CC BY
13
УДК 547.963:577.113.6
СИНТЕЗ КОВАЛЕНТНЫХ КОНЪЮГАТОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПЕПТИДАМИ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ N-ОКСИБЕНЗОТРИАЗОЛОВЫХ ЭФИРОВ
С. А. Кузнецова, Н. В. Сумбатян, К. Мальви*, Ж.-Р. Бертран*, А. Арель-Беллан**, Г. А. Коршунова***, Ф. П. Свинарчук*
(кафедра химии природных соединений; e-mail: [email protected])
Осуществлен синтез ковалентных конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с пептидами, которые являются потенциальными ингибиторами и активаторами генной экспрессии. Для получения двух типов ковалентных конъюгатов использован простой и эффективным подход, заключающийся в конденсации в водной среде 3'- или 5'-фосфо-К-оксибензотриазо-лидов олигонуклеотидов с концевой аминогруппой пептидов. Конъюгаты первого типа содержали в качестве олигонуклеотидного фрагмента антисенсовый олигонуклеотид, 5'-GAACACGCCATGTCGp-3', комплементарный участку мРНК белка оболочки вируса лейкемии мышей Friend, а в качестве пептидных фрагментов [Leu ]-энкефалин и его [DAla2, Ual ]-аналог, а также нуклеопептиды на основе 5-орнитиновой цепочки, в которой а-амино-функции орнитина модифицированы пиримидил-1- и пуринил-9-уксусными кислотами, или пиримидил-1- и пуринил-9-аланинами. Конъюгаты второго типа содержали пептиды H-GGG(PADALDDFDLDML)n-OH, димер (n = 2, P2) и тример (n = 3, P3) активного домена транскрипционного фактора VP16, присоединенные к 3'- или 5'-концу олигонуклеотида 5'-GGAGGAGGAGGAGGGGGAGG-3', образующего прочные тройные комплексы с последовательностью промоторного участка vpx гена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-2).
В последнее десятилетие интенсивно развивается новое направление биотехнологии, связанное с конструированием лекарств на основе синтетических олигонуклеотидов и их аналогов [1, 2]. Для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотидов, таких как стабильность к действию ферментов нуклеинового обмена, способность проникать через клеточную мембрану и влиять на внутриклеточное распределение [3-5], используют различные подходы, одним из которых является конъюгация с молекулами пептидов [7, 8]. В таких конъюгатах пептидный фрагмент может способствовать проникновению олигонуклеотида через клеточную мембрану [5, 7], его локализации в клеточном ядре [4, 6], может связываться со структурированным фрагментом РНК, в то время как антисенсовый олигонуклеотид образует гибридный комплекс с одноцепочечным фрагментом РНК [9]. Для получения конъюгатов используют несколько типов пептидов: гидрофобные транспортные пептиды, рН чувствительные пептиды, меняющие свою конформацию с изменением рН, положительно заряженные пептиды типа полилизина или сигнальные пептиды [10-13].
Цель настоящего исследования состояла в получении двух типов ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов с биологически активными пептидами. Конъюгаты первого типа представляли интерес как потенциальные ингибиторы генной экспрессии. В качестве олигонуклеотидного фрагмента они содержали антисенсовые олигонуклеоти-ды, комплементарные определенным участкам мРНК белка оболочки вируса лейкемии мышей Friend. В качестве
пептидных фрагментов были использованы аналоги энке-фалинов, а также нуклеопептиды. Нуклеопептиды представляют собой пептиды, в структуру которых с определенной регулярностью, характерной для нуклеиновых кислот (НК), встроены нуклеиновые основания [14-16]. Наличие нуклеопептидного фрагмента может способствовать улучшению фармакокинетических свойств конъюгата за счет присутствия пептидного остова. Кроме того, нук-леопептидный фрагмент способен дополнительно стабилизировать НК-взаимодействия за счет присутствия нуклеиновых оснований, что позволяет использовать более короткий адресный домен в конъюгате [17, 18].
