CC BY
1134
МЕХАНИЗМЫ
МОДИФИКАЦИОННОЙ
ИЗМЕНЧИВОСТИ
А. А. Пендина1, В.В. Гринкевич2, Т.В. Кузнецова1, B.C. Баранов1
'НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург; 2Санкт-Петербургский государственный университет
$3 Метилирование ДНК — один из основных механизмов эпигенетической наследственности эукариот. В обзоре кратко рассмотрены пути метилирования цитозина, распределение 5-метилцитозина в геноме, механизм инактивации генов, опосредованный гиперметилированием, роль метилирования в геномном импринтинге, при инактивации X хромосомы, в эмбриогенезе млекопитающих, а также в процессах канцерогенеза и в этиологии некоторых распространенных наследственных заболеваний человека.
Ключевые слова: метилирование ДНК, 5-метилцитозин, метила-за, импринтинг, онкогенез.
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК - УНИВЕРСАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ
ВВЕДЕНИЕ
Полная расшифровка генома человека, к сожалению, мало прояснила одну из основных проблем современной биологии — проблему реализации наследственной информации на разных стадиях онтогенеза. Вместе с тем именно благодаря программе Геном человека, доказавшей удивительное качественное и количественное сходство геномов разных организмов, особенно в пределах одного класса (к примеру, млекопитающие), стало очевидным, что в основе видовой специфичности, равно как и в процессах реализации наследственной информации в онтогенезе, решающая роль принадлежит процессам молекулярной и надмолекулярной регуляции функции генома. Их расшифровка составляет важный раздел современной генетики — функциональной геномики (протеомики). Нет, однако, сомнения в том, что процессы регуляции генной активности осуществляются при тесном взаимодействии эндогенных (ДНК) и экзогенных (внешняя среда) факторов. Очевидно и то, что экзогенные, в том числе и экологические факторы могут не только направлять работу генома, но в экстремальных вариантах нарушать дифференциальную активность генов, лежащую в основе онтогенеза. Следовательно, данная проблема является не только генетической, но имеет непосредственное отношение к экологической генетике.
Изменения дифференциальной экспрессии генов, наследуемые в ряду митотических делений клетки без нарушения нуклеотидной последовательности ДНК, называются эпигенетическими. В настоящее время описаны два Молекулярных эпигенетических механизма: модификация гистонов и метилирование ДНК. Метилирование — это обратимая ковалентная модификация ДНК, происходящая в результате присоединения метильной группы к углероду в 5-ом положении молекулы цитозина с образованием 5-метилцитозина. Метилирование ДНК широко представлено в геномах разных организмов, таких как бактерии, растения, насекомые и млекопитающие и имеет большое значение для их развития.
В начале 80-х годов была выявлена корреляция между характером экспрессии генов и степенью метилирования ДНК [17, 82]. Метилирование оказывает влияние на транскрипцию как через изменение эффективности связывания позитивных и негативных факторов транскрипции с регуляторными участками, так и непосредственно через формирование неактивных участков хроматина. Статус метилирования в клетке может изменяться под влиянием вредных экологических факторов, в частности, тяжелых металлов.
Так, внутриклеточное накопление никеля вызывает нарушение структуры гетерохроматина, что в свою очередь приводит к гиперметилированию ДНК и инактивации экспрессиии близлежащих генов [24]. Малые дозы кадмия вызывают ингибирование метилтрансферазы и ведут к гипометилированию ДНК. Однако при длительном воздействии кадмия наблюдается обратный эффект: активация метилтрансферазы и гиперметилирование ДНК [94]. Таким образом, эпигенетические изменения на уровне ДНК могут быть индуцированы внешней средой и быть одним из вариантов ответа организма на постоянно изменяющиеся факторы окружающей среды.
7. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 5-МЕТИЛЦИТОЗИНА. Срв ОСТРОВКИ
Основная часть молекул 5-метилцитозина находится в составе динуклеотидов 5'-СО-3' (СрС динуклеотиды). Их небольшое число представлено в последовательностях 5'-СрКрОр-3' или асимметричных последовательностях 5'-СрА-3' и 5'-СрТ-3' [79]. В процессе эволюции происходит постепенная элиминация СрС динуклеотидов, в результате чего их частота в геномах высших эукариот составляет 5-10% от теоретически ожидаемой [10]. Метилирование играет важную роль в этом процессе, так как потеря большинства Срв сайтов обусловлена превращением метилированного цитозина в тимин в результате спонтанного дезаминирования (рис. 1).
В геномах млекопитающих, в том числе у человека, 70-80% молекул цитозина в составе Срв динуклеотидов представлены 5-метилцитозином [10, 19]. Метилированные участки ДНК характерны для хроматина с соответствующим набором гистонов и нуклеосомной организацией, в состав которого входит поздно реплицирующаяся ДНК, труднодоступная для транскрипционных факторов. В таких участках СрО динуклеотиды расположены с час-
S-аденозинго-моцистеин ДНК метил-трансфераза
S-аденозил метионин
5-метилцитозин
Гч,щролитическое деаминирование
Метилирование ДНК Деамини-
С'
II
,с
,сн.
рование
(ияХ^
Репарация с помощью ДНК урацилгликозилазы
N
Тимидин
Репликация ДНК
тотой приблизительно 1:80. Для функционально активного хроматина более характерны участки ДНК (500-5000 н.п.), называемые CpG островками, плотность CpG динуклеотидов в которых в пять раз больше, чем в среднем по геному. Цитозин в таких участках в большинстве случаев находится в неметилированном состоянии. Хроматин CpG островков мало спирализован, отличается высокой степенью ацетилирования коровых гистонов, практически полным отсутствием гистона Н1 и слабо выраженной нуклеосомной организацией. Все эти особенности строения ДНК эухроматина позволяют ему активно взаимодействовать с транскрипционными факторами [97]. Согласно последним данным, в геноме человека насчитывается около 29 000 CpG островков, которые в основном расположены в промоторных областях и/или эк-зонах всех генов «домашнего хозяйства» — house keeping genes и некоторых тканеспецифичных генов [22, 101].
2. ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ
Основными ферментами, обеспечивающими процесс метилирования в эукариотической клетке, являются метилтрансферазы. На сегодняшний день идентифицировано три метилтрансферазы: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B. Ген метилтрансферазы-1 (Dnmtl), клонированнный более 15 лет назад у лабораторной мыши, является высоко консервативным [13]. В дальнейшем ортологи гена Dnmtl были идентифицированы у различных видов, в том числе и у человека (DNMT1) [107]. Продукт гена Dnmtl поддерживает метилированное состояние ДНК в делящихся клетках. Метилируя вновь синтезированную ДНК, метилтрансфераза-1 обеспечивает воспроизведение родительского варианта метилирования в дочерних цепях ДНК после каждого раунда репликации (рис. 2). Отсутствие фермента приводит к снижению общего уров-
Поддерживающее
метилирование
Dnmtl
Рис. 1. Схема взаимного превращения цитозина и 5-метилцитозина и их мутационные изменения
Dnmt3a, Dnmt3b
Рис. 2. Метилирование de novo и сохранение родительских схем метилирования в раундах репликации
ня метилирования в клетках и к гибели эмбрионов [58]. Однако эмбриональные стволовые клетки таких мышей жизнеспособны и сохраняют способность к метилированию de novo благодаря наличию других метилаз [56]. Именно к таким метилазам относятся ферменты Dnmt3a и Dnmt3b [73]. Совместное действие метилаз приводит к метилированию динуклеотидов CpG в не- и полуметили-рованной ДНК in vitro [72] (рис. 2).
