Синтез и радиобиологическая активность водорастворимых производных медного комплекса хлорина е6 Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 547.979+621.386.86

СИНТЕЗ И РАДИОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ МЕДНОГО КОМПЛЕКСА ХЛОРИНА Е6

© Н.И. Никитина', Г.П. Потапов

Сыктывкарский государственный университет, ул. Петрозаводская, 120, 167005, Сыктывкар (Россия) е-mail: anatoly@sbis.komi.com

В работе приведены материалы использования аминогликозидов для гидрофилизации медного комплекса хлорина е6 (медьхлорина) и поливинил-пирролидона для иммобилизации производных медьхлорина. Показано, что водорастворимость достигается за счет процесса солеобразования, а иммобилизация - в результате экстракоординации. Структуры подтверждены спектральными данными, методом аналитического ультрацентрифугирования определено соотношение порфирин: полимер как 1 : 7. Установлено, что синтезированные соединения обладают радиопротекторной активностью.

Введение

Создание лекарственных и других биологически активных препаратов на основе порфиринов является одним из перспективных прикладных направлений использования этого класса соединений. Наиболее доступным среди природных порфиринов является хлорофилл, содержащийся в зеленых частях растений. Известно большое число препаратов на основе хлорофилла, которые широко используются как в медицине, так и в быту [1-5]. Однако хлорофилл и его металлопроизводные не растворимы в воде, что практически не позволяет реализовать их в качестве перспективных фармацевтических препаратов.

Целями данной работы являются выделение из хлорофилла хлорина е6, синтез его медного комплекса, гидрофилизация, иммобилизация на полимере-носителе и изучение физиологической активности производных медьхлорина е6.

Экспериментальная часть

Высушенные и измельченные листья крапивы экстрагировали хлороформом или этанолом в аппарате Сокслета. Затем растворитель отгоняли, а остаток пропускали через колонку с силикагелем. В качестве элюента использовали смесь хлороформ : четыреххлористый углерод 3 : 1. На выходе из колонки собирали хлорофилл а, чистоту выхода которого проверяли по ТСХ. Полученный хлорофилл а подвергали действию 30%-ного водного раствора щелочи сначала на холоду (баня со льдом), а затем при нагревании до 80°С в течение получаса в колбе с обратным холодильником. Затем щелочной раствор подкисляли ледяной уксусной кислотой до слабокислой реакции. Выпадающий при этом в осадок хлорин е6 отделяли фильтрованием, промывали водой до нейтральной реакции промывных вод и отсутствию ионов магния и высушивали при комнатной температуре в темном месте. Выход хлорина е6 94%.

Автор, с которым следует вести переписку.

Медный комплекс хлорина е6 был получен следующим образом: 5 мг хлорина е6 смешивали с ацетатом меди в ледяной уксусной кислоте в массовом соотношении 1 : 10 соответственно. Полученную смесь

последующим отмыванием от уксусной кислоты и избытка ацетата меди водой до нейтральной реакции

постоянной массы. Выход медьхлорина 95%.

ЭПР-спектр медьхлорина снимали на серийном радиоспектрометре Х-диапазона 8Б Х/2547 в виде порошка.

Для синтеза гидрофилизированных производных медьхлорина е6 в качестве аминогликозидов использовали моносульфат канамицина и сульфат стрептомицина. Синтез проводили в водном растворе в термостатируемом реакторе при постоянном перемешивании и в различных условиях. Предварительно для аминогликозидов проводили нейтрализацию карбонатом натрия в течение 10 мин, исходя из эквивалентного количества сульфогрупп. После чего к раствору добавляли навеску медьхлорина е6. В ходе эксперимента варьировали температуру от 20 до 900С и время реакции - от 10 до 180 мин. В результате реакции медный комплекс хлорина е6 переходил в водорастворимую форму. По окончании реакции осадок - непрореагировавший медный комплекс хлорина - отделяли центрифугированием (3500 об/мин). Осадок высушивали при комнатной температуре до постоянной массы и рассчитывали конверсию медьхлорина. Фильтрат - производное медьхлорина е6 с аминогликозидом - высушивали в чашке Петри при комнатной температуре.

Для синтеза высокомолекулярных производных хлорина использовали полученные ранее комплексы медьхлорин-аминогликозид и поливинилпирролидон (ПВП) в соотношении 1 : 4. Реакцию осуществляли в колбе при перемешивании в оптимальных условиях в течение двух часов. Продукты высушивали на воздухе до постоянной массы.