Принципиально иной подход был использован для конструирования конъюгатов второго типа, способных активировать генную экспрессию. Так, триплексообразующий олигонуклеотид (ТТО) может обеспечивать доставку биологически активного пептида, фрагмента транскрипционного фактора, к узнаваемому участку в ДНК, что будет способствовать образованию специфического продуктивного комплекса ДНК-белок и, как следствие, активации транскрипции гена. ТБО могут специфически связываться с молекулой ДНК, что делает их весьма привлекательными соединениями для ген направленной терапии [19]. ТБО обычно ингибируют биохимические процессы, препятствуя нормальным взаимодействиям между ДНК-мишенью и белковыми факторами [20]. Вместе с тем было показано, что определенным образом структурированные ТБО могут использоваться и для активации генной экспрессии [21]. В конъюгатах второго типа в качестве
* Институт Гюстава Русси, Вильжюиф, 94805, Франция, ** Федеративный институт рака, Вильжюиф, 94801, Франция, *** НИИ
физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Москва.
олигонуклеотидной составляющей использовали 20-звен-ную гомопуриновую последовательность, образующую прочные тройные комплексы с последовательностью про-моторного участка vpx гена вируса иммунодефицита человека 2 [22], а в качестве пептидной составляющей химерной молекулы использовали синтетические пептиды, содержащие несколько повторов активного домена транскрипционного фактора VP 16.
Условия эксперимента
В работе были использованы следующие ферменты и реагенты: Т4-полинуклеотидкиназа без 3'-фосфатазной активности (КФ 2.7.1.78, new England Biolab); протеиназа К (Sigma); [y-32P]ÄTP (Amersham); N-оксибензотриазол (HOBt, Aldrich); ^(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбо-диимид (EDC, Sigma),
Олигодезоксирибонуклеотиды 5'-pGGAGGAGGAGGAGGGGGAGG-3' (TFO-5') и 5'- GGAGGAGGAGGAGGGGGAGGp-3' (TFO-3') были синтезированы на фирме GeNSet (Франция) и очищены в денатурирующем 20%-м полиакриламидном геле (ПААГ).
Олигодезоксирибонуклеотид 5'-GAACACGCCATGTCGp-3' (ON) был синтезирован на автоматическом ДНК-синтезаторе «Applied Biosystems 380 B» (США) с использованием стандартной амидофосфитной схемы [23]. Пептиды
H-GGG(PADALDDFDLDML)2-OH (Р2) и H-GGG(PADALDDFDLDML)3-OH (Р3) были синтезированы на автоматическом пептидном синтезаторе «Applied Biochemistry 432A» (Perkin Elmer) в Институте Гюстава Русси (Вильжюиф, Франция) с использованием стандартной FMOC-стратегии. Строение исходных пептидов подтверждено с помощью
МАЬБ1-масс-спектрометрии. Нуклеопептиды МР1 и ТБАСМРП были полечены твердофазным пептидным синтезом [24], а [Ьеи ]-энкефалин и [БА1а 2,иаГ]-энкефа-лин - методом активированных эфиров в растворе [25].
3'(5')-Фосфо-М-оксибензотриазоловые эфиры олигоде-зоксирибонуклеотидов получали в водном буферном растворе, содержащем ДМФА, под действием избытка ИОЫ и ЕБС в течение 2,5 ч при 8°, как описано в [26]. После завершения реакции к смеси добавляли 2 М раствор ЫС1О4 и осаждали продукт 10 объемами ацетона, переосаждение повторяли трижды.
Синтез ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов с пептидами
TFO-P. 1-50 нмолей М-оксибензотриазолового эфира олигонуклеотида ТБО-5' или ТБО-3' инкубировали с 1,5 ммолями пептида Р2 или Р3 в 5-30 мкл 0,4 М раствора М-метилимидазола (рИ 8,0), содержащего 0,2 М №С1, при 8° в течение 12 ч. Продукты реакции осаждали из реакционной смеси способом, описанным для 3'(5')-фосфо-Ы-оксибензотриазоловых эфиров олигодезоксирибонуклеоти-дов, и выделяли электрофорезом в 10%-м ПААГ, содержащем 7 М мочевину (в качестве буфера применяли 0,05 М трис-боратный буфер (рН 8,5), содержащий 1 мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
ON-[Leu5]ENk и ON-[DAla2,Ual5]Enk. К 10 нмолям М-оксибензотриазолового эфира олигонуклеотида ОМ добавляли 10-100-кратный избыток пептида в воде (рИ 1011), смесь выдерживали при 8° в течение 12 ч. Продукты выделяли и очищали так же, как это описано для ТБО-Р в 20 %-м ПААГ, содержащем 7 М мочевину.