Мутации в гене DNMT3B, приводящие к инактивации каталитического домена фермента, идентифицированы у пациентов с синдромом ICF — аутосомно-доминантным заболеванием, основным клиническим признаком которого являются лицевые аномалии, дефицит IgA и Т клеток, сопутствующие инфекции и склонность к злокачественным новообразованиям. Цитогенетической особенностью синдрома является нестабильность центромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 и реже 2 и 10, возникающая вследствие их гипомети-лированного состояния [105].
3. МЕХАНИЗМЫ ИНАКТИВАЦИИ ГЕНОВ ПОСРЕДСТВОМ МЕТИЛИРОВАНИЯ
В настоящее время считается, что метилирование ДНК является одним из основных способов регуляции экспрессии генов. При этом предполагается наличие двух основных механизмов транскрипционного блока (рис. 3) [18, 63].
Первый состоит в том, что 5-метилцитозин ингибирует связывание с ДНК некоторых факторов транскрипции (АР-26 с-Мус/Муп, цАМР-зависимый активатор CREB, E2F NF-kB), мишенями для которых являются последовательности, содержащие CpG нуклеотиды. Следует, однако, отметить, что ряд транскрипционных факторов (Spl, CTF) не чувствительны к метилированию, поскольку они связываются с участками ДНК, не имеющими CpG динуклеотиды (рис. 3.1) [96].
В реализацию второго механизма вовлечены белки и белковые комплексы, которые специфично связываются с метилированными CpG динуклеотидами и ингибируют присоединение к ДНК факторов транскрипции (рис. 3.2) [40, 63]. Основная роль в этом процессе принадлежит метилцитозинсвязывающему комплексу (МЦСК), состоящему из 5 основных белков: MBD 1—4 и МеСР2. Все белки этого комплекса, за исключением MBD4, выполняют функцию репрессоров путем изменения структуры хроматина. Белок MBD4 участвует в репарации и предотвращает мутационные изменения метилцитозина [39].
МеСР2 является основным репрессирующим белком комплекса. Этот белок связывается с одиночными CpG динуклеотидами. При этом репрессорный эффект распространяется на несколько сот пар нуклеотидов. Белок состоит из двух доменов: метилцитозинсвязыва-ющего (MBD), отвечающего за узнавание 5-метилци-
тозина, и репрессорного (TRD), имеющего сродство к гистондеацетилазе и обеспечивающего репрессию транскрипции [62]. Известно, что примерно 20% общего ацетилирования гистонов определяется взаимодействием ацетилаз с белком МеСР2. Многие регуляторы транскрипции осуществляют свои функции путем деа-цетилирования/ацетилирования гистонов. По всей видимости, именно деацетилирование гистонов лежит в основе инактивации гетерохроматина. При помощи специфических антител было установлено, что белок МеСР2 локализован преимущественно в G-сегментах гетерохроматина метафазных хромосом. Эмбрионы мыши, гомозиготные по делеции гена МеСР2, погибают до рождения, что указывает на важную роль белка МеСР2 в эмбриональном развитии [95].
У человека мутация в гене МЕСР2, локализованном на Х-хромосоме, приводит к развитию прогрессирующего нейродегенеративного заболевания — синдрому Ретта. Характерные симптомы заболевания проявляются у девочек в возрасте от 6 до 18 месяцев в виде прогрессирующей умственной отсталости с утратой речевых способностей, аутизма и атаксии. Мальчики с мутацией этого гена нежизнеспособны и, как правило, умирают вскоре после рождения [9].
MBD2 является вторым метилцитозинсвязываю-щим белком. Этот белок, как и гистондеацетилазы HDAC1, HDAC2 и гистонсвязывающие белки RbAp46, RbAp48, входит в состав комплекса MeCPl, обладающий невысокой способностью к взаимодействию с метилированной ДНК. Для связывания с ДНК ферменту необходимо несколько CpG динуклеотидов. Учитывая слабое сродство этого комплекса к метилированной
1. Прямое взаимодей- 2. Специфические транскрип-ствие с транскрипцион- ционные репрессоры ным фактором
1 Взаимодействие ТФс ДНК невоз-V можно!
©
сн.сн.сн. сн.сн.
,__lililí,
Примеры ТФ:
Чувствительные к метилированию АР-2, E2F, NFkB, CREB, Myc/Myn Нечувствительные к метилированию SP-1, CTF
Рис. 3. Возможные механизмы репрессиии транскрипции посредством изменения метилирования цитозина (цит. по Singal, Cinder, 1999)
---►
i i
Репрессия л л Репрессия посредством/У NX посредством МеСР-2 ^ МеСР-1
© &
ДНК, предполагается, что он выполняет вспомогательные функции в процессе генной репрессии [67].
В настоящее время установлено, что для репрессии транскрипции необходимы как метилирование ДНК, так и деацетилирование гистонов. Остается, однако, неясным, что является первичным: определяет ли метилирование ДНК изменения в компактизации хроматина, либо изменения в упаковке хроматина маркируют участки ДНК, где должно происходить метилирование de novo (рис. 4). Нет сомнения в том, что специфические последовательности ДНК могут взаимодействовать с метил-трансферазами, обеспечивающими метилирование de novo. Следствием этого является связывание с ДНК ме-тилцитозинсвязывающих белков и гистонацетилазного комплекса, что приводит к стабилизации хроматина и невозможности присоединения к ДНК транскрипционного комплекса (рис. 4а). С другой стороны, сама структура хроматина может определять последовательности ДНК, которые должны подвергаться метилированию de novo (рис. 46). Большинство авторов считает, что вначале осуществляется метилирование определенных последовательностей ДНК, а затем изменяется структура хроматина, в состав которого они входят [66, 81]. Вполне вероятно, что обе программы дополняют друг друга, обеспечивая в процессе клеточной дифференцировки как длительное (перманентное) выключение крупных информационных блоков активного хроматина (конформацион-
ные изменения), так и более лабильное (транзиторное) выключение отдельных генов (метилирование).
4. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ
Метилирование ДНК, влияя на функциональную активность генов и на конформацию хроматина, вовлечено во множество процессов, происходящих в клетке. Так, показана важная роль метилирования в регуляции экспрессии тканеспецифичных генов, в клеточной дифференци-ровке, репликации ДНК, в процессах репарации ДНК и поддержания геномной стабильности [8]. Предполагается, что метилирование играет важную роль в защите генома от мобильных генетических элементов [14, 70], а также в инактивации «чужеродных» генов, доставленных в клетки в целях коррекции наследственных дефектов. Метилирование в районах с малой плотностью генов, в частности, в участках прицентромерного гетерохроматина, по всей видимости, важно для стабилизации структуры, поддержания конформации и целостности хромосом [26]. В то же время метилирование цитозина в составе СрО динуклеотидов в промоторных участках генов в большинстве случаев подавляет экспрессию. Наиболее подробно механизмы репрессии генов, обусловленные метилированием, изучены в отношении такого феномена, как геномный импринтинг — одного из вариантов эпигенетической
а)
б)
Метилаза
S \
'ГЧГТ
5-метилцитозин
iñfhír
Метилирование de novo
Метилированная ДНК
МЦСК
Присоединение МЦСК
Присоединение
деацетилазного
комплекса
Деацетилированный
конденсированный
хроматин
Гистоновый кор
'(níntr
Деацетилазный комплекс
Метилаза ► *
Присоединение деацетилазного комплекса
Метилирование de novo
Метилированная
ДНК
Присоединение МЦСК и стабилизирующего хроматин комплекса
Рис. 4. Взаимосвязь между метилированием цитозина в молекуле ДНК и ацетилированием гистонов: а — метилированные участки ДНК определяют локализацию сайтов связывания деацетилазного комплекса; б — присоединение деацетилазного комплекса детерминирует участки, в которых должно происходить метилирование ДНК (№\уе11-Рпсе е1 а1., 2000)
наследственности, при котором специфический характер дифференциальной активности генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы [1,2].
5. МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И ГЕНОМНЫЙ ИМПРИНТИНГ
У млекопитающих, насекомых и цветковых растений отцовские и материнские гены могут обнаруживать дифференциальную активность уже на ранних стадиях онтогенеза. При этом наблюдается видимое искажение менделевских правил наследования отдельных признаков. В участках генома, подверженных импринтингу, экспрессируется только одна аллель — отцовская или материнская. Иными словами, экспрессия импринтирован-ного гена в организме-потомке определяется его родительским происхождением, то есть зависит от того, передается ли он геномом спермия или яйцеклетки. Данные по геномному импринтингу у человека были суммированы на конференции National Institute of Child Health (USA) [102]. Они подробно рассмотрены в ряде отечественных обзоров и сборников [4, 6, 7].
Природа этого явления в настоящий момент остается неясной. Однако доказано, что в механизме импринтинга основная роль принадлежит модификации белков хроматина и ДНК определенных генов, в частности, процессам ацетилирования гистонов и метилирования ДНК. Механизм импринтинга в родительских половых клетках, его сохранение в клетках эмбриона и роль в дифференциальной активности генов долгое время оставались неясными. В последние годы в изучении геномного импринтинга достигнут ряд серьезных успехов: 1) определены cis-последовательности, играющие важную роль в контроле импринтинга; 2) установлено время появления и элиминации импринтов в половых клетках; 3) описана динамика метилирования импринтированных генов в пре- и постнатальном периодах онтогенеза; 4) обнаружена кластерная локализация импринтированных генов в геноме; 5) показана асинхронность их репликации.
Важнейшие события, связанные с геномным имприн-тингом, происходят еще в гаметогенезе. При этом как в мужских, так и в женских гаметах вначале происходит стирание (удаление) предсуществующих импринтов, унаследованных от родителей, а затем в их геномах устанавливаются новые импринты в соответствии с полом особи.
Для развивающихся половых клеток характерна последовательная смена двух событий: глобальное деметилирование ДНК и ее реметилирование. К 12-13 дням эмбрионального развития мыши ДНК первичных половых клеток находится в неметилированном состоянии независимо от пола зародыша. К 15-16 дням развития происходит реметилирование большинства нуклеотидных последовательностей генов (за исключением CpG островков). При этом различия в характере метилирования отцовских
и материнских хромосом сохраняются только в нуклеотидных последовательностях некоторых генов [47, 86].
Следует отметить, что общее деметилирование, характерное для ранних стадий развития половых клеток, касается также и всех импринтированных генов [20]. Так, на 12,5 день развития гены, для которых характерен эффект импринтинга (Igf2r, p57Kip2, Pegl, Peg3, Snrpn, U2afrsl), в первичных половых клетках находятся в неметилированом состоянии [20, 93]. При слиянии первичных половых клеток с лимфоцитами процесс деметилирования распространяется как на импринтиро-ванные, так и на неимпринтированные гены дифференцированных клеток [92]. Единственная последовательность, которая, по-видимому, может избегать общего деметилирования в раннем развитии половых клеток, — это 5' район гена Xist, ответственный за инактивацию одной из Х-хромосом у зародышей женского пола, необходимой для компенсации дозы генов [80].
В процессе оогенеза метилирование геномной ДНК de novo происходит на стадии роста ооцитов вскоре после рождения. Это было показано для некоторых повторяющихся последовательностей и для гена Igf2r [20], а также трансгенов — чужеродной ДНК, включенной в геном ооцита [21].
Время установления импринтинга генов в мужских половых клетках точно не выяснено. По всей видимости, метилирование генов Н19 и Igf2 устанавливается вскоре после рождения, о чем косвенно свидетельствует высокий уровень метилтрансферазы Dnmtl в ядрах сперматогоний.
После оплодотворения и вплоть до стадии бластоцисты происходит глобальное деметилирование генома зародыша, то есть импринты мужских и женских геномов стираются. У мыши однокопийные гены деметилируются в течение первых делений дробления и остаются гипомети-лированными до стадии поздней гаструлы. Импринтиро-ванные сайты мужского генома деметилируются к 8-кле-точной стадии. Гаметический импринтинг полностью стирается уже на стадии морулы (8-16 бластомеров) [61]. Тотальное деметилирование на начальных стадиях дробления, по-видимому, отражает процесс дедифференциров-ки геномов мужского и женского пронуклеусов и приобретение бластомерами дробящегося зародыша плюриопо-тенгного состояния. Происходящая на стадии морулы компактизация зародыша ведет к первичной дифференци-ровке на внутреннюю клеточную массу и трофэктодерму и сопровождается быстрой утратой тотипотентности клеток трофобласта. Дальнейшая дифференцировка клеток внутренней клеточной массы с образованием трех зародышевых листков сопровождается установлением определенного для каждого из них характера метилирования. Таким образом, путем изменения метилирования происходит активация одних и инактивация других комплексов генов, в результате чего формируется импринт, необходимый для обеспечения нормального развития целого зародыша и его отдельных зачатков [34, 61, 83].
Стадия бластоцисты характеризуется началом тотального метилирования ДНК de novo. Предположительно, метилирование происходит в период с 5,5 по 6,5 день развития, то есть вскоре после имплантации. К 6,5 дню все однокопийные гены, не содержащие CpG островки, уже метилированы. В то же время гены, содержащие CpG островки, гомеобоксные гены и активные аллели импринти-рованных генов на этой стадии избегают метилирования de novo. Дефинитивный характер метилирования для этих генов устанавливается на более поздних стадиях развития.
Первичные половые клетки, то есть клетки будущих дефинитивных гамет, избегают метилирования de novo вплоть до момента заселения гонад (у мышей — 11,5 день развития). Метилирование в этих клетках происходит только после 14-го дня развития [83].
Аллель-специфический паттерн метилирования, установленный еще в эмбриональный период, сохраняется в соматических клетках взрослых индивидов. Так, в культивируемых фибробластах функционирует только отцовская аллель гена Igf2, тогда как материнская аллель экспрессируется, если только в культуру клеток добавляют ингибитор метилтрансферазы — 5-азадеоксицитидин [29].
Изменения эпигенотипа, приводящие к ослаблению или нарушению установившегося импринтинта, способствуют развитию патологических состояний клетки, в частности, ее злокачественному перерождению. В этой связи особый интерес представляет изучение молекулярных механизмов установления и поддержания ал-лель-специфичного метилирования.
