CC BY
14
© Коллектив авторов, 2023
Шиловский И.П.1, Юмашев К.В.1, Кожихова К.В.1, Вишнякова Л.И.1, Смирнов В.В.1 2, Гудима Г.О.1, Брылина В.Е.2, Каганова М.М.1' 3, Никольский А. А.1, Тимотиевич Е.Д.1, Ковчина В.И.1, Русак Т.Е.1' 2, Шатилова А.В.1, Шатилов А. А.1, Андреев С.М.1, Кудлай Д.А.1, 2, Хаитов М.Р.1 4
Синтетический пептид, имитирующий антигенный сайт белка F, подавляет инфекцию респираторно-синцитиального вируса в экспериментах in vitro
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 109472, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) - один из самых распространенных патогенов, вызывающих заболевания дыхательных путей. К настоящему времени не создано эффективной вакцины против РСВ-инфекции, а использование моно-клональных антител для иммунопрофилактики ограничено их высокой стоимостью. Для фармакотерапии применяют рибавирин, однако он вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Один из перспективных подходов - использование природных и синтетических пептидов в качестве антивирусных средств. Детальное раскрытие структуры вириона позволило установить ведущую роль поверхностного гликопротеина вируса (белка F) в инфекционном процессе. Молекулярное и иммунологическое картирование белка F позволило идентифицировать внутри него функциональные домены HR-1 и HR-2, подвижность которых обеспечивает слияние вириона с клеткой. При этом внутри домена HR-1 располагается так называемый нулевой антигенный сайт 0, инактивация которого существенно тормозит инфекционный процесс.
Цель исследования - проектирование пептида, имитирующего антигенный сайт 0 белка F (пептид КК-44), и его разветвленного аналога (КК-45), а также изучение противовирусных свойств этих пептидов в отношении РСВ.
Материал и методы. Пептиды были синтезированы твердофазным методом, для очистки применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подлинность подтверждали методом масс-спектрометрии. Цитотоксичность изучали в МТТ-тесте. Антивирусную активность изучали в экспериментах in vitro на культуре клеток МА-104, чувствительных к РСВ. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) изучали способность пептидов взаимодействовать с РСВ и с клеточным рецептором.
Результаты. Продемонстрировано, что линейный пептид КК-44 связывался с вирусом, но не оказывал существенного влияния на инфекционный процесс. В то же время разветвленный аналог (пептид КК-45) значительно ингибировал РСВ-инфекцию in vitro за счет следующих возможных механизмов: 1) взаимодействие с белком слияния F, что препятствует его функционированию; 2) конкурентное ингибирование рецептора - белка нуклеолина.
Заключение. Разветвленный пептид КК-45 обладает антивирусными свойствами по отношению к РСВ, что делает его перспективным для возможного терапевтического применения.
Ключевые слова: РСВ-инфекция; противовирусные пептиды; антигенный сайт 0; лабораторные животные
Для корреспонденции
Шиловский Игорь Петрович -доктор биологических наук, заместитель директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Статья получена 13.02.2023. Принята в печать 17.03.2023.
Для цитирования: Шиловский И.П., Юмашев К.В., Кожихова К.В., Вишнякова Л.И., Смирнов В.В., Гудима Г.О., Брылина В.Е., Каганова М.М., Никольский А.А., Тимотиевич Е.Д., Ковчина В.И., Русак Т.Е., Шатилова А.В., Шатилов А.А., Андреев С.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Синтетический пептид, имитирующий антигенный сайт белка F, подавляет инфекцию респираторно-синцитиального вируса в экспериментах in vitro. Иммунология. 2023; 44 (2): 134-146. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-134-146
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-00182, https://rscf.ru/project/22-25-00182/.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шиловский И.П., Хаитов М.Р.; сбор и обработка материала - Тимотиевич Е.Д., Никольский А.А., Кожихова К.В., Ковчина В.И., Вишнякова Л.И., Юмашев К.В., Каганова М.М., Русак Т.Е., Шатилова А.В., Шатилов А.А.; статистическая обработка - Андреев С.М., Шиловский И.П.; написание текста - Шиловский И.П., Юмашев К.В.; редактирование - Гудима Г.О., Кудлай Д.А., Андреев С.М., Смирнов В. В., Брылина В.Е.
Shilovskiy I.P.1, Yumashev K.V.1, Kozhikhova K.V.1, Vishnyakova L.I.1, Smirnov V.V.1' 3, Gudima G.O.1, Brylina V.E.2, Kaganova M.M.1 2, Nikolskii A.A.1, Timotievich E.D.1, Kovchina V.I.1, Rusak T.E.1 3, Shatilova A.V.1, Shatilov A.A.1, Andreev S.M.1, Kudlay D.A.1 3, Khaitov M.R.1 4
A synthetic peptide mimicking the antigenic site of F protein suppresses of respiratory syncytial virus infection in vitro
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Skryabin of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation, 109472, Moscow, Russian Federation
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
4 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Respiratory syncytial virus (RSV) is one of the most common pathogens causing respiratory diseases. There are no effective vaccines against RSV infection. At the same time, the use of monoclonal antibodies for immunoprophylaxis is limited by its high cost. Ribavirin is used for pharmacotherapy, but it causes numerous side effects. One of the most promising approaches is the use of natural and synthetic peptides as antivirals. Detailed studies of virion structure identified leading role of viral glycoprotein F in initiation of the infection. Molecular and immunological mapping of the F protein revealed the functional HR-1 and HR-2 domains. The flexibility of these domains provides the fusion of the virion with the cell. At the same time, inside HR-1 domain was identified so-called zero antigenic site 0. Inactiva-tion of this site significantly inhibits the infectious process.
