирования ДНК через ПЕИ-репарацию,
то нет никаких данных, подтверждающих протекание такого процесса in vivo.
Таким образом, необходимо дальнейшее изучение деметилирования ДНК у млекопитающих для понимания механизма этого жизненно важного процесса. •
Данная работа была выполнена при содействии Благотворительного фонда поддержки научных исследований «Наука за продление жизни» и при
частичной поддержке гранта РФФИ 07-0400545. Авторы выражают благодарность д.х.н.
Серебряковой М.В. за проведение MALDIMS анализов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. // Nature. 2000. V. 403. P. 501-502.
2. Morgan H.D., Santos F., Green K., Dean W., Reik W. // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. P. 47-58.
3. Miller C.A., Sweatt J.D. // Neuron. 2007. V. 53. P. 857-869.
4. Rai K., Huggins I.J., James S.R., et al. // Cell. 2008. V. 135. P. 1201-1212.
5. Reiner S.L. // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. P. 41-46.
6. Bruniquel D., Schwartz R.H. // Nat. Immunol. 2003. V. 4. P. 235-240.
7. Kersh E.N., Fitzpatrick D.R., Murali-Krishna K., et al. // J. Immunol. 2006. V. 176. P. 4083-4093.
8. Northrop J.K., Thomas R.M., Wells A.D., Shen H. // J. Immunol. 2006. V. 177. P. 1062-1069.
9. Vanyushin B.F., Nemirovsky L.E., Klimenko V.V., Vasiliev V.K., Belozersky A.N. // Gerontologia. 1973. V. 19. P. 138-152.
10. Wilson V.L., Jones P.A. // Science. 1983. V. 220. P. 1055-1057.
11. Ehrlich M. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 5400-5413.
12. Feinberg A.P., Ohlsson R., Henikoff S. // Nat. Rev. Genet. 2006. V. 7. P. 21-33.
13. Wilson A.S., Power B.E., Molloy P.L. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1775. P. 138-162.
14. Kisseljova N.P., Kisseljov F.L. // Biochemistry (Mosc). 2005. V. 70. P. 743-752.
15. Jones P.A., Baylin S.B. // Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. P. 415-428.
16. Jones P. A., Laird P.W. // Nat. Genet. 1999. V. 21. P. 163-167.
17. Barreto G., Schafer A., Marhold J., et al. // Nature. 2007. V. 445. P. 671-675.
18. Morgan H.D., Dean W., Coker H.A., Reik W., Petersen-Mahrt S.K. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 52353-52360.
19. Metivier R., Gallais R., Tiffoche C., et al. // Nature. 2008. V. 452. P. 45-50.
20. Hendrich B., Hardeland U., Ng H.H., Jiricny J., Bird A. // Nature. 1999. V. 401. P. 301-304.
21. Millar C.B., Guy J., Sansom O.J., et al. // Science. 2002. V. 297. P. 403-405.
22. Gehring M., Huh J.H., Hsieh T.F., et al. // Cell. 2006. V. 124. P. 495-506.
23. Gong Z., Morales-Ruiz T., Ariza R.R., et al. // Cell. 2002. V. 111. P. 803-814.
24. Morales-Ruiz T., Ortega-Galisteo A.P., Ponferrada-Marin M.I., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 6853-6858.
25. Penterman J., Zilberman D., Huh J.H., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 6752-6757.
26. Cortazar D., Kunz C., Saito Y., Steinacher R., Schar P. // DNA Repair (Amst.). 2007. V. 6. P. 489-504.
27. Ozer A., Bruick R.K. // Nat. Chem. Biol. 2007. V. 3. P. 144-153.
28. Bhattacharya S.K., Ramchandani S., Cervoni N., Szyf M. // Nature. 1999. V. 397. P. 579-583.