В настоящее время предполагается существование, по крайней мере, двух возможных механизмов узнавания мест геномного импринтига. Согласно одному из них, прямые тандемные повторы, находящиеся в CG обогащенных последовательностях и ассоциированные с районами дифференциального метилирования, могут являться молекулярными маркерами импринтированных генов. Действительно, при изучении первичной структуры импринтированных генов было установлено, что большинство из них содержат в своих регуляторных областях прямые тандемные повторы. Сравнительный анализ таких повторов не позволил выявить существенной гомологии их последовательностей. Однако высокое содержание гуанина, сходная протяженность и характерная локализации по отношению к кодирующей части гена позволили предположить, что эти последовательности могут исполнять роль молекулярных маркеров импринтированных генов. По всей видимости, такие повторы могут формировать альтернативные вторичные шпилечные структуры ДНК или специфичные хроматиновые домены, которые, в свою очередь, могут маркировать участки, в которых будет происходить метилирование de novo в гаметах или в клетках зародыша [23].
Согласно второму механизму, важная роль в экспрессии импринтированных генов принадлежит транскриптам
импринтированных аллелей. Рассмотрим этот механизм на примере одного из трех генов, для которых доказано существование антисмысловых транскриптов. Так, для материнской аллели гена ^12г у мыши показан синтез ан-тисмыслового транскрипта, функция которого заключается в подавлении в аз-положении экспрессии отцовской аллели \gf2r, что приводит к моноаллельной экспрессии гена [104]. Мутации, нарушающие синтез такого анти-смыслового транскрипта, приводят к экспрессии отцовского гена ^12г [57]. Предполагается, что антисмысловой РНК-транскрипт может подавлять экспрессию отцовской аллели в ах-положении несколькими способами: путем прямого присоединения к отцовской аллели (такой механизм «окутывания» доказан при инактивации Х-хро-мосомы) (1), блокированием промотора \gflv при транскрипции в обратном направлении (2) или в результате конкурентного связывания транскрипционных факторов (3).
6. ИНАКТИВАЦИЯ Х-ХРОМОСОМЫ
Ярким примером регуляции активности генов, ключевым звеном которого является нетранслируемый транскрипт, может служить инактивация Х-хромосомы в соматических клетках самок млекопитающих. Процесс инактивации начинается на определенном участке, получившим название «центра инактивации Х-хромосомы», в котором картирован ген Х1б1 (Х-инактивирующий специфический транскрипт), кодирующий транскрипт размером 15-17 т.п.о. Ген Х1б1 имеет три промотора: Р1,Р2 и РО. Если транскрипция осуществляется с промоторов Р1 и Р2, то образуется стабильный транскрипт размером 15 тыс. п.о., если же с промотора РО — возникает нестабильный продукт. Переключение транскрипции с промотора РО на Р1/Р2 коррелирует с началом процесса инактивации Х-хромосомы. Накопление специфических стабильных РНК-транскриптов по длине Х-хромосомы ведет к образованию так называемой «РНКовой шубы», которая постепенно покрывает Х-хромосому и детерминирует ее инактивацию. В функционально активной Х-хромосоме ген Х1б1 инактивирован, что детерминировано метилированием Срй динуклеотидов в последовательности 5'-ОСОССОССО-З' (от -44 до —36), расположенной в его промоторной области [34]. Наличие или отсутствие метилирования этого участка определяет активность гена Х1э1 на доимплантационной стадии развития. Показано, что после обработки культивируемых клеток 5-азацити-дином, нарушающим процесс метилирования, происходит частичная реактивация генов Х-хромосомы, что свидетельствует о значимой роли метилирования в создании и поддержании инактивированного состояния Х-хромо-сомы [61]. У эмбрионов мыши в доимплантационный период (3,5—4 день развития) в трофэктодерме и в первичной эндодерме наблюдается импринтированная экспрессия гена XIв!, причем инактивируется преимущественно
отцовская аллель. Для клеток самого зародыша характерна случайная инактивация Х-хромосомы как отцовской, так и материнской.
7. БОЛЕЗНИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ НАРУШЕНИЯМИ МЕТИЛИРОВАНИЯ
Выше (см. раздел 2) уже упоминалось о двух сравнительно частых моногенных заболеваниях (синдром КТ и синдром Ретта), которые обусловлены мутациями в генах метилтрансфераз. На сегодняшний день имеются сведения о более 30 заболеваний, в основе которых лежат нарушения метилирования ДНК, приводящие к аномалиям процесса импринтинга и, как следствие, к «болезням импринтинга» [3, 5, 8]. В основу классификации болезней импринтинга может быть положен уровень организации генетического материала (геном, хромосомы, гены), на котором проявляется эффект геномного импринтинга [6]. Нарушения на уровне целого генома приводят к развитию хорионэпителиомы — злокачественной опухоли, возникающей при беременности из клеток трофо-бласта, несущих только отцовский геном, т. е. являющихся продуктом диспермного оплодотворения (андрогене-за). На хромосомном уровне — это случаи патологии развития до (плацентарная недостаточность) и после рождения (хромосомные болезни), обусловленные полной или частичной однородительской дисомией хромосом или их сегментов, содержащих импринтированные гены. Импринтированные гены обнаружены на многих хромосомах человека — 1, 5, 6, 11, 14, 15, 19, 20, X. Два больших кластера импринтированных генов обнаружены на хромосомах 1 и 15. Патологический эффект импринтин-
га, связанный с однородительскои дисомиеи, описан для хромосом 1,2,4-11,13-16,19,20,22, X. На генном уровне наиболее яркими примерами являются синдром Пра-дера Вилли и синдром Ангельмана, обусловленные мутациями, либо нарушениями функций в кластере импринтированных генов в проксимальной части длинного плеча хромосомы 15. Предположительно с феноменом геномного импринтинга связывают особенности наследования таких сравнительно частых заболеваний, как маниакально депрессивный психоз, хорея Гентингтона, шизофрения, аутизм, миотоническая дистрофия.
8. РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ В ОНКОГЕНЕЗЕ
Роли метилирования (импринтинга) в процессах канцерогенеза посвящена обширная литература [31, 33, 49; 54, 71, 76, 78, 100]. Сохранение статуса метилирования ДНК, характерного для каждого типа клеток, важно для обеспечения их нормальной жизнедеятельности и функции. Вместе с тем в настоящее время накапливается все больше фактов, показывающих, что нарушение характера метилирования может играть существенную роль в процессах трансформации нормальных клеток в опухолевые. Изменения статуса метилирования цитозина широко распространены при спорадических раковых заболеваниях человека, характеризующихся гипометилированием на уровне генома и локальным аберрантным гиперметилированием СрО островков [99]. При этом оба эти процесса, одновременно происходящие в разных районах генома, могут предшествовать озлокачествлению. Важная роль в онкогенезе принадлежит спонтанному дезаминированию 5-метилцитозина в определенных райо-
1. Точковые мутации
СНзСНз
СНзСНз
V
Спонтанное
дезамини-
рование
СНзСНз ► СНз
L L
Примеры:
р53
2. Активация протоонкогена
СНзСНз
-Нт-
-х-
СНзСНз
-4г4г-
Гипометилиро-
вание
V
|ТФ
О О’
Активная
транскрипция
Примеры: bcl-2 в CLL, K-Ras в опухолях легкого и прямой кишки
3. Инактивация опухолевых супрессоров
Активная
транскрипция
V
СНз СНз
-4г-4г-
-х-
СНзСНз
-Ь-Ь-
Гиперметилиро -вание
Примеры: ЯЬ в ре-тинобластоме, р16 в солидных опухолях, р 15 при лейкемии имиеломе
Рис. 5. Предполагаемое значение спонтанного деаминирования 5-метилцитозина, гипометилирования и гиперметилирования в онкогенезе (цит. по Singal, Ginder, 1999)
нах генов, который приводит к точковым мутациям — заменам С на Т (рис. 5.1). 24% мутаций в гене опухолевого супрессора белка р53 составляют замены С на Т в динуклеотидах CpG, что является одной из причин, детерминирующих образование солидных опухолей [33, 36]. Известно, что в гене р53 содержится около 290 CpG динуклеотидов. При этом точковые замены в 23 CpG динуклеотидах, расположенных в районе, кодирующем ДНК-связывающий домен, составляют треть от общего числа мутаций в этом гене [55]. Установлена определенная зависимость между расположением «горячих точек» мутаций и локализацией опухоли. Так, мутационные изменения в кодонах 175, 248, 273 гена р53 характерны только для опухолей молочной железы, яичника и для лейкемии [43], а в кодоне 157 они встречаются лишь в клетках опухолей легкого курящих пациентов [75].