ON-NPI и ON-TFAC ^П получали так же, как ОМТ-[Ьеи5]Епк и ОМ-[БА1а2,иа15]Епк, однако для более полного растворения нуклеопептидов в смесь добавляли 1020% ДМФА. Продукты выделяли и очищали, как это
5'-GAACACGCCATGTCG
ON
O
5'-GAACACGCCATGTCG-O—P—nh^
oh
NPI
T T C T
^N^/ H2N-S H2N-
ON
NPII
O
5'-GAACACGCCATGTCG-O-P-NH-TyrGlyGlyPheLeu-OH
ON
[Leu5]Enk
5'-GAACACGCCATGTCG-O-P-NH-TyrDAlaGlyPheUal-OH
OH
ON
[DAla2,Ual5]Enk
A
O
Рис. 1. Структура ковалентных конъюгатов 15-звенного олигодезоксирибонуклеотида (ON), комплементарного области AUG кодона мРНК белка оболочки вируса лейкемии мышей Friend, с нуклеопептидами (NPI и NPII), а также с [Ьеи5]-энкефалином и его аналогом [БА1а2,иа15]-энкефалином
3'-GGAGGGGGAGGAGGAGGAGG— О-Р-|\1Н—GlyGlyGlyPro-(AlaAspAlaLeuAspAspPheAspLeuAspMetLeuPro)3
ОН
ТРО-5'
5'-GGAGGGGGAGGAGGAGGAGG— О-Р-ЫН— GlyGlyGlyPro-(AlaAspAlaLeuAspAspPheAspLeuAspMetLeuPro)3
ОН
ТРО-3'
3'-GGAGGGGGAGGAGGAGGAGG— О-Р-ЫН—GlyGlyGlyPro-(AlaAspAlaLeuAspAspPheAspLeuAspMetLeuPro)2
ОН
ТРО-5'
5'-GGAGGGGGAGGAGGAGGAGG— О-Р-ЫН—GlyGlyGlyPro-(AlaAspAlaLeuAspAspPheAspLeuAspMetLeuPro)2
ОН
ТРО-3'
Рис. 2. Структура ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов с пептидами (ТБО-Р)
описано для ТБО-Р. Трифторацетильные защиты в случае конъюгата ОЫ-ТТАСЫРП снимали обработкой соединения 0,2 н. водным раствором ЫаОН в течение 10 мин, после чего продукт осаждали из реакционной смеси и переосаждали, как описано выше.
Гидролиз
Гидролиз ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов с пептидами, содержащих 32Р-метку на 5'-конце олигонукле-отида, протеиназой К проводили в течение 30-120 мин при 37° в 50 мМ Трис-НС1 буфере (рН 8,0), содержащем 1 мМ СаС12. Гидролиз полученных конъюгатов 50%-й уксусной кислотой проводили в течение 2 ч при 50°. Анализ реакционных смесей осуществляли либо в 15%-м, либо 20%-м ПААГ. Зоны, соответствующие исходным соединениям и продуктам синтеза или гидролиза, определяли по УФ-поглощению или радиоавтографически.
