CC BY
129
Раздел VII
РЕДАКЦИОННЫЙ ПОРТФЕЛЬ
УДК: 612.015 DOI: 10.12737/5935
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ САПРОПЕЛЯ оз. ГЛУБОКОЕ (Татарстан)
В .А. ПЛАТОНОВ, А.А. ХАДАРЦЕВ, К.Я. ФРИДЗОН, С.Н. ЧУНОСОВ
Медицинский институт, Тульский государственный университет, ул. Болдина, 128, Тула, Россия, 300026
Аннотация. Методами ИК-Фурье, УФ/ВИС, НЯМР-спектроскопии, хромато-масс-спектрометрии, препаративной тонкослойной хроматографии со свидетелями, элементного и функционального анализов получены подробные сведения о качественном и количественном составе отдельных групповых составляющих сапропеля оз. Глубокое (Татарстан), а также биологической активности различных сапропелевых препаратов. Разработана схема последовательной экстракции, кислотно-щелочного гидролиза, препаративной ТСХ исходного сапропеля и отдельных составляющих органического вещества. Идентифицированы аминокислоты, сахара, карбоновые кислоты, спирты, кетоны, флавоноды, н-, изо- и циклоалканы, витамины, производные фенола, нафтолов, хлорофилла, каротиноиды, хиноны, антоцианины, металлопорфирины, большинство из которых имеют тесную генетическую связь с исходным биоматериалом, участвовавшим в сапропелеобразовании, проявляющих высокую биологическую активность. Выполнено биологическое тестирование различных сапропелевых препаратов с использованием бактерий St. Aureus, E. Coli, C. Diphythriac gravis, дрожжеподобных грибов рода Candida. Установлен значительный бактерицидный эффект сапропелевых препаратов, сравнимый с таковым для синтетических антибиотиков типа гидрокартизона, преднизолона.
Ключевые слова: сапропель, фитопланктон, гуминовые вещества, хроматография, спектроскопия, хромато-масс-спектрометрия.
CHEMICAL COMPOSITION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF SAPROPEL FROM THE LAKE GLUBOKOE
(TATARSTAN)
V.A. PLATONOV, A.A. KHADARTSEV, K.YA. FRIDZON, S.N. TCHUNOSOV
Abstract. Detailed information about qualitative and quantitative composition of individual components of the group sapropel from the lake Glubokoe (Tatarstan), as well as on the biological activity of different sapropel preparations were obtained by means of the methods Fourier spectroscopy, UV/Vis, NMR spectroscopy, gas chromatography-mass spectrometry, preparative Thin-layer chro-matography (TLC) with witnesses, elemental and functional analysis. Sequential scheme of extraction, acid-alkaline hydrolysis, preparative TLC source of sapropel and individual components of organic matter was developed. Amino acids, sugars, carboxylic acids, alcohols, ketones, flavonida, n-, ISO - and cycloalkanes, vitamins, derivatives of phenol, naftalan, chlorophyll, carotenoids, quinones, antho-cyanins, metalloporphyrins were identified. Most of them have close genetic relationship with the source material, which is involved in sapropel formation, having a high biological activity. Biological testing of different sapropel preparations using bacteria St. Aureus, E. Coli, C. Diphythriac gravis, the fungi of the Candida albicans type were made. Significant bactericidal effect of sapropel preparations was established and it is comparable to those for synthetic antibiotics type hydrocortisone, prednisolone.
Key words: sapropel, phytoplankton, humic substances, chromatography, spectroscopy, gas chromatography-mass spectrometry.
Сапропель объединяет группу морских и пресноводных отложений, содержащих определенное количество органического вещества (ОВ). В сапропелевых отложениях озер и торфяников фрагменты исходного биологического материала сохранились лучше, чем в других горючих ископаемых. Исходным материалом сапропеля преимущественно является планктон, богатый жирами, восками и белками [1]. Богатое питание эвтрофных озер определяет многочисленные виды водорослевых и зоогенных частей [2]. Важной задачей является установление природы сапропе-леобразователей и их вклада в процесс образования сапропеля. Учеными-альгологами подробно изучен фитопланктон водоемов, представленный одноклеточными водорослями, некоторые из которых объединяются в колонии и нити, цианобактериями [3-6].
Фитопланктон озер Татарстана включает представителей отдела CYANOPHYTA: Aphanothece stagnina (Spreng.) B.-
Peters. Et Geitl., Gomphosphaeria compacta (Lemrs.) Storm, G., Micri-cystis holsatica Lemm., Anabaena flos-aguac (Lyngb.) Breb. и другие виды (преобладают в хорошо прогреваемой части озера);
CRYSOPHYTA: Mallomonas denticulate Motu., Uroglena gracilis (Korsch) Bourr. и др.;
BACILLARIOPHYTA: Cyclotella atomus Hust, Stephanodis-cus triporus var. volgensis Genkal, Fragilaria capucina Desm. Var. capucina, Entomoneis ornate (Bailey) Reimei и др. (в боле холодной части озера);
EUGLENOPHYTA: Euglena texta (Duj.) Hübner, Tracelo-monas ornate (swir.) Srv.;
CHLOROPHYTA: Chlamydomonas ahgulosa Dill, Eudorina elegans Her., Gonium peatorele O.F. Müller, Closterium acerosum (Schrank) Her. Var acerosum f. acerosum, наибольшее разнообразие видов рода Chloroco ecales - Coelastrum microporum Naeg. Var. microporum, Coenocystis planctonica Korsch., Tetrachorella alternans (G.M. Smithy, Korsch и др.) [7-9].