Существует три гипотезы, объясняющие роль в индукции злокачественных образований, — активация протоонкогенов (1), хромосомная нестабильность (2) и активация латентных ретротранспазонов (3) [33]. При этом уровень злокачественности в определенной мере коррелирует со степенью метилирования геномной ДНК [77, 91].
1. Гипометилирование приводит к изменению транскрипционной активности многих онкогенов, таких как протоонкоген K-ras в опухолях легкого и толстой кишки [30], опухолевый супрессор 14-3-3 {sigma} [15], p21CIPl/WAFl/SDIl [84] (рис. 5.2). Взаимосвязь между гипометилированием и изменением генной экспрессии показана для антиапоптотического гена bcl-2 при хронической лимфоцитарной лейкемии В-клеток [38].
2. Следствием гипометилирования, по-видимому, может быть и нестабильность хромосом. Так, в нормальных соматических клетках прицентромерные районы гетерохроматина на хромосомах 1 и 16 гиперметилирова-ны, в то время как в клетках аденокарциномы молочной железы и опухоли эпителия яичников эти районы хромосом гипометилированы и обнаруживают повышенную ломкость [64, 77].
3. В некоторых случаях локальное гипометилирование ДНК приводит к транскрипционной активации ретротранспозонов [32, 90]. Для генома человека наиболее характерны ретротранспозоны LINE'S. Их насчитывается около 100 тыс., причем активны из них только 30-60 [87]. В клетках опухолей происходит активация промоторов LINE'S в результате их деметилирования и, как следствие, активация транскрипции [32, 90] с последующим перемещением LINE's в кодирующую часть генов, регулирующих процессы пролиферации или репарации [60].
Важную роль в опухолевой трансформации нормальных клеток может играть и процесс гиперметилирования, особенно если он затрагивает промоторные области генов онкосупрессоров (рис. 5.3). Ген ретинобластомы pRb был первым из множества генов, для которых была дока-
зана взаимосвязь между гиперметилированием их промоторов и инактивацией транскрипции [37]. Такой же механизм регуляции характерен и для генов, контролирующих клеточный цикл (RB [88], pl4ARF [108], CDKN2A [45], CDKN2B [68], р27/К1Р1 [103]), дифференцировку (MYOD [46], WT1 [59], РАХ6 [85]), апоптоз (DAP kinase [50], CASP8 [98]), репарацию ДНК (hMLHl [25, 106]), устойчивость к наркотическим веществам и детоксикацию (GSTP1 [27], MDR1 [48]), метастазирование (E-cad-herin [35, 65]) и т. д. Нередко гиперметилирование про-моторной области генов коррелирует с увеличением уровня активности ДНК-метилтрансфераз, что ведет к стабильному выключению функций онкосупрессоров, а также генов, контролирующих клеточную пролиферацию или апоптоз [51].
Изучение статуса метилирования в ряде случаев рассматривается как вспомогательный метод в диагностике и лечении раковых заболеваний человека. Например, гиперметилирование главного промотора онкосупрессора BRCA1 обнаружено исключительно в клетках опухоли молочной железы и яичника, но не в промоторе соответствующего гена при раке прямой кишки или лейкемии [16]. Обширная информация на эту тему накоплена в отношении генов р 15, р16, VHL [41, 42].
Сегодня не вызывает сомнения, что изменение статуса метилирования может предшествовать началу опухолевой трансформации нормальных клеток при многих раковых заболеваниях. Считается, что дефекты метилирования, обусловленные действием различных эндогенных и экзогенных факторов в сочетании с пред-существующими мутациями онкогенов и онкосупрессоров, создают согласно известной «двухударной гипотезе» Кнудсенна [53] необходимый толчок к бласттранс-формации и злокачественному росту [4]. Установление этого факта послужило толчком для разработки многочисленных генетических тестов в целях ранней диагностики и выяснения прогноза онкологических заболеваний [8]. Например, метилирование промотора онкосу-прессорного гена р16 рассматривается как биомаркер ранних стадий рака легкого [12, 69, 74]. Установление статуса метилирования генов WIT1, DAP, MGMT используется для предсказания возможного ответа клеток опухоли на химиотерапию или для прогнозирования течения заболевания [28, 52].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время накоплено много фактов, свидетельствующих о важной роли метилирования в таких сложных процессах, как функциональная активность генов, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, клеточная пролиферация, репарация ДНК и онкогенез. Убедительно доказана роль метилирования в детерминации моноаллельной экспрессии импринтированных ге-
нов. В экспериментах на мышах подробно изучена динамика деметилирования - реметилирования генома в половых клетках и на ранних стадиях развития зародышей; предложены гипотезы, объясняющие сохранение имприн-тов в онтогенезе и важную роль геномного импринтинга в процессах дифференцировки эмбриональных зачатков и органов. Не вызывает сомнения большой вклад дефектов процесса метилирования в возникновение многих хромосомных и генных болезней человека, особенно болезней с необычным, неменделевским типом наследования.
В исследованиях последних лет особенно большое значение придается изучению процесса метилирования в происхождении онкологических заболеваний, их ранней диагностики и лечения. Активация протоонкогенов в сочетании с инактивацией онкосупрессоров, аберрации хромосом и дефекты их сегрегации, связанные с ошибками метилирования ДНК de novo, в настоящее время рассматриваются как предраковые состояния, следствием которых может быть злокачественное перерождение и прогрессия опухоли. Анализ изменений характера метилирования ДНК имеет важное прогностическое значение для ранней диагностики и лечения рака. Направленное изменение метилирования ДНК в опухолевых клетках могло бы явиться одним из способов коррекции их дисфункции. Для реализации этого направления необходимо дальнейшее изучение факторов, регулирующих специфичность процессов метилирования и деметилирования.
Литература
1. Баранов В. С. Хромосомный импринтинг и хромосомные взаимодействия в раннем развитии млекопитающих // Успехи современной биологии. — 1988. — Т. 105, № 3. — С. 393^405.
2. Баранов В. С. Хромосомный импринтинг и наследственные болезни // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7. — С.73-79.
3. Гинтер Е.К. Медицинская генетика. — М.: Медицина, 2003. — 447с.
4. Залетаев. Д.В., Немцова М.В., Бочков Н.П. // Метилирование ДНК как этиологический фактор канцерогенеза // Вестник РАМН. — 2002. — № 4. — С. 6-11.
5. Козлова С.И., Дашкова Н.С., Семанова E., Блинникова O.E. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. — М.: Практика, 1996. — 410 с.
6. Назаренко С.А. Нарушение эпигенетической регуляции активности генов и болезней человека // Вестн. РАМН. — 2001. — № 10. — С. 43^8.
7. Нелщова М.В. Геномный импринтинг и наследственная патология // Молекулярная биология. — 2000. — Т. 34, № 4. — С. 554-560.