Результаты и обсуждение
Для получения ковалентных конъюгатов пептидов с олигонуклеотидами в настоящее время используют три основных подхода: последовательный синтез обоих фрагментов конъюгата на одном полимерном носителе, как правило, начиная с пептида [3, 27-29], присоединение одного из фрагментов к другому, находящемуся еще на полимерном носителе, на котором осуществлялся его синтез [30, 31], и присоединение пептида к деблокированному олигодезоксирибонуклеотиду в растворе. В последнем случае олигонуклеотид должен содержать либо специально введенную группу, способную реагировать с пептидом, такую как тио- [4], йодацетамид- [6], малеидо- [32, 33], аминогруппы [34], либо активированный фосфат [35]. Эти методы являются довольно сложными и трудоемкими, поэтому требуют, как правило, предварительной защиты функциональных групп олигонуклеотидов и пептидов или их предварительной модификации с целью введения реакционноспособных групп, а также специальных
методов деблокирования и очистки синтезированных соединений. Для синтеза ковалентных конъюгатов олигонук-леотидов с пептидами в настоящей работе разработан простой и эффективный подход, заключающийся в конденсации 3'- или 5'-концевой группы олигонуклеотида с концевой аминогруппой пептида. Этот подход не требует защиты большинства функциональных групп биополимеров, синтез протекает в водной среде, а использование предварительно полученных фосфо-Ы-оксибензотриазоли-дов олигонуклеотидов исключает применение конденсирующего агента в процессе конъюгации. В настоящее время используют несколько методов активации концевой фосфатной группы олигонуклеотидов в водной среде (карбодиимидный [36], имидазолидный [37] и метод Ы-ок-сибензотриазоловых эфиров [38, 39]). Карбодиимидный метод включает активацию фосфатной группы олигонук-леотида непосредственно в реакционной смеси с нуклео-филом и, следовательно, не может быть использован для синтеза ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов с незащищенными пептидами, так как карбодиимид способен модифицировать карбоксильные группы боковых радикалов аминокислот, входящих в состав пептидов [40]. Два других метода включают предварительную активацию фосфатной группы олигонуклеотида с последующим выделением активного производного из реакционной смеси, однако в реакциях нуклеофильного замещения у атома фосфора метод Ы-оксибензотриазоловых эфиров более эффективен, чем имидазолидный [38, 39]. Кроме того, показано, что Ы-оксибензотриазоловые эфиры олигорибо-нуклеотидов способны ковалентно взаимодействовать с пептидами в составе региоспецифических комплексов [41]. Поэтому именно этот метод был выбран нами для активации фосфатной группы олигонуклеотидов.
Все целевые конъюгаты сконструированы таким образом, что концевая аминогруппа пептида и 3'- или 5'-кон-цевые фосфатные группы олигонуклеотида соединены фосфоамидной связью. В случае конъюгатов, содержащих
О
О
О
Siatl—>
I 1 Л
нуклеопептиды, такая конструкция узла связи двух компонент химерной молекулы является оптимальной, так как расстояние между нуклеиновыми основаниями соседних концевых звеньев олигонуклеотида и пептида является таковым, что не нарушаются их взаимодействия с соответствующими основаниями в комплементарной цепи. На рис. 1 представлена структура ковалентных конъюгатов 15-звенного олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного области AUG кодона мРНК белка оболочки вируса лейкемии мышей Friend, с нуклеопептидами (ON-NPI и ON-NPII), а также с [Ьеи5]-энкефалином и его аналогом [DAla2,Ual5]-энкефалином (ON-[Leu5]ENk и ON-[DAla2, Ual5]ENk). Оба нуклеопептида содержат по 5 нуклеиновых оснований (последовательность нуклеиновых оснований, начиная с N-конца: ATTCT), присоединенных к 8-орнити-новому пептидному остову таким образом, что расстояние по пептидному остову между соседними основаниями составляет 6 простых связей. Было показано, что такое расстояние является оптимальным для образования олиго-нуклеотидными аналогами, не содержащими фосфатного остова, стабильных комплексов с комплементарными оли-гонуклеотидами [42, 43]. В нуклеопептиде NPI нуклеиновые основания присоединены к а-аминогруппам орни-тиновых остатков путем ацилирования последних пири-мидил-1- и пуринил-9-уксусными кислотами. В нуклеопептиде NPII 8-орнитиновый остов модифицирован нуклеоаминокислотами:3-(тиминил-1)аланином, 3-(цито-зинил-1)аланином, 3-(аденинил-9)аланином). Конъюгаты ON-[Leu5]ENk и ON-[DAla2,Ual5]ENk были получены для отработки метода конъюгации олигонуклеотидов с пептидами относительно простого строения и для их использования в качестве контрольных препаратов в физико-химических и биологических экспериментах с конъю-гатами, содержащими нуклеопептиды.
Структура ковалентных конъюгатов триплексообразую-щих олигонуклеотидов с протяженными пептидными молекулами (TFO-P) приведена на рис. 2. В этом случае 8-аминогруппы пептидов также присоединены к 3'- или 5'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида, поскольку других нуклеофильных групп, способных взаимодействовать с фосфатной группой олигонуклеотида, пептиды H-GGG(PADALDDFDLDML)2 (Р2) и H-GGG(PADALDDFDLDML)3-OH (Р3) не содержали.