Основными компонентами фитопланктона являются белки и водорастворимые безазотистые вещества при невысоком вкладе жиров. В микрорастениях наряду с белками содержаться углеводы. Одним из исходных материалов при формировании ОВ сапропелей считаются липиды водорослей, содержащие алифатические кислоты нормального строения С14-С18.
Белки, полисахариды, жиры и нукленовые кислоты при отмирании фитопланктона быстро разрушаются на ранних стадиях превращения, в результате химического гидролиза и деятельности бактерий. Продукты распада -сахара, аминокислоты, основания пуринов и пиримидинов, жирные кислоты и фенолы могут взаимодействовать друг с другом с образованием гуминоподобных веществ.
Растительность озер представлена не только водорослями, но и высшими водными растениями, заселяющими придонные и прибрежные участки водоемов. В сапропелевых отложениях (осоке, камыша, тростников, мхов, коры лиственных и хвойных пород) в большом количестве концентрируются остатки пыльцы и спор высших растений. Макрорастения служат главным источником углеводного комплекса сапропелей, в том числе целлюлозной природы.
Отмечена закономерность: если преобладающим исходным материалом являются белки и липиды фито- и зоопланктона и бентоса, то гуминовые кислоты (ГК) сапропеля содержат больше алифатических структур. С увеличением вклада высшей растительности в образование ГК в органическом веществе сапропеля увеличивается содержание ароматических структур. В зоорганизмах преобладающими компонентами являются белки (56-61%) и водорастворимые вещества (ВРВ) - до 26%. Содержание жиров, восков и смол в планктоне и бентосе занимает лишь третье место.
В формировании биологической компоненты сапропеля наибольшую роль играют микроорганизмы, представленные различными бактериями, актиномицетами и в меньшей степени грибами. Отличительными особенностями сапропелеобразователей являются значительные количества азота, особенно, в зоологических организмах, что обусловило самый высокий уровень этого элемента в са-пропелях по сравнению с другими органогенными отложениями. Согласно Е. Казакову [10] микрорастения, зоологические организмы планктона и бентоса богаты белками, содержащими много азота, а макрорастения - углеводами. Поэтому, если в образовании сапропелевый залежи доминирующую роль играли фито- и зоопланктон и бентос, то ОВ сапропеля обогащено азотом, а если - макрорастения, высшая водная растительность или частично также «гумус», внесенный в водоем внешним водами, то ОВ сапропеля содержит много углеводов [11,12].
В настоящее время большинство исследователей придерживается мнения, что основная роль в сапропелеобра-зовании принадлежит водорослям, высшим растениям, животным и микроорганизмам. Химизм конкретных превращений исходного биологического материала в сапропелевой залежи до конца не изучен. Отсутствуют детальные исследования сапропелей различных месторождений по единой методике, что затрудняет проведение сравнительного анализа полученных данных, а также решение вопросов классификации и генезиса сапропелей, биологической активности препаратов на их основе.
Цель исследования - подробное комплексное изучение особенностей химического состава ОВ сапропеля оз. Глубокое (Татарстан) с привлечением современных физико-химических методов анализа; получение отдельных сапро-
пелевых препаратов и их биологическое тестирование.
Объекты и методы исследования - сапропель оз. Глубокое (р. Татарстан).
Для установления вещественного состава сапропеля были использованы: элементный, количественный функциональный, дифференциально-термический и дифференциально-термогравиметрический, рентгено-флуоресцентный и рентгенофазовый, эмиссионный спектральный, атомно-абсорбционный анализы, криоскопия, ИК-Фурье и УФ/ВИС-спектроскопия, НЯМР-спектроскопия, колоночная жидкостная и препаративная тонкослойная хроматография, экстракция растворителями различной полярности, гидролиз-щелочной и кислотный.
Результаты и их обсуждение. 1. Технический анализ сапропеля. Сапропель имеет вид уплотненной желеобразной массы, содержание воды - 86%, зольность (Ай) - 77,1 (% масс. на воздушно-сухой образец), содержание ОВ -22,9 (масс. % daf); элементный состав (масс. % daf): С 51.2; Н 2.0, N 2.3, О+Б 44.5.
Состав минеральной части согласно данным количественного рентгено-флуоресцентного анализа следующий (масс. % от зольной части): MgO - 3.10, АкОз - 7.12, БЮ2 -36.12, СаО - 28.77, МпО - 0.19, ТЮ2 - 0.85, Бе (общ.) - 3.81, К2О - 1.21, Р2О5 - 4.21.
Соотношение основных системоопределяющих компонентов: БЮ2/ СаО = 1.26; БЮ2/ Бе2О3 = 9.49; СаО/ Бе2О3 =7.55.
Современная компонентно-генетическая классификация, согласно полученным данным, позволяет отнести изучаемый сапропель к группе «высокозольные», типу «смешанные», классу «С».
Детализация сведений о составе минеральной части была выполнена с использованием полуколичественного эмиссионного спектрального и атомно-абсорбционного анализов: основа - Са, А1, Б1, Mg, Бе, в большом количестве -Ва, Na, К, Си; в небольшом - Сг, Со, V, Т1, Мп, в следовых -Бп, Бг, К Се, У, Ве, N1, Бс, РЬ, Pd, Р^
Химический групповой анализ сапропеля. Выход продуктов экстракции и кислотно-щелочного гидролиза сапропеля составил (масс. % от ОВ): водорастворимые вещества (ВРВ) - 0.5; битумы - 3.4; легкогидролизуемые вещества (геми-целюлозы) (ЛГВ) - 3.4; уроновые кислоты (УК) - 1.8; гуминовые кислоты (ГК) - 9.5, фульвокислоты (ФК) - 0.3, целлюлоза (Ц) - 1.3, негидролизуемый остаток (НГО)+потери - 2.7.