8. Немцова М.В. Нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов как новый класс молекулярной патологии. Автореф. ... канд. биол. наук // М., 2002. — 48 с.
9. Amir R.E., Van der Veyver LB., Wan M. et al. Rett syndrome is causcd by mutations in X-linkcd MECP2, encoding mcthyl-CpG-binding protein 2 // Nat Genet. — 1999. — Vol. 23. — P. 185-188.
10. Antequera F., Bird A. CpG islands // EXS. — 1993. — Vol. 64. — P. 169.
11. Antequera E, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse // Proc Natl Acad Sei USA. — 1993. — Vol. 90. — P. 11995.
12. Belinsky S.A., Nikula K.J., Palmisano W.A. et al. Aberrant méthylation of p 16(lNK4a) is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis // Proc Natl Acad Sei USA. — 1998. — Vol. 95, N20, —P. 11891-11896.
13. Bestor T., Laudano A., Mattaliano R„ Ingram V. Cloning and sequencing of a cDNA encoding DNA mcthyltransferasc of mouse cells. The carboxyl-terminal domain of the mammalian enzymes is related to bacterial restriction mcthyltrasfcrascs // J. Mol. Biol.— 1988. — Vol. 203, —P. 971.
14. Bestor T.H. The host defencc function of genomic méthylation patterns // Novartis Found Symp. — 1998. — Vol. 214. — P. 187-95, discussion 195-199.
15. BhatiaK, Siraj A. K, Hussain A. etal. The tumor suppressor gene 14-3-3{sigma} is commonly methylated in normal and malignant lymphoid cells//Cancer Epidemiol. Biomarkers Prcv. — 2003. — Vol. 12, N 2. — P. 165-169.
16. Bianco T., Chenevix-Trench G., Walsh D.C. et al. Tumour-specific distribution of BRCA1 promoter region méthylation supports a pathogcnetic role in breast and ovarian cancer // Carcinogenesis. — 2000. — Vol. 21, N2, —P. 147-151.
17. BirdA. The essentials ofDNA méthylation //Cell. — 1992. — Vol. 70 — P. 5-8
18. Bird A.P., Wolffe A.P. Mcthylation-induccd repression — belts, braces, and chromatin // Cell. — 1999. — Vol. 99. — P. 451^154.
19. Bird A.P. Gene number, noise reduction and biological complexity // Trends Genet. — 1995. — Vol. 11, N 3. — P. 94—100.
20. Brandeis M., Kafri T., Ariel M., et al. The ontogeny of allele-specific méthylation associated with imprinted genes in the mouse // EMBO J. — 1993. — Vol. 12. — P. 3669-3677.
21. Chaillet J.R., Vogt T.F., Beier D.R. and Leder P. Parental-specific mcthylation of an imprinted transgcne is established during gamcto-gencsis and progressively changes during cmbryogencsis // Cell. —
1991, —Vol. 66, —P. 77-83.
22. Consortium Ihgs. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. — 2001. — Vol. 860. — P. 860-921.
23. Constancia M, Pickard B, Kelsey G, Reik W. Imprinting mechanisms // Genome Res. — 1998. — Vol. 8. — P. 881-900.
24. Costa M, Yan Y, Zhao D, Salnikow K. Molecular mcchanisms of nickel carcinogcnesis: gene silencing by nickel delivery to the nuclcus and gene activation/inactivation by nickcl-induccd cell signaling // J. Environ Monit. — 2003. — Vol. 5, N 2. — P. 222-223.
25. Deng G.R., Chen A.D., HongJ. et al. Mcthylation of CpG in a small region of the hMLHl promoter invariably correlates with the absence of gene expression // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59. — P. 2029-2033.
26. Ehrlich M. DNA mcthylation: normal development, inhcreired diseases and cancer // J. Clin Ligand Assay. — 2000. — Vol. 23. — P. 144-146.
27. Esteller M., Corn P.G., UrenaJ.M., etal. Inactivation of glutathione S-transferasc P1 gene by promoter hypermethylation in human neoplasia // Cancer Res. — 1998. — Vol. 58, N 20. — Vol. 4515^1518.
28. Esteller M., Garcia-Foncillas J., Andion E. et al. Inactivation of the DNA-rcpair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents // N. Engl. 3. Med. — 2000. — Vol. 343, N 19. — P. 1350-1354.
29. Eversole-Cire P., Ferguson-Smith A.C., Sasaki H. et al. Activation of an imprinted Igf2 gene in mouse somatic cell cultures // Mol. Cell. Biol. —
1993. — Vol. 13. — P. 4928-4938.
30. Feinberg A.P, Vogelstein B. Hypomcthylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts // Nature. — 1983. — Vol. 301, N 5895. — P. 89-92.
31. FleisherA.S., Esteller M„ WangS. etal. Hypermethylation of the hMLH 1 gene promoter in human gastric canccrs with microsatellite instability // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59. — P. 1090-1095.
32. Florl A.R., Lower R., Schmitz-Drager B.J. et al. DNA méthylation and expression of LINE-1 and HERV-K provirus sequences in urothelial and renal cell carcinomas // Br J. Cancer. —1999. —Vol. 80. — № 9. — P. 1312-1321.
33. Gama-Sosa M.A., Slagel VA., Trewyn R.W. et al. The 5-mcthylcytosinc content of DNA from human tumors // Nucleic Acids Res. — 1983. — Vol. 11, N 19, —P. 6883-6894.
34. Goto T., Monk M. Regulation of X-chromosomc inactivation in development in micc and humans // Microbiology and Molecular Biology Reviews. — 1998. — Vol. 62, N2. — P. 362-378.
35. Gruff J.R, Gabrielson E., Fujii H. et al. Méthylation patterns of the E-cadhcrin 5' CpG island arc unstable and rcflcct the dynamic, heterogeneous loss of E-cadhcrin expression during metastatic progression // J. Biol Chcm. — 2000. — Vol. 275, N 4. — P. 2727-2732.
36. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clues to cancer etiology and molecular pathogenesis // Canccr Res.— 1994. — Vol.54,N 18. — P.4855-4878.
37. Greger V., Debus N., Lohmann £>., et al. Frequency and parental origin of hypcrmcthylatcd RBI alleles in retinoblastoma // Hum Genet. —
1994. — Vol. 94, N 5. — P. 491-496.
38. Hanada M., Delia D., Aielh A. et al. bcl-2 gene hypomcthylation and high-level expression in B-ccll chronic lymphocytic leukemia // Blood. — 1993. — Vol. 82, N 6. — P. 1820-1828.
39. Hemlrich B., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG-binding proteins // Mol Cell Biol. — 1998. — Vol. 18.— P. 6538-6547.
40. Hemlrich B„ Bird A. Mammalian mcthyltransfcrascs and mcthyl-CpG-binding domains: proteins involved in DNA méthylation // Curr Top Microbiol Immunol. — 2000. — Vol. 249. — P. 55-74.
41. Herman J.G., Civin C.I., Issa J.P. et al. Distinct patterns of inactivation of pl5INK4B and pl6INK4A characterize the major types of hcmatological malignancies // Cancer Res. — 1997. — Vol. 57, N 5. — P. 837-841.
42. Herman J.G., Latif F., Weng Y. et al. Silcncing of the VHL tumor-suppressor gene by DNA méthylation in renal carcinoma // Proc Natl Acad Sci USA. — 1994. — Vol. 91. — P. 9700-9704.