The aim of the study was to design a peptide that mimics the antigenic site 0 of the F protein and its branched analog and study the antiviral properties of these peptides against RSV.
Material and methods. The peptides were synthesized by the solid phase method, and the high-performance liquid chromatography was used for purification. Authenticity was confirmed by mass spectrometry. Cytotoxicity was studied in the MTT test. Antiviral activity was studied in in vitro experiments using MA-104 cell culture, which in sensitive to RSV. The ELISA was used to study the ability of peptides to interact with RSV and with the cell receptor.
Results. Linear peptide KK-44 interacted with the virus, but had no significant effect on the infectious process. At the same time, the branched analog (KK-45 peptide) significantly inhibited RSV infection in vitro using several possible mechanisms: 1) by interacting with the F fusion protein, preventing its functioning; 2) by competitive inhibition of the receptor -nucleolin protein.
Conclusion. The branched peptide KK-45 possesses antiviral properties against RSV, which makes it promising for possible therapeutic applications.
Keywords: RSV infection; antiviral peptides; antigenic site 0; laboratory animals
For correspondence
Igor P. Shilovskiy -Dr.Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Received 13.02.2023. Accepted 17.03.2023.
For citation: Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Kozhikhova K.V., Vishnyakova L.I., Smirnov V.V., Gudima G.O., Brylina V.E., Kaganova M.M., Nikolskii A.A., Timotievich E.D., Kovchina V.I., Rusak T.E., Shatilova A.V., Shatilov A.A., Andreev S.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. A synthetic peptide mimicking the antigenic site of F protein suppresses of respiratory syncytial virus infection in vitro. Immunologiya. 2023; 44 (2): 134-46. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-134-146 (in Russian)
Funding. The study was supported by Russian Science Foundation grant No. 22-25-00182, https://rscf.ru/proj-ect/22-25-00182/.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Study conception and design - Shilovskiy I.P., Khaitov M.R.; material collection and processing -Timotievich E.D., Nikolskii A.A., Kozhikhova K.V., Kovchina V.I., Vishnyakova L.I., Yumashev K.V., Kaganova M.M., Rusak T.E., Shatilov A.A., Shatilova A.V.; statistical processing - Andreev S.M., Shilovskiy I.P.; article preparation -Shilovskiy I.P., Yumashev K.V.; editing - Gudima G.O., Kudlay D.A., Smirnov V.V., Andreev S.M., Brylina V.E.
Введение
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) относится к порядку Mononegavirales, семейству Pneumo-viridae, роду Orthopneumovirus. РСВ - один из самых распространенных патогенов, вызывающих тяжелые заболевания верхних и нижних дыхательных путей у детей, пожилых людей и пациентов с иммунодефицитами [1]. Пациенты с бронхиальной астмой и хронической об-структивной болезнью легких также в значительной степени страдают от этой инфекции [2]. Ежегодно в мире госпитализируют до 3 млн детей, инфицированных РСВ, при этом смертность от этой инфекции составляет 66-199 тыс. в год [3]. Экономический ущерб от РСВ-инфекции (по данным в США) оценивается в 1,15 млрд долларов ежегодно [4].
К настоящему времени не создано эффективной вакцины против РСВ [5], а для иммунопрофилактики применяют препараты на основе моноклональных антител (МкАт), широкое использование которых ограничено высокой стоимостью [6]. В отдельных случаях для
Э
Антигенный 0-сайт
1 Dl 1 D3 ■FP HR-l Dl 1 D2 1 HR-2 1 TM
149-206 474-523
F2 Fl
э
D-12 R4K2K
KK-44 KQLLPIVNKQSC
КК-45 R4K2KQLLPIVNKQSC
Рис. 1. Структура белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и последовательности пептидов А. Структура белка F РСВ. Белок F разделен на две субъединицы - F1 и F2. В его структуре выделяют следующие участки: FP - пептид слияния для взаимодействия с клеткой; TM- трансмембранный домен для закрепления белка F в оболочке РСВ; HR-1 и HR-2 - а-спиральные участки. Домены D1, D2 и D3 образуют основной глобулярный домен. Антигенный сайт 0 имеет важное значение для процесса слияния вируса с клеткой, его локализация отмечена на схеме. Б. Последовательности изучаемых пептидов. Синим цветом выделена разветвленная (дендримерная) часть пептида, красным цветом выделена линейная часть пептида, имитирующая антигенный 0-сайт.
фармакотерапии РСВ-инфекции применяется виразол (рибавирин) [7], однако он вызывает многочисленные неблагоприятные побочные эффекты [8]. Ведутся работы над созданием новых терапевтических средств, например ингибиторов на основе малых интерферирующих РНК [9], наночастиц [10] и различных малых молекул [11].
Один из перспективных подходов к созданию антивирусных средств - использование природных и синтетических пептидов [12]. В настоящее время около 15 пептид-содержащих антимикробных препаратов проходят клинические исследования [13]. Природные пептиды млекопитающих (дефензины, кателицидины и пр.) с антибактериальными, противовирусными и другими защитными функциями являются неотъемлемой частью врожденного иммунитета. Основными механизмами противовирусного действия природных пептидов считаются конкурентное ингибирование прикрепления и/или слияния вириона с клеткой-мишенью и прямой вирулицидный эффект -разрушение оболочки вириона [12].
Внедрение природных пептидов в медицинскую практику сопряжено с рядом сложностей: процесс выделения пептидов из природных источников затратен, химический синтез крупных (40-50 а.о.) природных пептидов обходится ненамного дешевле, невысокая стабильность - линейные пептиды легко разрушаются протеазами [12]. Несмотря на вышеуказанные сложности, существуют способы их преодоления. В частности, осуществляют синтез укороченных аналогов природных пептидов или проектируют короткие пептиды de novo, что позволяет снизить издержки на их получение. Для стабилизации структуры в пептиды вводят точечные аминокислотные замены или дополнительные химические связи. Также для повышения стабильности осуществляют дендримеризацию пептидов, т. е. синтезируют разветвленные структуры, которые за счет наличия неприродных е-связей в меньшей степени подвергаются деградации ферментами [14].