Для установления качественного и количественного состава гидролизов: ВРВ, ЛГВ, УК и ФК была привлечена препаративная тонкослойная хроматография (ТСХ) с использованием стандартных соединений.
Среди аминокислот обнаружены: Ь-а-аланин, лейцин, фенилаланин, валин, глицин, аспарагин, аргинин, лизин, гистидин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, тирозин, цистеин, триптофан, глутамин, серин, изолейцин, треонин.
Максимальное содержание аминокислот характерно (мг/кг сапропеля): для ЛГВ - 6903.0; минимальное для ФК -251.0.
Основу ВРВ составляют лейцин (615,3), аспаргиновая (152,2) и глутаминовая (104,5) кислоты, треонин (75,3), (мг/кг сапропеля), как наиболее стабильные при диагенезе. Среди ЛГВ доминируют лейцин (1435,2), аспаргин (1215,3), гисти-дин (2135,3), фенилаланин (501,8), валин (475,3) и глутами-новая кислота (357,2). Доля аминокислот достаточно велика и для УК - 1486,0 (мг/кг, сапропеля) и их гамма ограничена валином (213,5), гистидином (33,5), глутамином (833,4) и глутаминовой кислотой (40,2) (мг/кг сапропеля).
Среди Сахаров идентифицированы: арабиноза, Д-галактоза, Д-глюкоза, Ь-рамноза, лактоза, мальтоза, раффиноза.
Максимальным содержанием Сахаров отличаются УК (1624,5), минимальным ВРВ (13,1), (мг/кг сапропеля). Сахара ВРВ представлены, в основном, галактозой, Д-глюкозой, рамнозой, УК-галактозой (галактуроновые кислоты) (837,1), Д-глюкозой (444,2), Ь-рамнозой (177,3) и арабинозой (99,2), (мг/кг сапропеля); ФК - Д-галактоза (100,5), Д-глюкоза (57,5) и Ь-рамноза (22,0).
Водорастворимые карбоновые кислоты (ВРК) представлены: щавелевой, янтарной, адипиновой, пимелиновой, винной, яблочной, салициловой, о-фталевой, галловой, феруловой ванилиновой, сиреневой, терефталевой, бензойной, малоновой, метилянарной кислотами.
Максимальным содержанием ВРК отличаются УК (1103,8), минимальным ВРВ - 5,8 (мг/кг сапропеля). ВРК водного экстракта в основном представлены: щавелевой (1,3), янтарной (0,8), салициловой (1,0), бензойной (0,6) и малоновой (0,5) кислотами. В УК доминируют щавелевая (510,5), янтарная (393,2), салициловая (80,3) и метилянтар-ная кислоты (64,3), (мг/кг сапропеля). Некоторые количества аминокислот, сахаров, ВРК соизвлекается при щелочном гидролизе сапропеля в ходе выделения гуминовых веществ (ГВ), определяя состав их водорастворимой части - ФК. Вероятно, при щелочном гидролизе расщепляются слож-ноэфирные и амидные связи, посредством которых с макромолекулой ГК связаны аминокислоты и ВРК. Обнаружение моносахаридов (Д-глюкоза, Ь-арабиноза) может быть следствием гидролиза сложных полисахаридов, фрагментарно включенных в макромолекулу ГК.
Последовательной экстракцией сапропеля в аппарате Сокслета н-гексаном, толуолом, хлороформом, ацетоном и этанолом был получен ряд экстрактов, выход, элементный и количественный функциональный состав, значение средней молекулярной массы, Н/С(ат); степень окисленности (СО), гипотетическая молекулярная формула которых представлены в табл.
Таблица
Характеристика экстрактов
Примечание: ФГ - фенольные, КрГ - карбоксильные, КГ - кетонные, ХГ - хиноидные группы, ИЧ - йодное число, СО - степень окисленности, Н/С(ат) - атомное отношение водорода к углероду
Для экстрактов были сняты ИК-Фурье, УФ/ВИС и НЯНР-спектры, выполнена хромато-масс-спектрометрия (ХМС), сравнительный анализ данных которых позволил выявить особенности состава каждого экстракта и ОВ сапропеля в целом.
ИК-Фурье спектрометрия гексанового экстракта позволила идентифицировать в его составе полосы поглощения (п.п.) следующих структурных фрагментов (V, см-1):
- алканов с примесью циклоалкановых структур (2975, 2940, 2880, 2860, 1470, 1460, 1380, 1260, 970, 725);
- кратных связей (1680, 1645, 680); циклических спиртов (3500-3300, 1090-1070); ароматические соединения отсутствуют. УФ/ВИС-спектроскопия указала на присутствие в экстракте (нм): ненасыщенных карбоновых кислот и их производных (210, 265); производных фенолов (212, 270); ненасыщенных амидов, лактамов, а, р-кетонов (210); хино-нов (260); витамина К (260); ацетофенона (280); абиетиновой кислоты (240-250); стероидных производных типа холеста-диена и эргостена, тахистерина; кумаринов (220, 276, 311), порфириновых структур (405-410), флавоноидных гликози-дов (265-370).
НЯМР-спектроскопия показала присутствие альдегидов со среднестатистической структурой СНэ(СН2)9СНО, а также ундецилового спирта: СНэ(С№)9СН2ОН, окисление которого ведет к ундециловому альдегиду, а в дальнейшем к ундециловой кислоте, которая присутствует в сапропеле в виде эфира (триплет при 4.02 м.д.).