43. Hollstein M., Shomer B., Greenblatt M. et al. Somatic point mutations in the p53 gene of human tumors and cell lines: updated compilation // Nucleic Acids Res. — 1996. — Vol. 24, N 1. — P. 141-146.
44. Itano O , Veda M., Kikuclii K. et al. A new prcdictivc factor for hcpatocellular carcinoma based on two-dimensional electrophoresis of gcnomic DNA//Oncogcne. — 2000. — Vol. 19, N 13. — P. 1676-1683.
45. Jarrard D.F., Bova G.S., Ewing C M. et al. Dclctional, mutational, and méthylation analyses of CDKN2 (pi6/MTS 1) in primary and mctastatic prostate canccr // Genes Chrom Canccr. — 1997.— Vol. 19, N 2. — P. 90-96.
46. Jones P. A., Wolkowicz M.J., Rideout W.Md. etal. Dc novo mcthylation of the MyoDl CpG island during the establishment of immortal cell lines // Proc Natl Acad Sci USA. — 1990. — Vol. 87. — P. 6117-6121.
47. Kafri T., Ariel M., Brandeis M. et al. Developmental pattern of gcnc-spccific DNA mcthylation in the mouse embryo and germ line // Genes & Dev. — 1992. — Vol. 6. — P. 705-714.
48. Kantharidis P., Elosta A., deSilva M. et al. Altered mcthylation of the human MDR1 promoter is associated with acquired multidrug resistance // Clin Canccr Res. — 1997. — Vol. 311. — P. 2025-2032.
49. Katz F., Webb D., Gibbons B. et al. Possible evidence for gcnomic imprinting in childhood acute mycloblastic leukaemia associated with monosomy for chromosome 7 // Br J. Haematol. — 1992.— Vol. 80, № 3. — P. 332-336.
50. Katzenellenbogen R.A., Baylin S.B., Herman J. G. Hypcrmethylation of the DAP-kinasc CpG island is a common alteration in B-ccll malignancies // Blood. — 1999. — Vol. 93, N 12. — P. 4347-4353.
51. Kautiainen T.L., Jones PA. DNA methyltransfcrasc levels in tumorigcnic and nontumorigcnic cells in culture //J. Biol. Chcm. — 1986. — Vol. 261, N4, —P. 1594-1598.
52. KawakamiK, BrabenderJ., LordR. V. etal. Hypcrmcthylatcd APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma // J. Natl. Canccr Inst. — 2000. — Vol. 92, N 22. — P. 1805-1811.
53. Knudson A.G. mutation and canccr: statistical study of retinoblastoma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1971. — Vol. 68. — P. 820-823.
54. Kondo M., Matsuoka S., Uchida K. et al. Selective matcmal-allclc loss in human lung cancers of the maternally expressed p57KIP2 gene at
1 lpl5.5//Oncogcnc.— 1996. — Vol. 12, N 6. — P. 1365-1368.
55. Laird P. W„ Jaenisch R. The role of DNA mcthylation in canccr genetic and cpigcnctics // Annu Rev Genet. — 1996. — N 30. — P. 441-464.
56. LeiH., OhS.P, OkanoM. etal. Dc novo DNA cytosine mcthyltransfcrasc activities in mouse embryonic stem cells // Development. — 1996. — Vol. 122, — P. 3195.
57. Lerchner W. and Barlow D.P ( 1997) Paternal repression of the imprinted mouse Igf2r locus occurs during implantation and is stable in all tissues of the post implantation mouse embryo // Mcch. Dev. — Vol. 61. — P. 141-149.
58. Li E., Bestor T.H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA mcthyltransfcrasc gene results in embryonic lethality // Cell. — 1992. — Vol. 69.— P. 915.
59. Malik K.. Salpekar A., Hancock A. et al. Identification of differential mcthylation of the WT1 antisense regulatory region and relaxation of imprinting in Wilms' tumor // Canccr Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 2356-2360.
60. Miki Y., Nishisho I., Horii A. Disruption of the APC gene by a rctrotransposal insertion of LI sequence in a colon canccr. 11 Can Res. —
1992. — Vol. 52, N 3. — P. 643-645.
61. MonkM., Boubelik M„ LehnertS. Temporal and regional changes in DNA mcthylation in the embryonic, cxtracmbrionic and germ cell lineages during mouse embryo development // Development.— 1987. — Vol. 99. — P. 371-382.
62. Nan X., Campoy F.J., Bird A. McCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in gcnomic chromatin // Cell. — 1997. — Vol. 88.— P. 471.
63. Nan X., Cross S., Bird A. Gene silencing by methyl-CpG-binding proteins // Novartis Found Symp. — 1998. — Vol. 214. — P. 6-16, discussion 16-21, —P. 46-50.
64. Narayan A., Ji W., ZhangX. Y. et al. Hypomcthylation of periccntromcric DNA in breast adenocarcinomas // Int J Canccr.— 1998.— Vol. 77, N 6. — P. 833-838.
65. Nass S.J., Herman J.G., Gabrielson E. et al. Aberrant mcthylation of the estrogen receptor and E-cadhcrin 5' CpG islands increases with malignant progression in human breast canccr // Canccr Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 4346-4348.
66. Newell-Price J., Adrian J.L., King C., King P. DNA mcthylation and silcncing of gene expression // TEM. — 2000. — Vol. 11, N 4. — P. 142-148.
67. Ng H.H., Zhang Y., Hendrich B., Johnson C.A. et al. MBD2 is a transcriptional repressor, belonging to the McCPl histonc dcacctylasc complex // Nat Genet. — 1999. — Vol. 23. — P. 58-61.
68. Nguyen T.T., Mohrbacher A.F., Tsai Y.C., GroffenJ., Heisterkamp N.. Nichols P.W., Yu M.C., Lubbert M., Jones P.A. Quantitative measure of c-abl and pi5 mcthylation in chronic myelogenous leukemia: biological implications // Blood. — 2000. — Vol. 95, N 9. — P. 2990-2992.
69. Nuovo G.J., Plaia T.W., Belinsky S.A. et al. In situ detection of the hypcrmcthylation-induccd inactivation of the p 16 gene as an early event in oncogcncsis // Proc Natl Acad Sci USA. — 1999. — Vol. 96, N 22. — P. 12754-12759.
70. O'Neill R.J.W., Oneill M.J., Graves J. A.M. Undcrmcthylation associated with retroclement activation and chromosome remodelling in an interspecific mammalian hybrid // Nature. — 1998.— Vol. 393. — P. 68-72.
71. Ogawa O., Eccles M.R., Szeto J. et al. Relaxation of insulin-like growth factor II gene imprinting implicated in Wilms' tumour // Nature. —
1993. — Vol. 362, N 6422. — P. 749-751.
72. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA mcthyltransfcrascs Dnmt3a and Dnmt3b arc essential for dc novo mcthylation and mammalian development // Cell. — 1999. — Vol. 99. — P. 247-257.
73. Okano M„ Xie S., Li E. Dnmt2 is not required for dc novo and maintenance mcthylation of viral DNA in cmbryonic stem cells //Nucleic Acids Res. — 1998. — Vol. 26. — P. 2536.
74. Palmisano W.A., Divine K.K., Saccomanno G. et al. Predicting lung canccr by detecting aberrant promoter mcthylation in sputum // Canccr Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 5954-5958.
75. Pfeifer G.P., Denissenko M.F. Formation and repair of DNA lesions in the p53 gene: relation to cancer mutations // Environ Mol Mutagen. —
1998, —Vol. 31, N3, —P. 197-205.