Детальное раскрытие структуры вириона и молекулярных механизмов РСВ-инфекции значительно ускорило разработку противовирусных пептидов. В частности, была установлена центральная роль поверхностных гликопротеинов вируса F и G в процессах его прикрепления и слияния с клеткой-мишенью. Также выявлены основные клеточные рецепторы, необходимые для инфекционного процесса [15]. Благодаря этим данным соз-
0,0'
1027,714
D-12
üJuJljljILJi
£ 2000'
1500
1000
500
0H
750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z
750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z
4
s 5000
4000
3000
2000
1000
750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z Рис. 2. Результаты масс-спектрометрического анализа синтезированных пептидов
0
дано более 10 пептидов с анти-РСВ-активностью [12]. Углубленные исследования жизненного цикла вируса показали, что наибольшее значение для развития инфекции имеет белок слияния F, тогда как инактивация белка G не замедляла инфекционный процесс [15].
Молекулярное картирование белка F позволило идентифицировать внутри него функциональные домены. В частности, для процесса слияния важны а-спиральные участки HR-1 и HR-2 (рис. 1А) [12, 15]. В ходе иммунологического картирования этого белка удалось установить несколько антигенных сайтов (эпитопов) [16]. При этом антитела, направленные к нулевому антигенному сайту 0, который располагается в HR-1-домене, обладали самой высокой вирус-нейтрализующей активностью [17].
Цели исследования - проектирование пептида, имитирующего антигенный сайт 0 белка F и его разветвленного аналога (рис. 1Б), а также изучение противовирусных свойств этих пептидов в отношении РСВ.
Материал и методы
Питательные среды, культуры клеток, штамм вируса. В работе использовали полную питательную
среду Игла-МЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 25 мМ HEPES («ПанЭко», Россия), 300 мг/л L-глутамина («ПанЭко», Россия), 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Филиппины); неполную питательную среду Игла-МЕМ с добавлением 25 мМ HEPES, 600 мг/л L-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США); полную питательную среду ДМЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 300 мг/л L-глутамин, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и бессывороточную среду ДМЕМ («Пан-Эко», Россия) с добавлением 600 мг/л L-глутамина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина. В работе использовали культуру клеток МА-104 (эмбриональная почка макаков резус), которую приобретали в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, а также вирус РСВ штамм А2, предоставленный ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Минобрнауки России.
Получение пептида. Пептидный синтез осуществлялся на синтезаторе PS3 (Protein Technologies Inc., США) с использованием Fmoc-защищенных амино-
кислот (Iris Biotech, ФРГ) и смолы H-Rink-Amide-Chemmatrix (Iris Biotech, ФРГ). Растворитель на всех стадиях - ^^диметилформамид (Scharlau, ФРГ), активация аминокислот - ГБТУ (Acros Organics, США) и N-метилморфолин (Fischer Scientific, ФРГ), отщепление Fmoc-защиты - 4-метилпиперидин (Sigma Aldrich, ФРГ). Отщепление пептидов от смолы осуществлялось в смеси концентрированной трифторуксусной кислоты (ТФУ) (PanReac AppliChem, США), 1,2-этандитиола, тиоанизола (PanReac AppliChem, США) и воды. Пептиды выделялись из реакционной смеси седиментацией. Для очистки пептидов применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием системы LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония). Стационарная фаза - Kromasil Eternity C18 (Nouryon, Швеция). Элюция - медленный градиент от 5 до 70 % ацетонитрила (Fischer Scientific, США) в 0,1 % водном растворе ТФУ. Детекция фотометрическая, на длинах 226 и 280 нм. Идентификация пептидов производилась методом масс-спектрометрии с использованием спектрометра Bruker Microflex LT (Bruker, ФРГ) (рис. 2). Матрица - а-циано-4-гидроксикоричная кислота (Sigma Aldrich, ФРГ).
Цитотоксическая активность пептидов. Цито-токсичность пептидов изучали с помощью МТТ-теста на культуре клеток МА-104 в широком диапазоне концентраций от 0,04 до 2,5 мг/мл. Данная культура была выбрана в связи с тем, что последующие исследования антивирусной активности проводились на этой же культуре клеток. Для этого в 96-лучночный планшет засевали 20 000 клеток/лунку в объеме 100 мкл полной среды Игла-МЕМ. На следующий день в культуру клеток вносили пептиды в различных концентрациях. Через сутки в культуру клеток вносили 25 мкл раствора МТТ (AppliChem, США) (4 мг/мл) и инкубировали 4 ч. После чего клетки лизировали раствором 20 % SDS (Thermo FS, США) на 0,02 н водном растворе H2SO4 (AppliChem, США). Далее измеряли оптическую плотность при длинах волн 570 и 650 нм и на основе этих данных рассчитывали значения CC50 (50 % цитотокси-ческая концентрация - концентрация тестируемого вещества, необходимая для гибели 50 % клеток).
Вирулицидная активность пептидов. Была изучена вирулицидная активность пептидов по методике, описанной в статье [18], с некоторыми модификациями. Кратко, пептиды в диапазоне нетоксических концентраций 250 мкг/мл были инкубированы с вирусом [титр = 200 000 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл] 2 ч при комнатной температуре, после чего вирус титровали на заранее подготовленном монослое клеток МА-104, а через 5 сут подсчитывали количество синцитиев (бляшек) с помощью световой микроскопии. В качестве отрицательного контроля вирус обрабатывали физиологическим раствором (ФР), а в качестве положительного контроля - нейтрализующими моноклональными антителами (МкАт) (Invitrogen, США) в концентрации 10 мкг/мл.