ИК-Фурье спектрометрия толуольного экстракта указала на наличие в его состава п.п. (V, см-1):
- алкановых и циклоалкановых фрагментов (2960, 2925, 2875, 1480, 1445, 1380, 1270, 1260, 970); ароматических циклов (3100-3020; дублет 1600/1500, 1280-1170, 1070-1000, 770-735, 750), которые, в основном, бензольные и нафталиновые;
- сложных эфиров (1190, 1165, 1050), кетонов и карбоновых кислот (1745, 1715, 1710, 1705, 1100), а- и у-пироновых кислот (1740-1720, 1650-1320, 1680-1650, 1590-1540);
- пиррольных циклов, вероятно, производных хлорофилла (3490, 3150, 3050, 1525, 1040, 750-690); спиртов, углеводов, кратных двойных связей (1650, 1600, 99, 960, 680).
УФ/ВИС-спектрография позволила обнаружить в то-луольном экстракте (нм): гиперицины (670, 610-620, 500); пиррольные пигменты (410-540); каротиноиды, флавонои-ды, производные фенилкетонов, ненасыщенных кетонов, хинонов, витамина К (260, 280); стероидные дикетоны (260340); дикетоны дитерпенового ряда (318, 319); р-ионон (300, 340), метоксикумарины (240, 260, 340); производные витамина А; соединения нафталинового ряда (270-285), эргосте-рин (280, 340, 350). Спектр Н-ЯМР позволяет среднестатистическим алкильным радикалам приписать структуры СН3(СН2)7- и СН3(СН2)6-; присутствуют большие количества большие количества циклогексановых или циклогексено-вых фрагментов.
ИК-Фурье спектроскопия хлороформного экстракта указала на присутствие в нем п.п. (V, см-1):
- интенсивных п.п. алканов и циклоалканов с высоким вкладом кратных связей (2960, 2925, 2875, 3030-3025, 1680, 1480-1445, 1380, 1270, 1260, 970, 680); циклических спиртов (3400, 1810, 1030-1080); серусодержащих соединений (1950). Присутсвуют тетрапиррольные пигменты (3490, 3125-3100, 1600-1500).
УФ/ВИС-спектроскопия позволила идентифицировать (н.м.): производные флавонолов (246, 251); ненасыщенные лактоны и сложные эфиры (200, 222, 240); эргостерин (260, 270, 282), токсистерин (248), супрастерин (250), метоксикумарины (240, 260, 340); производные фенилкетонов, ненасыщенные кетоны, хиноны, витамин К (260, 280), дитерпены
№ Экстракт Выход экстракта, Масс. % от ОВС Молекулярная масса (М), а.е.м.; элементный (масс. % (!а£); функциональный состав (мг-экв/г), Н/С(ат); СО. Гипотетическая молекулярная формула
1 Гексановый 0,5 М 637.8; С 85.8; Н 10.6; N 0.1; О+Б 3.5 ФГ 4.52; КрГ 0.07; ИЧ 0.74. С«.60Н67.60№.05; О1Б0.63; Н/См=1.48; СО= -1.42
2 Толуольный 0,8 М 333.1; С 83.8; Н 13.0; N 0.2; О+Б 3.0 ФГ 13.65; КрГ 9.30; КГ 9.8; ХГ 0.73; ИЧ 0.85. С23.27Н43.3№.05О180.63; Н/С(ат)=1.86; СО= -1.81
3 Хлроформный 0,3 М 484.0; С 72.1; Н 11.4; N 6.8; О+Б 9.7 ФГ 17.05; КрГ 12.32; КГ 8.25; ХГ 2.61; ИЧ 1.19. С29.09Н55.в№.35О18294; Н/См=1.90; СО= -1.70
4 Ацетоновый 0,5 М 583.0; С 76.8; Н 11.2; N 2.0; О+Б 10.0 ФГ 9.64; КрГ 9.56; КГ 14.48; ХГ 2.39 С37.33Н 65.33№.83О183.64; Н/С(ат) = 1.75; СО= -1.55
5 Этанольный 1,3 М 815.0; С 73.4; Н 9.3; N 3.1; О+Б 14.2 ФГ 22.59; КрГ 13.23; КГ 3.95; ХГ 4.39; ИЧ 1.20. С49.86Н75.74№.80О157.24; Н/См=1.52; СО= -1.23
- производные абнетиновой кислоты, стероидные дикетоны (260, 340), хлорофилл «А», «В», «С» (640, 655, 660, 665, 670), производные фенола (265), порфириновые структуры (390415), моноциклические производные бензола (225, 265).
Среднестатистические алкильные радикалы имеют формулу СНз(СН2)8-; содержатся значительные количества карбонильных соединений (сложные эфиры), меньше -производных спиртов (НЯМР-спектроскопия).
ХМС позволила идентифицировать в составе хлороформного экстракта: н-октан, 1-этил-2-метил-циклопентан, н-пропилциклопетан, винилциклогексиловый эфир, этил-бензол, о-, п-ксилолы, бензойную кислоту, 1-ундецен-3-уне, 3-тридоцен (2), н-нонан, 1-метил-3-изопропилциклопентан, 7-гексадецен (2), 1-гексадеканол, циклододекан, гексадекан, 3, 7, 11-триметил-1-додеканол, тетрадекановую кислоту, 10-генэйкозен; 9-нонадецен, октакозан, 1-октадецен, 3-октадецен, 6, 10, 14-триметил-2-пентадеканон, 9-гентадеканон, бутилундецилфталевый эфир, 1-нонадецен, 10-генэйкозен (с, Ц, 18-норабиетан, 1-октадецин, олеиновую кислоту, 14-метил-8-гексадеканаль (2), октадекановую кислоту; 9-тетрадеканаль (2); 9-трикозен (2); гептадекан; 1,3-диметилбутилциклогексан, 2-метилоктакозан, 4, 8, 12, 16-тетраметилгептадекан; эйкозановую кислоту, 9-трикозен (2), триаконтан, пентадеканаль, дегидроабиетиновую кислоту, 2-метилтетракозан, декозановую кислоту, генэйкозан, у-токоферол, бетулин, холеста-4.6-диен-3-ол, 2-гексакозан, витамин Е, эргост-5-ен-3-ол, стигмастерол, р-ситостерол.