Олигонуклеотиды 5'-GAACACGCCATGTCGp-3' (ON), 5'-pGGAGGAGGAGGAGGGGGAGG-3' (TFO-5') и
Рис. 4. Электрофореграмма реакционных смесей, образующихся при синтезе ковалентных конъюгатов и нуклеопепти-дов, ОМ-ОТ1 и ОМ-ТРЛСОТП соответственно в 20%-м ПААГ: 1 - исходный олигонуклеотид ОМ; 2 - реакционная смесь, образующаяся при синтезе ОМ-МР1; 3 - реакционная смесь, образующаяся при синтезе ОМ-ТРЛСМР11
Рис. 3. Электрофореграмма реакционных смесей, образующихся при синтезе ковалентных конъюгатов в 20%-м ПААГ 1 - 5'-ОЛЛСЛСОССЛТОТСОр-3'; 2 - реакционная смесь, образующаяся при синтезе
3 - реакционная смесь, образующаяся при синтезе ОМ-[БЛ1а2,иаГ]ЕМк
Рис. 5. Радиоавтограф электрофореза в 20%-м денатурирующем ПААГ реакционных смесей, образующихся при обработке ОМ-МР1 и ОМ-МР11 50%-й уксусной кислотой (50°, 2 ч) и протеиназой К (20 мкг/мл, 37°, 24 ч). 1 - исходный олигонуклеотид 5'-32Р-ОМ; 2 - ковалентный конъюгат 32Р-ОМ-МР1; 3, 6 - реакционные смеси, образующиеся при обработке 32Р-ОМ-ОТ1 и 32Р-ОМ-ОТП 50%-й уксусной кислотой соответственно; 4 - ковалентный конъюгат 32Р-ОМ-МР11; 4, 7 - реакционные смеси, образующиеся при обработке Р-ОМ-ОТ1 и Р-ОМ-МР11 протеиназой К
5'- ООЛООЛООЛООЛООШОЛООр-3' (ТРО-3') были синтезированы стандартным амидофосфитным методом, пептиды Р2 и Р3 синтезированы на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием стандартного протокола синтеза. Структура исходных пептидов подтверждена с помощью МЛЬБ1-масс-спектроскопии. Нуклеопептиды №1 и защищенный по а-аминогруппам нуклеоаминокислот-ных остатков трифторацетильными группировками ТБЛСКРП были получены твердофазным пептидным синтезом [24], [Ьеи5]-энкефалин и [БЛ1а2,иа15]-энкефалин -методом активированных эфиров в растворе [25].
М-Оксибензотриазоловые эфиры олигонуклеотидов получали, как описано в [26], их выделение из реакционной смеси проводили двукратным осаждением ацетоном из 2М раствора перхлората лития.
Синтез ковалентных конъюгатов олигонуклеотида ОМ с энкефалином и его аналогом проводили в воде при рН 10-11 в течение 12 ч. На рис. 3 представлена электрофореграмма реакционных смесей ОМ-[Ьеи5]Епк и ОМ-[БЛ1а ,иа1 ]Епк. Продукты отделяли от исходных соединений в 20%-м денатурирующем ПААГ. Выходы ковалент-ных конъюгатов составили 80 и 50% соответственно.
В аналогичных условиях были получены конъюгаты ОМ с нуклеопептидами МР1 и ТБЛСМРП. Так как нуклеопептиды хуже растворялись в воде, чем энкефали-
ны, на стадии конъюгации в реакционную смесь добавляли 10-20% ДМФА. Однако выходы целевых конъюгатов составили лишь около 10% в обоих случаях, что, по-видимому, связано с плохой растворимостью пептидов и вследствие этого недостаточной концентрацией в растворе пептидного компонента. Электрофореграмма реакционных смесей представлена на рис. 4. После выделения полученного конъюгата ОЫ-ТЕАСЫРП а-аминогруппы боковых цепей деблокировали обработкой 0,2 н. водным раствором едкого натра в течение 10 мин. Структуру соединений ОЫ-[Ьеи5]ЕЫк, ОЫ-рА1а2,иа15]ЕЫк, ОЫ-ЫР1 и ОЫ-ЫРП подтверждали избирательным гидролизом фос-фоамидной связи, образующейся между пептидным и олигонуклеотидным фрагментами, 50%-й уксусной кислотой (50°) и протеолизом пептидного фрагмента протеина-зой К. На рис. 5 в качестве примера приведен радиоавтограф электрофореза в 20%-м денатурирующем ПААГ реакционных смесей, образующихся при обработке ОЫ-ЫР и ОЫ-ЫРП 50%-й уксусной кислотой и протеиназой К. Следует отметить, что нуклеопептиды подвергаются ферментативному расщеплению значительно медленнее, чем пептиды, состоящие из белковых аминокислот, поэтому соответствующие конъюгаты выдерживали с протеиназой К длительное время (до суток). Как видно из рисунка, в результате гидролиза фосфоамидной связи наблюдалось образование исходного олигонуклеотида ОЫ. Структуры полученных конъюгатов ОЫ-[Ьеи5]ЕЫк и ОЫ-
2 5
[БА1а ,Иа1 ]ЕЫк были, кроме того, подтверждены данными МАЬБ1 масс-спектроскопии: значения масс (рассчитанных и детектируемых) составили 5179,5 и 5180±1,6; 5261,5 и 5262±2,5 соответственно.