Взаимодействие пептидов с РСВ. Пептиды были изучены в тесте ингибирования лигандов на поверхности вирионов РСВ. Для этого клетки МА-104 засевали в 96-луночный планшет в количестве 15 тыс/лунку в полной среде ДМЕМ, инкубировали ночь до образования монослоя и отмывали от сывороточной среды физиологическим раствором. В каждую лунку вносили по 100 мкл холодной бессывороточной среды ДМЕМ и охлаждали планшет до 4 °С. Далее в отдельных пробирках пептиды титровали до получения следующих концентраций 500, 250, 125, 62,5, 31,25 мкг/мл, охлаждали на льду и вносили охлажденный до 4 °С вирус в количестве 50 БОЕ/образец в объеме 100 мкл бессывороточной среды ДМЕМ. Инкубировали смесь пеп-тид/РСВ при 4 °С в течение 1 ч, после чего вносили ее в культуру клеток МА-104 в лунки предварительно отмытого и охлажденного до 4 °С планшета. Инкубировали смесь пептид/РСВ с клетками 2 ч при 4 °С. Охлаждение клеток, вируса и пептидов до 4 °С необходимо, чтобы избежать преждевременной инициации инфекционного процесса, так как при 4 °С РСВ способен прикрепляться к клеткам-мишеням, но энергозависимый процесс слияния не запускается [18]. После инкубации удаляли содержимое из лунок вместе с несвязавшимся вирусом, меняли среду на бессывороточную ДМЕМ и инкубировали при 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 3-5 сут до образования синцитиев. Далее количество синцитиев в лунке подсчитывали с помощью световой микроскопии (учитывая число бляшек).
При таком дизайне эксперимента пептиды, обладающие способностью взаимодействовать с вирионами, будут связываться с лигандами (скорее всего с белками F и G вируса) на их поверхности и при внесении в культуру клеток будут препятствовать процессу прикрепления/слияния.
Определение связывания пептидов с РСВ методом ИФА. Способность пептидов взаимодействовать с РСВ оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА) по методике, сходной с опубликованной в работе [18]. Для этого пептиды в концентрациях 0,25, 2,5, 25 и 250 мкг/мл сорбировали на планшете при 37 °С в течение 2 ч, после чего двукратно отмывали (0,25 % Tween-20/PBS) и осуществляли блокировку 2 % обезжиренным сухим молоком (Sigma Aldrich, США) при 4 °С в течение ночи. В качестве отрицательного контроля осуществляли сорбцию 1 % BSA («ПанЭко», Россия) и гепарина (Велфарм, Россия) в аналогичном диапазоне концентраций (от 0,25 до 250 мкг/мл). Далее после трехкратной отмывки вносили РСВ в бессывороточной среде ДМЕМ (Т = 10 000 БОЕ/мл) и инкубировали 2 ч при 37 °С. После двукратной отмывки вносили антитела против F-белка вируса [RSV Fusion Protein Monoclonal Antibody (C106D) (ThermoFisher, США)] в разведении 1/200 и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После двукратной отмывки вносили вторичные биотинилированные антитела [rat anti-mouse IgG1-biotin (BD, США)]. Отмывали 2 раза и вносили конъюгат SaV-HRP (BD, США) в разведении 1/1000 с последующей инкубацией 1 ч при комнатной темпе-
ратуре. После трехкратной отмывки вносили ТМБ (BD, США) и инкубировали 10-20 мин. Реакцию останавливали 2н H2SO4. Оптическую плотность (ОП) измеряли на планшетном фотометре Multiskan GO (ThermoFisher, США) при двух длинах волн - 450 и 620 нм. С помощью программного обеспечения прибора рассчитывалась разница между ОП450 и ОП620 (ДОП).
Ингибирование связывания РСВ с рецепторами клеток. Для оценки способности пептидов ингибиро-вать вход вируса в клетки-мишени клетки линии МА-104 засевали в 96-луночный планшет в полной питательной среде ДМЕМ и культивировали в 5 % CO2 при 37 °C так, чтобы через сутки конфлюентность монослоя составила 100 %. Отмывали клетки от полной среды ДМЕМ физиологическим раствором, который был охлажден до 4 °С. Далее манипуляции проводили на льду при 4 °С, так как при этой температуре РСВ способен прикрепляться к клеткам-мишеням, но не способен осуществлять слияние с ними. После отмывки в лунки планшета вносили по 50 мкл холодной бессывороточной среды ДМЕМ и тестируемые пептиды, которые титровали в диапазоне нетоксичных концентраций, и инкубировали 30 мин на льду. В качестве положительного контроля применяли гепарин, который связывается с РСВ и конкурентно препятствует связыванию вируса с клеточными рецепторами - гепаран-сульфатами [18]. Далее в лунки вносили РСВ A2 в количестве 50 БОЕ на лунку в объеме 50 мкл/лунку бессывороточной ДМЕМ, инкубировали вирус 2 ч на льду. Затем отмывали несвя-завшийся вирус и пептиды, вносили в лунки 100 мкл бессывороточной ДМЕМ и инкубировали при 37 °С в СО2-инкубаторе 3-5 сут. Подсчитывали количество синцитиев с помощью световой микроскопии [18]. На основе данных о влиянии различных концентраций пептидов на количество синцитиев были рассчитаны значения EC50 т. е. концентрации пептидов, необходимых для ингибирования прикрепления вируса к клетке на 50 %.