ИК-Фурье спектроскопия показала (V, см-1), что ацетоновый экстракт характеризуется присутствием ароматических структур, а именно производных бензола и нафталина (31003020, дублет 1600/1500, 1070-1000, 1280-1170, 770-735, 750).
Значителен вклад сложноэфирных (1190, 1165, 1050) и карбоксильных групп (1745, 1715, 1710, 1705, 1100); кетонов, а- и у-пиронов (1740-1720, 1680-1650, 1650-1620, 1650-1600, 1590-1540). Идентифицированы пиррольные циклы, вероятно, производных хлорофилла (3490, 3525, 3050, 1040 750690); спирты, возможно, и углеводы (1300-1150, 1150-950, 970, 930, 915, 895, 840, 770); существенен вклад кратных двойных связей (1650, 1600, 990, 960, 680). УФ/ВИС-спектроскопией (н.м) обнаружены порфирины (459, 500-547, 402, 500, 531, 560, 624), возможно, №, У-порфирины; индолы, витамин К (270); сопряженные пиррольные циклы типа хлорофиллов, порфиринов (459, 508, 547); хлорофилл «А» (370, 531, 590, 402, 624, 655, 700); хлорофилл «В» (453, 547, 655, 682, 590); хлорофилл «С» (590, 624, 655, 402, 453), каротиноиды, производные витамина А (459, 480-494, 500-547, 560); хлорины (683, 695, 655, 590, 531, 503, 402); п-комплексы металлов с фенольными и хиноидными группировками (459); пигменты пурпурных бактерий (480, 531), антоцианы (487, 509, 531).
Согласно данным НЯМР-спектроскопии в ацетоновом экстракте присутствуют соединения с различными алкиль-ными фрагментами. Отношение интенсивностей метиль-ных и метиленовых протонов позволяют приписать средне-стастическому алкильному радикалу структуру СН3(СН2)8-; присутствуют эфирные фрагменты; преобладают -СН2О-группы.
ИК-Фурье спектроскопия этанольного экстракта позволила установить (V, см-1), что он характеризуется высоким содержанием СН, СН2, СНэ-групп алканов и в меньшей степени циклоалканов (2980, 2925, 2860, 2740, 1465, 1480, 1450, 1380, 1310, 1260, 980, 730). Отмечены слабые п.п. ароматических фрагментов (3090, 3070, 3015, дублет 1600/1500. серия п.п. в областях 1200-900, 900-650). Средней интенсивности п.п. карбонильных и карбоксильных групп (3100-2500, 2740-2680, 1720-1700, 1315-1280, 960-875); кратных двойных связей (1650, 1605, 970, 960, 680). УФ/ВИС-спектроскопия
указала на наличие (н.м): гиперицина (670), пиррольных пигментов (410-540), каротиноидов, флавоноидов, ненасыщенных карбоновых кислот и их производных (200, 220); бензольных циклов (200, 260), полициклических ароматических соединений, в основном, нафталинового ряда (220, 275, 240, 310, 215), енолов (220, 325), предельных и ненасыщенных кетонов (275-250, 300, 380-385, 365-368). Л-дикетонов, стероидных производных (320), ненасыщенных лактонов и сложных эфиров (205, 220, 240), индолов, витамина К (270), фео-фитина (500, 515, 660), хромонов (630), производных флаво-нолов (245, 250, 370); хлорофилла «В» (450, 548, 645); токси-стерина (245), супрастерина (250), люминистирина (270-275), тахистерина (268, 280, 295), эргостерина (260, 270, 280, 295). Относительные интенсивности сигналов протонов СН2- и СН3-групп позволяют приписать среднестатистичсекому алкильному радикалу структуры СН3(СН2)8- и СН3(СН2)7-. В области слабых полей в интервале 8,8-7,6 м.д. наблюдается очень широкий сигнал ароматических протонов, характеризующий многообразие индивидуальных соединений (НЯМР-спектроскопия).
2. Химический состав гуминовых кислот (ГК). Выход ГК - 16.6 (масс. % ОМС); средняя молекулярная масса -1035.8 а.е.м., - 15.6 (масс. %); элементный (масс. % daf): С 47.4, Н 4.5, N3.4, О+Б 44.7; функциональный состав (мг-экв/г): ФГ 12.94, КрГ 9.41, КГ 1.51, ХГ 4.07, ИЧ 1.58. в составе минеральной части обнаружены: Mg, Л1, Б1, Са, Мп, Т1, Бе, Ва, Си, Се, Со, У, Сг, Бп, Се, N1, Бе, Р3М.