ИК-спектры синтезированных соединений снимали на приборе «8РБСОКЭ М82» (Германия). Для снятия спектров готовили таблетки, содержащие 100 мг КВг и 1 мг анализируемого вещества.

Электронные спектры поглощения продуктов снимали на спектрофотометре «8РБСОКЭ М40» (Германия) в виде водных растворов в области концентраций 10-5-10-6 моль/л. Полимеры-носители исследовались в виде водных растворов с концентрацией 0,01 моль/л. Толщина кюветы 1 см.

У ПВП и синтезированных высокомолекулярных соединений была определена вязкость с использованием вискозиметра Уббелоде ^ = 0,83 нм) при 250С. Значения характеристической вязкости использовали для расчетов молекулярной массы поликомплексов по формуле (1) и их стехиометрического состава методом аналитического ультрацентрифугирования. Методом скоростной седиментации охарактеризовано распределение ионов металлов порфиринового цикла между молекулами ПВП. Из данных седиментограммы рассчитывалась доля звеньев ПВП, связанных в комплексе. Эксперимент по определению констант седиментации ПВП и поликомплексов проводили методом скоростной седиментации на ультрацентрифуге М0М-31800 (Венгрия) в двухсекторной полиамидной кювете с образованием искусственной границы при 40000 об/мин. Обсчет седиментограмм и определение фактора плавучести систем полимер-растворитель определяли согласно методике [6]. В качестве растворителя использовали дегазированную бидистиллированную воду (р0 = 0,9974 и п0=0,897сП).

растворителя (вода), 0,8936 при 25°С; 80 - константа седиментации, сек; А0 - гидродинамический инвариант, 3,2-10-10 эрг-моль^-К-1, характерное для гибкоцепных полимеров (например, ПВП); (1-Ур0) -фактор плавучести для данной системы полимер-растворитель; [п] - характеристическая вязкость, дл/г.

Для определения наличия радиобиологической активности у синтезированных водорастворимых полимерных комплексов медьхлорина был проведен тест на 30-дневную выживаемость облученных животных. В экспериментах использовали беспородных мышей массой 20-25 г. Острую токсичность определяли при введении исследуемых соединений в водном растворе однократно внутрибрюшинным

выдерживали при 600С в течение 1,5-2 ч. Металлокомплекс выделяли из реакционной смеси эфиром с

промывных вод и отсутствию ионов Си2. Эфирный экстракт высушивали при комнатной температуре до

(1)

где Я - универсальная газовая постоянная, 8,314-107 эрг-моль-1-К 1 при 25°С; % - динамическая вязкость

способом в полном соответствии с общепринятой в фармакологии методикой. Наблюдение за поведением и регистрацию гибели животных вели на протяжении первого часа и затем фиксировали гибель животных в последующие пять суток после инъекции. Животных облучали на лабораторной у-установке «ИГУР-1» с источником излучения 137Сб в дозе 9,0 Гр; мощность дозы облучения составляет 1,0 Гр/мин. Исследуемые соединения медьхлорин-стрептомицин-ПВП и медьхлорин-канамицин-ПВП вводили животным в водном растворе за 30 мин до облучения в оптимальной дозировке. Животным контрольных групп в те же сроки и в эквиобъемных количествах перед облучением вводили растворитель - дистиллированную воду. Для сравнения радиозащитной активности исследуемых соединений был использован радиопротектор-стандарт цистамин (бис-(Р-аминоэтил)дисульфид) в оптимальной радиозащитной дозировке 200 мг/кг, вводимый за 15-20 мин до облучения.

Обсуждение результатов

Синтез медного комплекса хлорина е6

В последнее время наибольший интерес вызывает не сам хлорофилл, а его различные производные, и в частности, феофорбиды и хлорины. В связи с этим нами была поставлена цель получения хлорина е6, проведение его химической модификации и определение физиологической активности у полученных соединений.