Определение степени связывания пептидов с нуклеолином. В отдельных экспериментах была изучена способность пептидов связываться с клеточным рецептором для РСВ - белком нуклеолином. Для этого пептиды в концентрациях 2,5, 25 и 250 мкг/мл сорбировали на планшете при 37 °С в течение 2 ч, после чего двукратно отмывали (0,25 % Tween-20/PBS) и осуществляли блокрование 2 % обезжиренным сухим молоком (Sigma Aldrich, США) при 4 °С в течение ночи. В качестве отрицательного контроля осуществляли сорбцию 1 % BSA (ПанЭко, Россия) и гепарина в аналогичном диапазоне концентраций (от 2,5 до 250 мкг/мл). Далее после трехкратной отмывки вносили 100 мкл 1 мкг/мл раствора нуклеолина [(Human NCL/Nucleolin Protein (Recombinant 6His, N-terminus aa2-482) (LSBio, США)] и инкубировали 2 ч при 4 °С. После двукратной отмывки вносили кроличьи поликлональные антитела против нук-леолина [Nucleolin Polyclonal Antibody (ThermoFisher, США)] в разведении 1/500 и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После двукратной отмывки вносили детектирующие антикроличьи IgG-антитела,
меченные HRP [Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (ThermoFisher, США)]. Отмывали 3 раза и вносили ТМБ (BD, США), инкубировали 15-30 мин. Реакцию останавливали 2Н H2SO4. Оптическую плотность (ОП) измеряли как описано выше.
Результаты
Получение пептида, имитирующего фрагмент антигенного сайта 0 (HR-1-домена) белка F
Спроектирован и синтезирован линейный пептид КК-44, последовательность которого соответствует последовательности нулевого антигенного сайта 0 (AA201-212) белка слияния F. Данный сайт необходим для связывания вируса с клеткой-мишенью. Также был создан пептид КК-45, состоящий из линейной части (AA201-212), к С-концу которой был добавлен дендри-мерный фрагмент (R4K2K). Кроме того, в качестве контроля был синтезирован малый дендримерный пептид D-12 (R4K2K) (см. рис. 1Б).
Цитотоксичность пептидов
Цитотоксичность пептидов изучали с помощью МТТ-теста на культуре клеток МА-104 в широком диапазоне концентраций от 0,04 до 2,5 мг/мл. В результате тестирования данных пептидов установлено, что линейный пептид KK-44 и контрольный дендримерный пептид D12 являются нетоксичными в данном диапазоне концентраций, т. е. значение СС50 > 2,5 мг/мл. В то же время пептид KK-45 проявлял более выраженный ци-тотоксический эффект - значение СС50 составило 0,50 ± 0,09 мг/мл (рис. 3А). По всей видимости, за счет высокой плотности положительного заряда и относительно крупного размера данный пептид оказывает более выраженное повреждающее действие на мембрану клетки, приводя к потере ее жизнеспособности.
Вирулицидная активность пептидов
Для изучения вирулицидной активности исследуемые пептиды в нетоксической концентрации 250 мкг/мл инкубировали с вирусом в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего вирус титровали на заранее подготовленном монослое клеток МА-104. Наибольшим эффектом обладали нейтрализующие МкАт, которые уменьшали количество синцитиев в 37 раз в сравнении с отрицательным контролем (ФР). Среди изученных пептидов КК-44 и КК-45 оказывали выраженное прямое вирулицидное действие на РСВ, приводя к уменьшению количества синцитиев в 21 и 13 раз соответственно. В то же время контрольный дендримерный пептид D-12 не оказывал такого эффекта (рис. 3Б). По всей видимости, крупные дендримерные пептиды с высокой плотностью позитивного заряда (+8 для КК-45) оказывают прямое дестабилизирующее действие на оболочку РСВ, что в итоге приводит к снижению жизнеспособности вируса.
Взаимодействие пептидов с лигандами на поверхности РСВ
Пептиды были изучены в тесте ингибирования лигандов на поверхности вирионов РСВ. Проведен-
0,00 0,04 0,08 0,16 0,31 0,63 1,25 2,50 C, мг/мл ■fj- D-12 -§■ KK-44 КК-45
Э
О w
250 000
200 000 -
150 000
100 000
50 000
D-12 KK-44 КК-45 МкАт
Рис. 3. Цитотоксичность и вирулицидная активность пептидов в экспериментах in vitro
А. Цитотоксичность пептидов изучена на культуре клеток МА-104. Пептиды инкубировали с клетками в течение суток, после чего определяли их жизнеспособность с использованием МТТ-теста. Представлена жизнеспособность клеток в % относительно необработанных пептидами клеток (0 мг/мл). n (число повторов эксперимента) = 3. Б. Вирулицидная активность пептидов изучена на культуре клеток МА-104. Пептиды в концентрации 250 мкг/мл инкубировали с вирусом 2 ч при комнатной температуре, после чего вирус титровали на монослое клеток МА-104, а через 5 сут подсчитывали количество бляшек (синцитиев). В качестве отрицательного контроля вирус обрабатывали физиологическим раствором, а в качестве положительного контроля вирус обрабатывали нейтрализующими моноклональными антителами (МкАт) в концентрации 10 мкг/мл. n (число повторов эксперимента) = 6. Статистический анализ проведен с использованием критерия Краскела-Уоллиса. х - статистически значимо отличается от «KK-44»; * - статистически значимо отличается от «D-12»; # - статистически значимо отличается от «МкАт»; ■ - статистически значимо отличается от «ФР».