В ИК-Фурье спектра ГК идентифицированы п.п. (V, см-х) следующих структурных фрагментов:
- ароматических ядер (3100-3000, дублет 1600/1500, серия п.п. в областях 1200-900, 900-650), которые невысокой степени конденсации (1200-950, 900-656), а именно бензольные и нафталиновые, что также подтверждается отсутствием ярко выраженного максимума (3030), обусловленного валентными колебаниями групп -СН в конденсированных ароматических системах. Однако, отсутствие п.п. (3030) не является однозначным аргументом в пользу чисто алифатической природы ГК, а указывает на высокую степень замещения атомов водорода в шестичленных циклах, что подтверждается серией п.п. (3070-3040, 1500-1460, 1590-1475, 920-650), обусловленных присутствием алкильных заместителей различной длины: ди- и тризамещенные с ненасыщенными двойными связями (3040, 2975, 3080, 1665, 1600, 1415, 1405, 990, 960, 940, 884, 810, 680, 660-810), возможно присутствие терпенов;
- СН-, СН2-, СНэ-групп алкановых и циклоалкановых структур (2975, 2921, 2875, 2854, 2740, 1455, 1450, 1390, 1315, 1260, 980, 745, 720). С учетом весьма слабой интенсивности п.п. (720) длина алкильный цепей незначительная (2925, 2875, 2854, 1460, 990, 720), а именно (СН2)п, где п>4;
- карбонильных и карбоксильных групп (2750, 2675, широкие п.п. 3100-2500 и 960-865, 1315-1260), кетонных групп (1740, 1719, 1700, 1685, 1110), в т.ч.: ненасыщенные (1685) и а-гидроксикетоны (1740-1719, 1665-1617, 1565-1545), карбоновых кислот (3000-2500, 1740, 1719, 1435, 1300-1200), метиловых эфиров жирных кислот с длинной цепью (триплет п.п. 1250, 1213, 1175), эфиров ненасыщенных кислот (1260-1163) и а-, р-ненасыщенных кислот (1300-1160), сложных эфиров и лактонов (1750, 1740, 1740-1719, 1450-1435, 1345-1360, 1190, 1150, 1050, 790-755), формиатов (1200-1170), ацетатов (1260-1220), алкоксильных групп (2900, 1225-1200, 1070-1020, 810);
- ОН-групп фенолов и спиртов (3650-3595) - несвязанная группа -ОН, межмолекулярные (3550-3200) и внутримолекулярные (3570-3450) водородные связи для соединений с одном мостиком; полимеров (3400-3200); деформационные
колебания групп -ОН и валентные С-О фенолов (1405-1315, 1200); первичных (1260-1345, 1050), вторичных (1360-1260, 1100) и третичных спиртов (1405-1315, 1150), стеролов (3040, 1665, 940, 840, 810), в частности, п.п. (3450-3405, 1075, 970, 840, 810) - p-ситостерин; углеводов (920, 895, 940-920, 840, 770), полисахаридов (1075-1050, 755, 745, 477);
- простых эфиров (1150-1060); ароматических и других простых эфиров с группой = С-О- (1260-1220); хинонов (1685-1665) - две группы СО в одном кольце; (1665-1637) -две группы СО в двух кольцах;
- сопряженных пиррольных колец порфиринов, хло-рофиллов (3535, 3520, 3490, 3040, 3150, 1520, 1042, 755-680), пиридиновых, хинолиновых, пиперидиновых (3450, 34803450, 3370-3300, 1490, 1360-1260, 745) и тиофеновых гетеро-циклов (3125-3040, 1520, 1050, 865, 840, 755-680), аминокислот (3130-3030, 1665-1617, 1545-1485, 1600-1565); первичных (3500, 3405, 3350, 3180) и вторичных аминов (3450-3405, 3440-3425, 3325-3270, 3180-3140, 1685, 1650), первичных и вторичных амидов (полоса амид - II) (1665-1617, 1565-1520), сульфидов (660-605, 705-565) и дисульфидов (465-415): алифатических (1740-1719) и ароматических альдегидов (2965-2830, 2720, 1410-1685, 1665, 1390).
УФ/ВИС-спектр ГК характерен для присутствия в их составе (н.м.): ненасыщенных карбоновых кислот и их производных (200, 220), нафталиновых колец (212, 220, 240, 270, 310); п-комплексов металлов с фенольными и хиноидными группировками (445-450); каротиноидов, производных витамина А, дикетонов, ненасыщенных кетонов (450-455, 480495, 415), сопряженных пиррольных циклов, типа порфиринов, хлорофиллов (450, 510, 545), порфиринов (408, 525, 720, 760), бензольных колец (200, 260), хлорофилла «а» (340, 420, 450-455, 495, 645, 685, 700, 710-720), хлорофилла «Ь» (450455, 580, 645), хлорофилла «с» (450-455, 645, 685), бактерио-хлорофилла «а» (475), Л-дикетонов (стероидные и их произ-водные)(340-350, 280), ненасыщенных лактонов и сложных эфиров (200, 220-230, 240).
В ЯМР-Н спектре ГК установлено присутствие парамагнитных частиц, вероятнее всего ионов Fe (II) и Co (III). Широкая п.п. ароматических протонов (от 8,5 до 6,3 м.д.) свидетельствует о присутствии в составе ГК бензольных и нафталиновых колец, несущих в качестве заместителей группы COOR, OR, А1к.отношение интегральных интенсив-ностей полос поглощения: (0.83 м.д. - протоны концевых СИэ-групп и 1.24 м.д. - протоны СН2-групп) позволяет приписать среднестатистическому алькильному радикалу структуру СН3(СН2)6-. Отношение числа ароматических и алифатических протонов - 13:16.
Таким образом, химический состав ГК достаточно сложный, полифункциональный, включает, преимущественно, неконденсированные ароматические, фурановые и пиррольные гетероциклы, с высоким вкладом алифатических заместителей, циклоалкановых фрагментов, кратные двойные связи.
3. Биологическая активность препаратов на основе сапропеля оз. Глубокое (Татарстан). 3.1. Биологическая активность ГК. Биологическая активность ГК изучалась на музейных штаммах кишечных микроорганизмов: Escherchia coli, Shigella sonnie, C. Freundii, грамположительных кокков -Staphylococcus aureus и грибах рода Candida, а также на высокотребовательном к питательным веществам культур штамм Corynebacterium diphtherial gravis, растущий на средах с добавлением нативного белка крови. Биологическое действие солей ГК изучалось с применением нескольких методик исследования.