Наиболее доступным сырьем для синтеза хлорина е6 является хлорофилл а, который может быть выделен из любого растительного сырья. В качестве источника хлорофиллов использовали листья крапивы, которые экстрагировали полярными растворителями. Экстракт, содержащий смесь хлорофиллов а и Ь, подвергали разделению колоночной хроматографией. При этом отбирали наиболее подвижную фракцию, содержащую хлорофилл а. Получение хлорина е6 возможно либо кислотной, либо щелочной обработкой хлорофилла а. Нами был осуществлен последний путь, так как это позволяет провести синтез с меньшим числом стадий. Так, обработка щелочью на холоду приводит к гидролизу сложноэфирных групп, а выдерживание смеси в течение получаса при 80°С - к раскрытию циклопентанового кольца (рис. 1). Последующее подкисление смеси ледяной уксусной кислотой приводит, во-первых, к удалению атома магния из координационной полости порфирина, а во-вторых, к осаждению хлорина е6. Выход хлорина составил 94% от массы хлорофилла а. Чистоту выхода проверяли по ТСХ. Хлорин е6 представляет собой коричнево-зеленый порошок, не растворимый в воде, эфире; немного растворимый в этаноле, ацетоне и хорошо растворимый в уксусной кислоте, пиридине, водных растворах щелочей.

Из литературы известна способность производных хлорофилла к комплексообразованию с ионами щелочных и переходных металлов [7, 8]. В связи с этим нами был получен медный комплекс хлорина по методике Залесского [7], так как замена атома магния в центре порфириновой системы на атомы меди, никеля, кобальта, серебра приводит к большей физиологической активности [3, 9]. При этом вместо предлагаемого по методике мольного соотношения порфирин: ацетат металла 1 : 50 мы использовали отношение как 1:10, а также уменьшили температуру до 600С и увеличили продолжительность обработки до двух часов. При этом выход медьхлорина достигает 95%. Полученный комплекс представляет собой мелкодисперсное вещество зеленого цвета, не растворимое в воде, спирте; хорошо растворимое в хлороформе, ацетоне, эфире.

СООС20Н39

Хлорофиллы а и Ь Хлорофилл а Хлорин е6 Медьхлорин е6

Выход 46% Выход 94% (СиХлн е6)

Выход 95%

Рис. 1. Схема синтеза медьхлорина е6

Взаимодействие с ионами меди молекулы хлорина е6 возможно в двух направлениях: за счет солеобразования с участием СООН-групп молекулы хлорина или за счет комплексообразования с участием порфиринового цикла. Последнее и подтверждается данными ЭПР-спектроскопии, так как в медьхлорине присутствует ион Си (2+) в тетрагональном окружении 2,185 и Ац 580МГц, д! 2,045 и А± 100МГц, а4М 1,7 тТ). Дополнительная разверстка сверхтонкой структуры позволяет предположить наличие в ближайшем окружении иона меди, по крайней мере, четырех ионов с ядерным спином, равным 1 (в спектре наблюдается расщепленный на 9 линий сигнал). Эти особенности хорошо согласуются с идеальной структурой ближайшего окружения ионов в данном соединении.

Электронные спектры поглощения синтезированного комплекса отвечают литературным данным для медьхлорина - наличие полосы Соре при 409 нм (^е 1,21) и двух полос низкой интенсивности при 609 и 631 нм (^е 0,29-0,61).

Исключить процесс солеобразования позволяют и данные ИК-спектроскопии. Так, в ИК-спектре самого хлорина е6 имеется ярко выраженная полоса при 1710 см-1, соответствующая vС=0 в неионизированной карбоксильной группе. В спектрах медьхлорина полоса в этой области сохраняется, что свидетельствует об образовании связи между ионом меди и центром порфиринового кольца, а не с карбоксильными группами последнего.

Гидрофилизация медьхлорина е6

Процесс гидрофилизации проводили путем солеобразования между карбоксильными группами СиХлн е6 и аминогруппами азотистых оснований. В качестве последних были использованы антибиотики широкого спектра действия стрептомицин (1) и канамицин (2), являющиеся О-гликозидами аминосахаров (рис. 2).

При проведении солеобразования (рис. 3) были определены оптимальные условия синтеза водорастворимых производных медьхлорина.