Синтез ковалентных конъюгатов ТБО-3'-Р2, ТБО-3'-Р3, ТБО-5'-Р2 и ТБО-5'-Р3 проводили в 0,4 М Ы-метилимида-зольном буфере (рН 8,0), содержащем 0,2 М ЫаС1, при 8° в течение 12 ч, поскольку в отсутствие Ы-метилимидазола эффективность реакции резко снижалась. Продукты отделяли от исходных соединений в 10%-м денатурирующем ПААГ. Выходы ковалентных конъюгатов составили 10-45% в зависимости от структуры пептида и условий реакции. На рис. 6 приведен радиоавтограф электрофореза реакционной смеси, образующейся при синтезе соединения ТБО-5'-Р3. Как и ожидалось, в результате конден-
Start
Start
TFO-P
TFO
Рис. 6. Радиоавтограф электрофореза в 10%-м ПААГ реакционной смеси, образующейся при синтезе ковалентного конъюгата 32Р-ТБО-5' и Р3: 1 - исходный олигонуклеотид 32Р-ТБО-5'; 2 - Ы-оксибензотриазоловый эфир 5'-32Р-ТБО в условиях проведения конденсации в отсутствие пептида; 3 - реакционная смесь, образующаяся при синтезе ТБО-5'-Р3
tfo-p tfo
1 2 3 4 5
Рис. 7. Радиоавтограф электрофореза в 15%-м денатурирующем ПААГ реакционных смесей, образующихся при обработке 32Р -TFO-3'-P2 50%-й уксусной кислотой (50°) и протеиназой К: 1 - исходный олигонуклеотид 32P-TFO-3'; 2 - ковалентный конъю-гат 32Р-TFO-3'-P2; 3, 4 - реакционные смеси, образующиеся при обработке 32P-TFO-3'-P2 50% -й уксусной кислотой в течение 30 и 120 мин соответственно; 5 - реакционная смесь, образующаяся при обработке 32P-TFO-3'-P2 протеиназой К (100 мкг/мл, 60 мин, 40°)
сации наблюдали образование продукта с более низкой электрофоретической подвижностью. Структуру синтезированных конъюгатов подтверждали с помощью MALDI масс-спектроскопии. Для соединений TFO-3'-P2 и TFO-5'-P3 значения масс (рассчитанных и детектируемых) составили 10991 и 10991±2,26, 9558,5 и 9558±1 соответственно.
Структуру полученных ковалентных конъюгатов TFO-3'-P2, TFO-3'-P3, TFO-5'-P2 и TFO-5'-P3 подтверждали избирательным гидролизом фосфоамидной связи 50%-й уксусной кислотой (50°) и протеолизом пептидного фрагмента протеиназой К. Как видно из рис. 7, при удалении пептидной части ковалентного конъюгата TFO-3'-P2 протеиназой К наблюдалось образование продукта с несколько меньшей электрофоретической подвижностью, чем TFO-3', что может происходить вследствие повышенной устойчивости к протеолизу нескольких аминокислот, непосредственно прилегающих к олигонуклеотиду. Следует отметить, что при обработке уксусной кислотой и протеиназой К соединения, находящегося вблизи старта (см. рис. 6) образуются те же продукты, что и при обработке ковалентных конъюгатов TFO-P. Мы полагаем, что это соединение может представлять собой нековалентные комп -лексы (агрегаты) триплексообразующих олигонуклеотидов TFO и/или TFO-P. Большое количество остатков G и высокий отрицательный заряд пептида свидетельствуют в пользу этой гипотезы.