ные исследования показали, что инкубация линейного КК-44 с вирусом не приводит к снижению инфекционного процесса: при концентрации 500 мкг/мл количество синцитиев в среднем составило 32 ± 2,7, в то время как в отсутствии пептида значения составили
43 ± 2,5 БОЕ/0,1 мл, т. е. ЕС50 составляет > 500 мкг/мл. В то же время дендримерный пептид КК-45 значительно подавляет образование синцитиев (ЕС50 = 33 ± 3 мкг/мл): в отсутствие пептида их количество составляло 40 ± 2,3 Б0Е/0,1 мл, а при его концентрации 500 мкг/мл почти в 20 раз меньше - 2,2 ± 0,5 Б0Е/0,1 мл. Стоит отметить, что контрольный дендримерный пептид Б-12 также обладал анти-РСВ-эффектом в данном тесте, но значительно более слабым (ЕС50 = 197 ± 48 мкг/мл). Количество синцитиев составило 39 ± 2,3 Б0Е/0,1 мл при отсутствии пептида и 13,2 ± 2,6 Б0Е/0,1 мл при концентрации пептида 500 мкг/мл (рис. 4А).
В дополнительных экспериментах с помощью ИФА мы исследовали способность пептидов взаимодействовать с РСВ. Обнаружено, что линейный пептид КК-44 связывался с РСВ - ОП в ИФА составляла 0,97 ± 0,10 (рис. 4Б). Дендримерный пептид КК-45 и контрольный дендримерный пептид Б-12 также связывались РСВ, но с меньшей интенсивностью: ОП в ИФА составили 0,67 ± 0,14 и 0,73 ± 0,13 (рис. 4Б).
Ингибирование связывания РСВ с рецепторами клеток
Оценивали способность пептидов ингибировать вход вируса в клетки-мишени. Для этого клетки МА-104 инкубировали с пептидами, после чего их заражали вирусом в присутствии пептидов. Линейный пептид КК-44 и короткий дендримерный пептид Б-12 не инги-бируют прикрепление вируса к клетке - значения ЕС50 составили > 500 мкг/мл. При этом пептид КК-45 продемонстрировал способность ингибировать прикрепление РСВ к клеткам-мишеням. Значение ЕС50 составило 47 ± 8 мкг/мл, что сопоставимо с положительным контролем - гепарином (ЕС50 = 48 ± 11 мкг/мл) (рис. 4В).
В отдельных экспериментах была изучена способность пептидов связываться с клеточным рецептором для РСВ - белком нуклеолином. Обнаружено, что ден-дримерный пептид КК-45 связывается с нуклеолином (ДОП в ИФА = 0,79 ± 0,01), в то время как линейный пептид КК-44, а также контрольный дендримерный пептид Б-12 связываются слабее: значения ОП в ИФА составили 0,22 ± 0,01 и 0,28 ± 0,04 соответственно (рис. 4Г).
Обсуждение
Слияние вириона с неинфицированными клетками является важным этапом жизненного цикла вируса. У РСВ главную роль в этом процессе играет поверхностный гликопротеин Б (белок слияния). Данный гликопротеин синтезируется инфицированной клеткой в виде белка-предшественника (Б0), который про-теолитически расщепляется на субъединицы Б1 и Б2, ковалентно связанные в гетеродимер. На поверхности вириона функциональный белок Б существует в виде тримера Б1/Б2-гетеродимеров в префузионной конфор-мации. На Оконце субъединицы Б1 располагается пептид слияния (БР) с прилегающим к нему а-спиральным участком ИЯ-1. На С-конце Б1 располагается трансмем-
0
э
50
40
S 30
M
Sä 20
э
31
63 125
C, мкг/мл
250
500
ф D-12 ф KK-44 ф КК-45 ф МкАт
40
30
/0, 20
X О ш
10
16
32 63 125 250 500 C, мкг/мл
ф D-12 ф KK-44 ф КК-45 ф Гепарин
0,25 2,50 25,00 250,00
C, мкг/мл
ф D-12 ф KK-44 ф КК-45 ф Гепарин ф РСВ
2,50 25,00
C, мкг/мл
250,00
ф D-12 ф KK-44 ф КК-45 ф Гепарин ф Нуклеолин
Рис. 4. Антивирусная активность пептидов
А. Блокирование лигандов на поверхности РСВ. Вирус инкубировали с пептидами при температуре 4 °С, после чего осуществляли инфекцию клеток МА-104 в течение 4 ч с последующей отмывкой от несвязавшегося вируса. Представлены средние значения ± стандартная ошибка. п (число повторов эксперимента) = 7. Б. Связывание пептидов с РСВ. Интенсивность связывания пептидов с вирусом оценивали с помощью ИФА. Для этого осуществляли сорбцию пептидов на планшете, после чего вносили вирус с его последующей количественной детекцией с помощью МкАт. Данные представлены в виде среднего значения оптической плотности ± стандартная ошибка. п (число повторов эксперимента) = 4. В. Конкурентное ингибирование прикрепления РСВ к клеткам-мишеням. Клетки инкубировали с пептидами при +4 °С, после чего в присутствии пептидов осуществляли инфекцию вирусом в течение 4 ч при +4 °С. Представлены средние значения ± стандартная ошибка. п (число повторов эксперимента) = 7. Г. Связывание пептидов с нуклеолином. Пептиды сорбировали на планшете и инкубировали с нуклеолином, его количественную детекцию осуществляли поликлональными антителами. Данные представлены в виде среднего значения оптической плотности ± стандартная ошибка. п (= число повторов эксперимента) 4. Статистический анализ проведен с использованием критерия Краскела-Уоллиса. х - статистически значимо отличается от «КК-44»; * - статистически значимо отличается от «Б-12»; # - статистически значимо отличается от «МкАт» (для А) и от «гепарин» (для Б, В, Г).