76. PulfordD.J., Falls J.G., Killian J.K., JirtleR.L. Polymorphisms, gcnomic imprinting and cancer susceptibility // Mutat Res. — 1999. — Vol. 436. — № 1, —P. 59-67.
77. Qu G.Z., Dubeau L., Narayan A. et al. Satellite DNA hypomethylation vs overall gcnomic hypomethylation in ovarian epithelial tumors of different malignant potential // Mutat Res Fund Mol Mcch Mutagens. —
1999. — Vol. 423, N 1-2. — P. 91-101.
78. Rainer S., Johnson L.A., Dobry C.J. et al. Relaxation of imprinted genes in human cancer // Nature. — 1993. — Vol. 362, N 6422. — P. 747-749.
79. Ramsahoye B.H., Biniszkiewicz D„ Lyko F. et al. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cclls and may be mediated by DNA mcthyltransferase 3a // Proc Natl Acad Sci USA. — 2000. — Vol. 97. — P. 5237-5242.
80. Razin A. and Shemer R. DNA methylation in early development // Hum. Mol. Genet. — 1995. — Vol. 4. — P. 1751-1755.
81. Razin A. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing - a three-way conncction // The EMBO Journal. — 1998. — Vol. 17, N 17. — P. 4905^1908.
82. Razin A., Cegar H. DNA methylation and gene expression // Microbiol Rev. — 1991. — Vol. 55. — P. 451^158.
83. Razin A, Kafri T. DNA methylation from cmbrio to adult//Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. — 1994. — Vol. 48. — P. 53-81.
84. Roman-Gomez J„ Castillejo J. A., Jimenez A. et al. 5' CpG island hyper-methylation is associated with transcriptional silencing of the p21CIPl/ WAF1/SDI1 gene and confcrs poor prognosis in acute lymphoblastic leukemia // Blood. — 2002. — Vol. 99, N 7. — P. 2291-2296.
85. Salem C.E., MarkI I.D.C., Bender C.M. et al. PAX6 methylation and ectopic expression in human tumor cells // Int. J. Cancer. — 2000. — Vol. 87, —P. 179-185.
86. Sanford J.P, Clark H.J., Chapman V.M. and Rossant J. Differences in DNA methylation during oogenesis and spermatogenesis and their persistence during early embryogcnesis in the mouse // Genes & Dev. — 1987.— Vol. 1, —P. 1039-1046.
87. Sassaman D.M., Dombroski B.A., Moran J.V. et al. Many human LI elements arc capable of rctrotransposition // Nat Genet. — 1997. — Vol. 16,N 1, —P. 37-43.
88. Simpson D.J., Hibberts N.A., McNicol A.M. et al. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RB1 CpG island // Canccr Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 1211-1216.
89. Singal R., Ginder G.D. DNA Methylation // Blood. — 1999. — Vol. 93, N 12. — P. 4059^070.
90. Singer M.F., Krek V., McMillan J.P. et al. Linc-1 — a human transpos-able element//Gene.- 1993, —Vol. 135,N 1-2— P. 183-188.
91. Soares J., Pinto A.E., Cunha C.V. Global DNA hypomethylation in breast carcinoma — correlation with prognostic factors and tumor progression//Canccr. — 1999. — Vol. 85,N 1. —P. 112-118.
92. Tada M., Tada T., Lefebvre L. et al. Embryonic germ cclls induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cclls // EMBO J. — 1997. — Vol. 16. — P. 6510-6520.
93. Tada T„ Tada M., Hilton K, Barton S.C. et al. Epigenotype switching of imprintable loci in embryonic germ cclls // Dev. Genes Evol. — 1998.
94. Takiguchi M., Achanzar W.E., Qu W., Li G„ Waalkes M.P. Effects of cadmium on DNA-(Cytosine-5) mcthyltransfcrasc activity and DNA
methylation status during cadmium-induced ccllular transformation // Exp Cell Res. — 2003. — Vol. 286, N 2. — P. 355-365.
95. Tate P., Skarnes W., Bird A. The mcthyl-CpG-binding protein McCP2 is essential development in the mouse // Nat Genet. — 1996. — Vol. 12. — P. 205.
96. Tate PH., Bird A.P. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression // Curr Opin Genet Dev. — 1993. — Vol. 3. — P. 226.
97. TaziJ., Bird A. Alternative chromatin structure of CpG islands// Cell. — 1990, —Vol. 60, — P. 909.
98. Teitz T., Wei T., Valentine M.B., Vanin E.F., Grenet J., Valentine V.A., Behm F.G., Look A.T., Lahti J.M., Kidd V.J. Caspase 8 is deleted or silenced preferentially in childhood neuroblastomas with amplification of MYCN // Nat Med. — 2000. — Vol. 6, N 5. — P. 529-535.
99. Tycko B. Epigenctic gene silcncing in canccr // J Clin Invest. — 2000, N 105. — P. 401-407.
100. Tycko B. Gcnomic imprinting in Wilms' tumor // Med Ped Oncol.— 1996.
101. Venter J. C„ Adams M.D., Myers E. W. The sequence of the human genome // Science. — 2001. — Vol. 291. — P. 1304-1350.
102. Wilson G. N., HallJ.G., de la Cruz FII Gcnomic imprinting: summary of an NICHD Conference // Am. J. Med. Genet. — 1993. — Vol. 46. — P. 675-680.
103. Worm J., Bartkova J., Kirkin A.F., Straten PT. et al. Aberrant p27(Kipl) promoter methylation in malignant melanoma // Oncogcne. — 2000. — Vol. 19, N 44. — P. 5111-5115.
104. Wutz A. el al. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island // Nature. — 1997. — Vol. 389. — P. 745-749.
105. Xu G.L., Bestor T.H., Bourc'his D. et al. Chromosome instability and immunodeficicncy syndrome causcd by mutations in a DNA mcthyltransferase gene // Nature.— 1999. — Vol. 402. — P. 187-191.
106. Yanagisawa Y., Akiyama Y, lida S. et al. Methylation of the hMLHl promoter in familial gastric canccr with microsatcllitc instability // Int J. Canccr. — 2000. — Vol. 85, N 1. — P. 50-53.
107. Yen R.W., Vertino P.M., Nelkin B.D. et al. Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransfcrase // Nucleic Acids Res. — 1992. — Vol. 20. — P. 2287.
108. Zheng S. C., Chen P. C., McMillan A. et al. Correlations of partial and extensive methylation at the pl4(ARF) locus with reduced mRNA expression in colorectal canccr cell lines and clinicopathological features in primary tumors // Carcinogenesis. — 2000. — Vol. 21, N 11. — P. 2057-2064.
DNA metylation as one of the main mechanisms of gene activity regulation
A.A. Pendina', V.V. Grinkevich-, T.V. Kuznetsova', VS. Baranov1
1 Ott’s Institut of Gynccology et Obstetrics, Saint-Pctcrsburg;
2 Saint-Petersburg State university
'¡É? THE SUMMARY: DNA methylation is one of the main mechanisms of epigenetic inheritance in eukaryotes. In this review we looked through the ways of 5-methylcytosin origin, it's distribution in genome, the mechanism of gene repression via hypermetilation, the role of metylation in genomic imprinting and in X-chromosome inactivation, in em-bryogenesis of mammals, in the processes of oncogenesis and in etiology of some common human inherited diseases.
KEY WORDS: DNA methylation, 5-methylcytosine, methylase, imprinting, oncogenesis.