* 3 Н^Од

1 (Стр)

Рис. 2. Структурные формулы аминосахаров

(2 Кан)

СН=СН2 сн3

СН=СН2 сн3

СН=СН2 сн3

С2Н5

80 - 9С°с,

+ 3 Н2Ы-Р --------------►

120

СН2 СН2 СООН I СООН СН2 I

СООН

С2Н5

**СН—СН2*

I

ОТ5

80 °С,

120 мин

СН2 СН2 СОО * Н3ІЧ^

СН2 СОО *

I в о

СОО * Н3ІЧ-Р

Н3С-

Н3С'

СН-СН2"

2

О

СН2 СН2 СОО * Н3ІЧ-Р І I 0 ®

СН2 СОО * Н3ІЧ-Р I в 9

СОО * Н3ІЧ-Р

СН

3

СН

3

Рис. 3. Схема синтеза водорастворимых производных медьхлорина еб

Продукты гидрофилизации выделены в чистом виде. Непрореагировавший медьхлорин отделен центрифугированием, избыток аминогликозида - экстрагированием в системе вода : хлороформ. Сам продукт дополнительно очищали осаждением в системе вода-ацетон. Полученные продукты представляют собой кристаллические вещества темно-зеленого цвета для СиХлн е6-Кан и болотного цвета для СиХлн еб-Стр. Выходы составили соответственно 57 и 85%. Полученные производные медьхлорина водорастворимы. При стерилизации в физиологическом растворе гидролизуется не более 3% производного хлорина. При действии минеральных кислот полученные соединения разрушаются, так как в осадок выпадает исходный хлорин еб.

Для доказательства строения синтезированных производных хлорина были исследованы электронные спектры поглощения, в которых у всех производных имеются характерные для порфириновых систем полосы: интенсивная поглощения (lge 1,25) в области 414 нм (Соре) и две малоинтенсивные (lge 0,3-0,6) в «видимой» области при 609 и 639 нм. Нами установлено, что в результате процесса солеобразования между порфирином и гликозидами аминосахаров происходит батохромное смещение полос поглощения по сравнению с исходным порфирином.

Координационная иммобилизация производных медьхлорина е6

Для получения лекарственных препаратов с пролонгированным действием был использован процесс координационной иммобилизации производных медьхлорина на полимерную матрицу поливинилпирролидона (ПВП) с молекулярной массой 35000±5000. Введение полимера осуществляли к уже полученным производным порфирина и иммобилизацию проводили при оптимальных условиях синтеза этих производных. Полученные иммобилизаты были выделены в чистом виде экстрагированием в системе вода : хлороформ и осаждением в системе вода : ацетон (1 : 20). Они представляют собой вещества темно-зеленого цвета с глянцевым блеском, хорошо растворимые в воде. Выходы составили 97-98%.

Для подтверждения процесса комплексообразования с ПВП были измерены и изучены гидродинамические характеристики полимера и комплексов на его основе (табл. 1). По полученным данным были оценены молекулярная масса комплекса и мольное соотношение медьхлорин-аминогликозид : звено ПВП.

Из данных этой таблицы следует, что в полученных комплексах на основе поливинилпирролидона на

1 моль водорастворимого производного медьхлорина приходится 7 мономерных звеньев ПВП. Об этом говорит и увеличение молекулярной массы за счет «нанесения» низкомолекулярных соединений на полимерную матрицу.

Кроме этого, в ЭСП иммобилизатов по сравнению со спектрами низкомолекулярных аналогов происходит батохромное смещение полос в «видимой» области спектра с 609 и 631 нм до 612 и 650 нм, положение же полосы Соре не изменяется. Это также подтверждает наличие координационного связывания металлопорфиринового цикла с полимером.

Определение радиопротекторной активности у иммобилизатов

Для полимерных производных медьхлорина е6 на ПВП был проведен тест на 30-суточную выживаемость облученных мышей в дозе 9 Гр и определены средняя доза при 50%-ной выживаемости животных (СДзо) при введении синтезированных веществ и средняя продолжительность жизни (СПЖ) облученных животных.

При определении острой токсичности после введения соединения СиХлн е6-Стр-ПВП в дозировках 2000 и 1000 мг/кг отмечено резкое снижение дыхательных функций, возникновение клинических судорог и 100%-ная гибель в течение 10 мин. Снижение дозировки до 750 мг/кг привело к 100%-ной гибели животных с теми же симптомами в течение часа. Введение соединения в концентрации 500 мг/кг вызвало неоднозначный эффект: в одних случаях наблюдалась 100%-ная выживаемость, в других - 50%ная гибель. Введение дозировки 250 мг/кг не вызвало ни одного случая гибели на протяжении всех пяти суток наблюдения.