В физико-химических экспериментах и в опытах in vitro была подтверждена способность синтезированных ковалентных конъюгатов TFO-P образовывать триплексы с ДНК-мишенью, проверена внутриклеточной стабильность синтезированных конъюгатов, а также способность активации гена люциферазы. Оказалось, что из четырех синтезированных конъюгатов только TFO-5'-P3 обладал активирующим действием, значительно увеличивая экспрессию гена люциферазы [44].
Фармакокинетические свойства ковалентных конъюгатов 15-звенного олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного области AUG кодона мРНК белка оболочки вируса лейкемии мышей Friend, с нуклеопептидами ON-NP I и ON-NP II, а также с [Leu^-энкефалином и его аналогом ГОА1а2,Ш15]-энкефалином (ON-[Leu5]ENk и
ON-[DAla2,Ual5]ENk) исследуются в настоящее время в Институте Гюстава Русси (Вильжюиф, Франция).
Таким образом, в настоящей работе разработан простой и эффективный способ конъюгации, заключающийся в конденсации 3'- или 5'-фосфо-Ы-оксибензотриазолидов олигонуклеотидов с концевой аминогруппой пептидов. Этот подход не требует предварительной защиты большинства функциональных групп биополимеров, синтез протекает в водной среде и является перспективным для получения конъюгатов протяженных олигонуклеотидов и пептидов различного строения и длины, в том числе нук-леопептидов. Хотя недостаточная растворимость отдельных пептидов в воде может ограничивать использование
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zon G. Antisense Research and applications. / Eds. S.T. Crooke.
1993.
2. Cook P.D. // Nucl.&Nucl. 1999. 18. P. 1141.
3. Juby C.D., Richardson C.D., Brousseau R. // Tetrahedron Lett.
1991. 32. P. 879.
4. Arar K., Aubertin A.M., Roche A.S., Monsigny M., Mayer M. //
Bioconjug. Chem. 1995. 6. P. 573.
5. Pichon C., Arar K., Stewart A.J., Dodon M.D., Gazzolo L.,
Courtoy P.L., Mayer R., Monsigny M., Roche A.C. // Mol. Pharmacol. 1997. 51. P. 431.
6. Reed M. W., Frada D., Schwartz D.E., Scoller J., Hinrichsen R.D.
// Bioconjug. Chem., 1995. 6. P. 101.
7 . Soukchareun S., Tregear G.W., Haralambidis J. // Bioconjug.
Chem. 1995. 6. P. 43.
8 . Derossi D., Chassaing G., Prochiantz A. // Trends in Cell Biol.
1998. 8. P. 84.
9. Tung C.H., Wang J., Leibowitz M.J. // Bioconjug. Chem. 1995. 6. P. 292.
10. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F, Divita G. // Nucl. Acids Res. 1997. 25. P. 2730.
11. Pichon C., Freulon I., Midoux P., Mayer R., Monsigny M., Roche A.C. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7. P. 335.
12. Degols G., Leonetti J-P., Benkirane M., Devaux C., Lebleu B. // Antisense Res. Dev. 1992. 2. P. 293.
13. Sebestyen M.G., Ludtke J., Bassik M., Zhang G., Budker V., Lukhanov E.A., Hagstrom J., Wolff J.A. // Nature Biotechnol. 1998. 16. P. 80.
14. Швачкин Ю.П., Мишин Г.П., Коршунова Г.А. // Успехи химии. 1982. 51. С. 311.
15. Korshunova G.A., Ilicheva I.A., Sumbatyan N.V, Hyun K. // Letters in Peptide Science. 1997. 4. P. 473.
16. Ичетовкин И.Е., Сумбатян Н. В., Багерзадех Г., Коршунова Г.А. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Химия. 1997. 38. C. 120.
17. Лидак М.Ю., Раукас Э.Э., Кришане В.Э., Паэгле Р.А., Райм Т.А., Кооли К.Л., Поритере С.Е. // Химия гетероцикл. соед. 1983. 3. С. 402.