0
0
0
бранный домен (ТМ) с а-спиральным участком ИЯ-2, который обеспечивает заякоривание белка в оболочке вируса (см. рис. 1А).В процессе слияния пептид ЕР взаимодействует с мембраной клетки-мишени, после чего белок Е меняет свою конформацию с префузионной на постфузионную. В ходе этой реорганизации участки ИЯ-1 и ИЯ-2 белка Е сближаются, формируя шпилечную структуру, что приводит к сближению мембран клетки и вириона и, в итоге, к их слиянию [12, 15].
Многие оболочечные вирусы проникают в клетку за счет белков слияния. Одним из первых был изучен белок слияния ^41 ВИЧ-1. Была продемонстрирована значимая роль спиральных участков этого белка для процесса слияния. В частности, были созданы синтетические пептиды (БР-107 и БР-178), имитирующие эти регионы, которые существенно ингибировали процесс слияния и последующей инфекции [19]. Несколько позднее было показано, что белок слияния Е вируса РСВ
имеет доменную организацию, сходную с gp41 ВИЧ-1. В белке F выделяют так называемые HR-домены (HR-1 и HR-2), которые имеют а-спиральную структуру и критически важны для процесса слияния. На основе структурного сходства белков слияния gp41 ВИЧ-1 и F РСВ были созданы пептиды, имитирующие домены HR-1 и HR-2 белка F РСВ, гомологичные ранее созданным пептидами DP-107 и DP-178 из белка gp41 ВИЧ-1 [20]. Эти пептиды обладали антивирусными свойствами, а предполагаемый механизм заключается в том, что пептиды физически взаимодействуют с HR-доменами и препятствуют перестройке белка F из префузионной конформации в постфузионную [20].
Экспериментально продемонстрировано, что пептиды домена HR-1 обладали слабыми антивирусными свойствами, тогда как пептиды домена HR-2 проявляли значительный антивирусный эффект [20]. Полученные нами результаты в целом согласуются с этими результатами [20]. В частности, созданный нами линейный пептид КК-44, частично имитирующий HR-1-домен, несмотря на свою способность связываться с РСВ (см. рис. 4Б), не проявлял выраженных антивирусных свойств в тесте ингибирования лигандов на поверхности РСВ (см. рис. 4А). Эти данные указывают на большую значимость домена HR-2 по сравнению с HR-1-доменом, что, вероятно, обусловлено его пространственной близостью к трансмембранному домену, участвующему в заякоривании белка F в оболочке вируса.
Работа N.E. Shepherd и соавт. [21] подтвердила значимость домена HR-2 для процесса слияния вируса с клеткой. Авторами был синтезирован линейный пептид из этого домена размером 13 а.о. (483FPSDEFDASISQV495) со стабилизированной а-спиральной структурой. Этот пептид обладал выраженными противовирусными свойствами в отношении РСВ (ЕС50 = 0,036 мкМ) [21].
Домен HR-1 белка F вируса РСВ также имеет большое значение для инфекционного процесса. Недавние исследования [17] показали важность антигенного сайта 0 белка слияния F в инфекции. Этот антигенный сайт располагается на границе HR-1-домена и домена D1 (см. рис. 2 А) и присутствует только в префу-зионной конформации белка F. Антитела, направленные против этого сайта, обладали значительным антивирусным эффектом, который в 50 раз превышал активность препарата Паливизумаб. Такая высокая активность антител связана с их способностью взаимодействовать с префузионной (а не с постфузионной) конформацией белка F и стабилизировать его в этом состоянии, тем самым предотвращая процесс слияния вируса с клеткой. Антигенный сайт 0 располагается на апикальной части белка F, поэтому он хорошо доступен для связывания с антителами, что также объясняет высокую вирус-нейтрализующую активность антител к этому сайту [17].
Учитывая это, мы спроектировали линейный пептид, соответствующий участку нулевого сайта (AA201-212) белка F - КК-44. При синтезе пептида КК-45 к ли-
нейной части мы добавили дендримерный фрагмент (Я4К2К) к С-концу. Таким образом, пептиды КК-44 и КК-45 моделируют антигенный сайт 0 белка Б. В качестве контроля был дополнительно синтезирован короткий дендримерный пептид Б-12 (Я4К2К) (см. рис. 1Б).
Эти пептиды были изучены в тесте ингибирования лигандов на поверхности вирионов РСВ. Проведенные исследования показали, что инкубация вируса с линейным пептидом КК-44 не приводит к снижению инфекционного процесса. В то же время дендримерный пептид КК-45 значительно подавляет образование син-цитиев. Стоит отметить, что контрольный дендример-ный пептид Б-12 также обладал анти-РСВ-эффектом в данном тесте, но значительно более слабым. Мы установили, что линейный пептид КК-44 связывался с РСВ. Дендримерный пептид КК-45 и контрольный дендримерный пептид Б-12 также связывались РСВ, но с меньшей интенсивностью (см. рис. 4Б). Линейный пептид КК-44, несмотря на свою способность связываться с вирусом, не оказывает ингибирующего действия на инфекционный процесс. По всей видимости, данный пептид не приводит к нарушению функционирования белка Б. В то же время пептид КК-45 при контакте с РСВ значительно ингибирует дальнейший инфекционный процесс. Скорее всего, это обусловлено тем, что пептид КК-45 специфически связывается с ви-рионами своей линейной С-концевой последовательностью, имитирующей ИЯ-1-домен белка Б, а разветвленная структура на Оконце стерически препятствует нормальному функционированию белка Б, а именно нарушает его структурную перестройку из префузионной в постфузионную конформацию.
Контрольный пептид Б-12, несмотря на отсутствие фрагмента, имитирующего участок белка Б, также связывался с РСВ (см. рис. 4Б), но оказывал слабый антивирусный эффект (см. рис. 4А). В данном случае может иметь место его неспецифическое связывание за счет электростатического взаимодействия. Б-12 с высокой плотностью положительного заряда может взаимодействовать с отрицательно заряженными участками вириона (например, липидными рафтами в бислойной мембране). Антивирусная активность пептида Б-12 вероятнее всего объясняется его способностью дестабилизировать оболочку вириона, что препятствует инфекции.