Методом «стандартных дисков», рекомендованным Министерством здравоохранения РФ для исследования
биологической активности изучались щелочные растворы ГК исходного сапропеля с концентрациями 3.09, 1.54, 0.77, 0.38 и 0.19 г/л и дебитуминизированного с концентрациями 3.02, 1.52, 0.76, 0.38 и 0.19 г/л. При этом отмечено незначительное увеличение роста микроорганизмов вблизи дисков при концентрациях ГК 3.09 и 3.02 г/л на культуре Staphylo-coccus aureus.
Было изучено также биологическое действие «водных растворов» солей ГК исходного и дебитуминизированного сапропеля, с концентрацией 0.4% (0.4% раствор гумата калия в 0.05% растворе КОН). На 10 мл питательного агара добавлялись 1 и 3 мл исследуемого раствора. В качестве контроля использовались параллельные посевы идентичных микроорганизмов на питательном агаре. Посев микроорганизмов осуществляли количественно - методом серийных разведений, с высевом по 1000, 100 и 10 микробных клеток. Учет биологической активности проводился визуально по количеству выросших колоний и их морфологии.
Для солей ГК наблюдали усиление роста микроорганизмов, что выражалось в характере колоний. Колонии энтеробактерий, стафилококка и грибов рода Candida были крупными (2-3 мм), по сравнению с контролем (1.0-1.5 мм), с характерными свойствами для каждого вида.
Рост высокотребовательного микроорганизма C. diph-theriae (токсичный вариант) отмечался только при добавлении в среду гумата калия. В контроле рост отсутствовал.
При исследовании ГК (исходная проба 1), дебитуми-низированный сапропель (проба 2) и декальцинированный (проба 30 на штаммах Escherichia coli, Staphylococcus aureus и грибах рода Candida были получены следующие результаты:
1. Опыт с E. coli контроль - 425 колоний, пробы 1, 2, 3 -сливный рост - больше 1000 колоний;
2. Опыт с St. aureus - контроль 428 колоний, пробы 1, 2, 3 - сливный рост - больше 1000 колоний;
3. Опыт с грибами рода Candida: на всех чашках примерно одинаковое число колоний - 420.
Полученные результаты позволили сделать вывод, что соли ГК обладают стимулирующим действием по отношению к E. Coli и St. Aurenus. Это можно объяснить присутствием в составе ГК биологически активных веществ, феноль-ных, хиноидных и карбоксильных групп, стимулирующих рост микроорганизмов в т.ч. и высокотребовательных к питательным веществам.
3.2. Биологическое тестирование ВРВ. При исследовании ВРВ исходного (проба 1) и дебитуминизированного сапропеля (проба 2) с использованием штаммов E. coli, St. aureus и грибах рода Candida получили следующие результаты:
1. Опыт с E. coli контроль - 340 колоний, пробы 1 - 72, проба 2 - 102 колоний;
2. Опыт с St. aureus - контроль - 425, проба 1 - 109, проба 2 - 210 колоний;
3. Опыт с грибами рода Candida: на всех чашках примерно одинаковое число колоний - 420.
Таким образом, можно констатировать, что ВРВ сапропеля обладают ингибирующим действием на бактерии E. coli и St. aureus, обусловленного, по-видимому присутствием терефталевой, бензойной и салициловых кислот.
3.3. Биологическое тестирование ФК. Исследовали параллельно растворы ФК исходного, дебитуминизированно-го и декальцинированного сапропеля и их солей. Учет биологической активности осуществляли визуально по количеству выросших колоний и их морфологии.
В опытах с ФК отмечалось подавление роста E. coli и St. aureus в 10 раз и более, причем ФК дебитуминизированного сапропеля обладали более выраженными антибактериаль-
ными свойствами. В опытах с калиевыми солями ФК наблюдался сливной рост микроорганизмов.
Соли ФК исходного (проба 1), дебитуминизированно-го (проба 2) и декльцинированного (проба 3) сапропеля исследовались с использованием штаммов E. coli и St. aureus:
1. Опыт с E. coli контроль - 368 колоний, пробы 1, 2, 3 -сливный рост - больше 1000 колоний;
2. Опыт с St. aureus - контроль 540 колоний; пробы 1, 2, 3 - сливный рост - больше 1000 колоний.
Получено подтверждение о необходимости присутствия ионов К+ в растворе для стимуляции роста микроорганизмов, а также угнетающее влияние ионов Н+. Высокая биологическая активность солей ФК обусловлена наличием в их составе большого количества галловой, феруловой, янтарной и метилярной кислот, являющихся субстрактом для дыхания различных растительных организмов и микробов.
Выводы:
1. Впервые получена детальная информация о вещественном составе сапропеля оз. Глубокое (Татарстан).
2. Разработана схема последовательной экстракции, кислотно-щелочного гидролиза, препаративной ТСХ исходного сапропеля и отдельных составляющих органического вещества.
3. Методами ИК-Фурье, УФ/ВИС, НЯМР-спектроскопии, ХМС в составе сапропеля идентифицированы аминокислоты, сахара, карбоновые кислоты, спирты, кетоны, флавоноды, н-, изо- и циклоалканы, витамины, производные фенола, нафтолов, хлорофилла, каротинои-ды, хиноны, антоцианины, металлопорфирины, большинство из которых имеют тесную генетическую связь с исходным биоматериалом, участвовавшим в сапропелеобразова-нии, проявляющих высокую биологическую активность.