Таблица 1. Гидродинамические параметры ПВП и комплексов на его основе

Вещество [П], дл/г М*1000 Степень замещения

ПВП 0,200 35,6

СиХлн е6-Кан-ПВП 0,165 139,1 1 : 7

СиХлн е6-Стр-ПВП 0,087 149,1 1 : 7

Указано мольное соотношение порфирин : элементарное звено ПВП.

При исследовании острой токсичности СиХлн е6-Кан-ПВП наблюдалась аналогичная картина: введение дозировки 1000 мг/кг привело к гибели всех животных через сутки после введения; при 750 мг/кг погибло 70% за пять суток наблюдения; ни одного случая гибели не наблюдалось при 250 мг/кг. Таким образом, можно сделать вывод, что эти соединения также относятся к малотоксичным; СД50 для них находится в пределах 350-500 мг/кг.

Радиобиологический эксперимент проводили на мышах, которым вводили данные соединения в концентрации 300 мг/кг за 30 мин до облучения в дозе 9,0 Гр и фиксировали время жизни облученных животных в течение месяца. В качестве сравнения радиозащитного действия использовали радиопротектор-стандарт цистамин и контрольную группу животных, которым вместо радиопротектора вводилась дистиллированная вода. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Полученные результаты говорят о том, что при введении синтезированных соединений происходит значительное увеличение продолжительности жизни животных (например, для СиХлн е6-Стр-ПВП почти в

2 раза), хотя выживаемость после 30 суток несколько уступает таковой при введении радиопротектора-стандарта. В случае производного с канамицином также происходит увеличение продолжительности жизни облученных животных, однако процент выживаемости после окончания эксперимента - через 30 суток - слишком низок (20%).

Эти данные свидетельствуют о перспективности использования соединений в качестве радиопротекторов, особенно медьхлорин-стрептомицин на поливинилпирролидоне.

Таблица 2. Результаты радиобиологических испытаний

Вещество Выживаемость, % СПЖ, сутки

Цистамин 80 8,3 ± 0,3

СиХлн е6-Стр-ПВП 60 15,0 ± 2,5

Контроль 0 8,4 ± 1,4

Цистамин 80 8,3 ± 0,3

СиХлн е6-Кан-ПВП 20 10,5 ± 1,4

Контроль 0 8,6 ± 0,7

Выводы

Предложен способ гидрофилизации медьхлорина е6 за счет солеобразования с аминогликозидами.

Проведена координационная иммобилизации водорастворимых производных медьхлорина на

поливинилпирролидоне с соотношением порфирин : звено полимера как 1 : 7.

Изучение радиопротекторной активности водорастворимых производных медьхлорина показало, что

они обладают радиопротекторной активностью, несколько уступающей активности протектора-стандарта

цистамина.

Список литературы

1. Биш1 H. Jnhibitry effects of chlorophyllin on plasma fibrinoytic and cllotting enzymes // СИет. Abs. 1979. V. 90. №25. P. 38.

2. Kojima R. Effect of copper-chlorophyllin on the hemolytic activity of cobra toxin // ^em. Abs. 1979. V. 91. №5. P. 44.

3. Курыгина В.Т., Никитина Т.В. Влияние комплексов производных хлорофилла с металлами на активность панкреатической липазы // Биологические науки. 1981. №6. С. 31-34.

4. Баранова Р.А., Фрагина А.И., Черноморский С.А. Получение и применение хлорофиллсодержащих препаратов из хвои. М., 1973. С. 32.

5. Лукьяненко В.И., Фрагина А.И., Черноморский С.А. Антимикробные, регенеративные, дезодорирующие свойства препаратов хлорофилла. М., 1968. С. 34-35.

6. Бектуров Е.А., Шалхматов Ш.Ш., Роганев В.В. Практическое руководство по исследованию полимеров. Алма-Ата, 1983. 85 с.

7. Семейкин А.С. Синтез металлопорфиринов и их аналогов // Тезисы докладов IV Школы молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений. Иваново, 2000. С. 15.

8. Аскаров К.А., Березин Б. Д., Евстигнеева Р.П., Ениколопян Н.С. и др. Порфирины: структура, свойства, синтез. М., 1985. 333 с.

9. Тужилкова Г.Р., Кириллова Г.В., Пономарев Г.В. Лучевое воздействие, восстановление и химическая защита // Труды Института экологии растений и животных. Свердловск, 1978 . №113. С. 76-77.

Поступило в редакцию 25 декабря 2001 г.