18. Семилетов Ю.А., Тяглов Б.В., Пермогоров В.И., Швачкин Ю.П. // ЖОХ. 1981. 51. С. 230.
19. Giovannangeli M., Diviacco S., Labrousse V., Gyasnov S., Charneau P., Helene C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94. P. 79.
20. Maher L.J.R. // Cancer Invest. 1996. 14. P. 66.
21. Svinarchuk F., Nagibneva I., Cherny D., Ait-Si-Ali S., Pritchard L.L., Robin P., Malvy C., Harel-Bellan A. // Nucleic Acids Res. 1997. 25. P. 3459.
этого метода, с его помощью синтезирован ряд ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов с биологически активными пептидами. Использование разработанного подхода к синтезу ковалентных конъюгатов позволит в будущем существенно расширить спектр потенциальных генетических лекарств и сделает их доступными для последующих фармакологических испытаний.
Авторы благодарят доктора Аллена Деруссана (Институт Гюстава Русси, Вильжюиф, Франция) за проведение масс-спектрометрических анализов. Данная работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты 00-04-48312, 00-04-48253 и 00-04-22003), а также гранта Ведущей научной школы 00-15-97944.
22. Debin A., Malvy C, Svinarchuk F. // Nucleic Acids Res. 1997. 25. P. 1965.
23. Atkinson T., Smith M. // Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach / Ed. M.J. Gait. Oxford, Washington, 1984. P. 35.
24. Sumbatyan N.V., Artsatbanova E.A., Baeva O.V., Hyun K.-C., Kuznetsova S.A., Gottikh M.B., Korshunova G.A. // Nucl.&Nucl. 1999. 18. P. 1489.
25. Рябцева О.Н., Петрова М.Г., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. // ЖОХ. 1987. 57. С. 963.
26. Gottikh M.B., Asseline U, Tuong, N.T. // Tetrahedron Lett. 1990. 31. P. 6657.
27. Haralambidis J., Duncan L., Treggear G.W. // Tetrahedron Lett. 1987. 28. P. 5199.
28. Lukhtanov E.A., Kutyavin I.V., Meyer R. // Bioconjug. Chem.
1996. 7. P. 564.
29. Soukchareun S., Tregear G.W., Haralambidis J. // Bioconjug. Chem. 1995. 6. P. 43.
30. Endo M., Azuma Y., Saga Y., Kuzuya A., Kawai G., Komiyama M. // J. Org. Chem. 1997. 62. P. 846.
31. Peyrottes S., Mestre B., Burlina F., Gait M.J. // Tetrahedron. 1998. 54. P. 12513.
32. Harrison J.G., Balasubramanian S. // Nucl. Acids Res. 1998. 26. P. 3136.
33. Tung C.H., Rudolph M.J., Stein S. // Bioconjug. Chem. 1991. 2. P. 464.
34. Svinarchuk F.P., Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pokrovsky A.G., Vlassov V.V. // Biochimie. 1993. 75. P. 49.
35. Пышный Д.В., Репкова М.Н., Лохов С.Г. // Биоорган. химия.
1997. 23. С. 497.
36. Shabarova Z.A. // Biochimie. 1988. 70. P. 1323.
37. Исагулянц М.Г., Ивановская М.Г., Потапов В.К., Шабарова З.А. // Биоорган. химия. 1985. 11. С. 239.
38. Ivanovskaya M.G., Gottikh M.B., Shabarova Z.A. // Nucl.&Nucl. 1995. 6. P. 913.
39. Ивановская М.Г., Готтих М.Б., Шабарова З.А. // Доклады Акад. наук СССР. 1987. 293. С. 477.
40. Gilham P.T. // J. Am. Chem Soc. 1962. 84. P. 687.
41. Таран Е.А., Ивановская М.Г., Гайт М., Шабарова З.А. // Молекуляр. биол. 1998. 32. С. 832.
42. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R. N., Buchardt O. // Science. 1991. 254. P. 1497.
43. Nielsen P. E., Egholm M, Buchardt O. // Bioconjug. Chem. 1994. 5. P. 3.
44. Kuznetsova S., Ait-Si-Ali S., Troalen F., Le Villain J.-P., Harel-Bellan A., Svinarchuk F. // Nucl. Acids Res. 1999. 27. P. 3995.
Поступила в редакцию 05.12.00