4. Выполнено биологическое тестирование различных сапропелевых препаратов с использованием бактерий St. Aureus, E. Coli, C. Diphythriac gravis, дрожжеподобных грибов рода Candida. Установлен значительный бактерицидный эффект сапропелевых препаратов, сравнимый с таковым для синтетических антибиотиков типа гидрокартизона, преднизолона.
Литература
1. Потонье Г. Сапропелита. М: Изд-во журн. нефт. и сланц. хоз., 1920. 45 с.
2. Potonie R. Uber die Heilschlamm (Gyttja) - Lagerstatte des Schollener Sees Bei Rathenow // Jahrb. D. Preuss. Geolog. Landesanst. Zu Berlin. 1938. Bd. 58
3. Винберг Г.Г. Первичная продукция водоемов. Минск: Из-во Академии наук БССР, 329 с.
4. Жадин В.И., Герд С.В. Реки, озера и водохранилища СССР, их флора и фауна. М., 1961. С. 273-280.
5. Казаков Е.И., Пронина М.В. Химический состав различных форм планктона и бентоса // Тр. лаборатории генезиса сапропеля. 1941. № 2. С. 49-57.
6. Ларгин И.Ф., Шадрина Н.И. Геология сапропелевых отложений: (Основы сапропелеведения): Учеб. Пособие: Калинин. политехн. ин-т, 1989. 71 с.
7. Балонов И.М. Виды рода Synura Lemm. (Chrysophyta) Волги и ее бассейна (Волга-2) // Биология внутренних вод. 1976а. № 29. С. 16-19.
8. Генкал С.И. Атлас диатомовых водорослей планктона р. Волги. СПб: Гидрометеоиздат, 1992. 127 с.
9. Каталог растений и животных водоемов бассейна Волги / Отв. ред. В.Н. Яковлев; Ин-т биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина. Ярославль: Изд-во ЯГТУ; 2000. 309 с.
10. Казаков Е.И. Генезис и химическая природа пресноводных сапропелей // Тр. ин-та горюч., ископаемых. 1950. Т. 2. С. 253-266.
11. Платонов В.В., Хадарцев А.А., Фридзон К.Я. Химический состав и биологическая активность сапропеля оренбургской области (п. Соль-Илецк), генетическая связь с составом сапропелеобразователей // Вестник новых медицинских технологий (электронный журнал).- 2014. URL: http://medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/4873.pdf
12. Платонов В.В., Хадарцев А.А., Фридзон К.Я. Генетическая связь биологической активности сапропеля астраханской области с исходным растительным и животным материалом // Вестник новых медицинских технологий (электронный журнал).- 2014. URL: http://medtsu.tula.ru /VNMT/Bulletin/E2014-1/4872.pdf
References
1. Poton'e G. Sapropelita. Moscow: Izd-vo zhurn. neft. i slants. khoz.; 1920. Russian.
2. Potonie R. Uber die Heilschlamm (Gyttja) - Lagerstatte des Schollener Sees Bei Rathenow. Jahrb. D. Preuss. Geolog. Landesanst. Zu Berlin; 1938.
3. Vinberg GG. Pervichnaya produktsiya vodoemov. Minsk: Iz-vo Akademii nauk BSSR; 329 s. Russian.
4. Zhadin VI, Gerd SV. Reki, ozera i vodokhranilishcha SSSR, ikh flora i fauna. Moscow; 1961. Russian.
5. Kazakov EI, Pronina MV. Khimicheskiy sostav raz-lichnykh form planktona i bentosa. Tr. laboratorii genezisa sapropelya. 1941;2:49-57. Russian.
6. Largin IF, Shadrina NI. Geologiya sapropelevykh ot-lozheniy: (Osnovy sapropelevedeniya): Ucheb. Posobie: Kalinin. politekhn. in-t; 1989. Russian.
7. Balonov IM. Vidy roda Synura Lemm. (Chrysophyta) Volgi i ee basseyna (Volga-2). Biologiya vnutrennikh vod. 1976a;29:16-9. Russian.
8. Genkal SI. Atlas diatomovykh vodorosley planktona r. Volgi. SPb: Gidrometeoizdat; 1992. Russian.
9. Katalog rasteniy i zhivotnykh vodoemov basseyna Volgi / Otv. red. V.N. Yakovlev; In-t biologii vnutrennikh vod im. I.D. Papanina. Yaroslavl': Izd-vo YaGTU; 2000. Russian.
10. Kazakov EI. Genezis i khimicheskaya priroda pres-novodnykh sapropeley. Tr. in-ta goryuch., iskopaemykh. 1950;2:253-66.
11. Platonov VV, Khadartsev AA, Fridzon KYa. Khimi-cheskiy sostav i biologicheskaya aktivnost' sapropelya oren-burgskoy oblasti (p. Sol'-Iletsk), geneticheskaya svyaz' s sosta-vom sapropeleobrazovateley [Chemical composition and biological activity of sapropel in the orenburg region (v. sol-iletsk), genetic link with the composition of the sapropel formers]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy (elektronnyy zhur-nal) [Internet]. 2014 [cited 2014 Jul 3];1:[about 8 p.]. Russian. Available from: http://medtsu.tula.ru/VNMT/ Bulletin/E2014-1/4873.pdf
12. Platonov VV, Khadartsev AA, Fridzon KYa. Geneti-cheskaya svyaz' biologicheskoy aktivnosti sapropelya astrak-hanskoy oblasti s iskhodnym rastitel'nym i zhivotnym materia-lom [chemical composition and biological activity of sapropel in the orenburg region (v. Sol-Iletsk), genetic link with the composition of the sapropel formers]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy (elektronnyy zhurnal) [Internet]. 2014 [cited 2014 Jul 3];1:[about 6 p.]. Russian. Available from: http://medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/4872.pdf