Мы также изучили антивирусную активность данных пептидов в тесте конкурентного ингибирования прикрепления РСВ к клеткам-мишеням, в котором клетки обрабатывали пептидами перед инфицированием. Мы показали, что из трех изученных пептидов значительным эффектом обладал лишь КК-45 (см. рис. 4В). Одним из предполагаемых механизмов, лежащих в основе антивирусной активности КК-45, помимо взаимодействия с белком Б, является связывание с многофункциональным белком клеток - нуклеолином. М-концевой участок этого белка сильно фосфорилиро-ван, содержит отрицательно заряженные фрагменты, обогащенные остатками глутамина и аспарагина, способ-
ными взаимодействовать с катионными пептидами [14]. Более того, нуклеолин был идентифицирован как клеточный рецептор РСВ, способный связываться с Е-белком вируса [22, 23]. В отдельных экспериментах была изучена способность синтезированных пептидов связываться с нуклеолином. Проведенные исследования показали, что дендримерный пептид КК-45 связывается с этим белком, в то время как линейный пептид КК-44, а также контрольный дендримерный пептид Б-12 связываются заметно слабее (см. рис. 4Г). Высокая антивирусная активность пептида КК-45, скорее всего, объясняется его способностью конкурентно связываться с рецептором - нуклеолином - за счет наличия в структуре пептида остатков аргинина. Пониженная активность Б-12 по сравнению с КК-45 может объясняться тем, что для взаимодействия с ну-клеолином в составе пептида необходима не только разветвленная структура со значительным положительным зарядом, но и линейный С-концевой фрагмент. Линейный пептид КК-44 не проявлял выраженной анти-РСВ-активности, что также может объясняться значительно более слабой способностью связываться
с этим рецептором (см. рис. 4Г), обусловленной отсутствием у KK-44 катионных участков, сравнимых с таковыми у KK-45.
Заключение
Таким образом, путем химического синтеза были получены три катионных пептида: два разветвленных (D-12 и КК-45) и один линейный (КК-44). Пептиды D-12 и КК-44 не оказывали выраженного эффекта на репликацию РСВ в экспериментах in vitro, тогда как дендримерный пептид KK-45 значительно ингибировал инфекцию. Антивирусная активность пептида КК-45 проявляется за счет следующих возможных механизмов: 1) взаимодействие с белком слияния F в участке, соответствующему антигенного сайта 0, что препятствует переходу этого белка из префузионной в постфузионную конфор-мацию; 2) конкурентное ингибирование рецептора -белка нуклеолина. Пептид КК-45 проявляет антивирусное действие в нетоксичных концентрациях (индекс селективности безопасности СС50/ЕС50 составляет 50), что делает его перспективным для возможного терапевтического применения.
■ Литература
1. Troeger C., Blacker B., Khalil I., Rao P. et al. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect. Dis. 2018; 18 (11): 191-210. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30310-4
2. Edwards R., Walton P., Jackson J., Feleszko W. et al. The potential of anti-infectives and immunomodulators as therapies for asthma and asthma exacerbations. Allergy. 2017; 73: 50- 63. DOI: https://www.doi. org/10.1111/all.13257
3. Shi T., McAllister A., O'Brien L., Simoes F. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 2017; 90 (10098); 946-58. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S0140-6736(17)30938-8
4. Halasa B., Williams V., Wilson J., Walsh F. et al. Medical and economic impact of a respiratory syncytial virus outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatr. Infect. Dis. J. 2005; 24: 1040-4. DOI: https://www. doi.org/10.1097/01.inf.0000190027.59795.ac
5. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogenesis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 2017; 16: 351-60. DOI:10.1080/1 4760584.2017.1260452.
6. Wang D., Cummins C., Bayliss S., Sandercock J., et al. Immuno-prophylaxis against respiratory syncytial virus (RSV) with palivizumab in children: A systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess (Rockv). 2008; 12: 1-86. DOI:10.3310/hta12360.
7. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc N., Pena-Lopez Y. et al. Ribavirin for treatment of subjects with respiratory syncytial virus-related infection: a systematic review and meta-analysis. Adv. Ther. 2022; 39: 4037-51. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s12325-022-02256-5
8. Janai K., Marks I., Zaleska M., Stutman R. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr Infect Dis J. 1990; 9: 209-11.
9. Хаитов М.Р., Литвин Л.С., Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н. и др. Интерференция РНК. Новые подходы к разработке противовирусных препаратов. Иммунология. 2010; 31: 69-76.
10. Osminkina LA., Timoshenko V.Yu., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V. et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. J. Nanopart. Res. 2014; 16 (8): 1-10. DOI: https://www.doi. org/10.1007/s11051-014-2430-2
11. Heylen E., Neyts J., Jochmans D. Drug candidates and model systems in respiratory syncytial virus antiviral drug discovery. Bio-
chem. Pharmacol. 2017; 127: 1-12. DOI: https://www.doi.Org/10.1016/j. bcp.2016.09.014
12. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikolskii A.A. et al. Prospects for the use of peptides against respiratory syncytial virus. Mol. Biol. 2019; 53: 484-500. DOI: https://www.doi.org/10.1134/ S0026893319040125
13. Greber K.E., Dawgul M. Antimicrobial peptides under clinical trials. Curr. Top. Med. Chem. 2017; 17: 620-8. DOI: https://www.doi. org/10.2174/156802661666616
14. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva A.V. et al. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J Mater Chem B. 2020; 8 (13): 2607-17. DOI: https://www.doi.org/10.1039/c9tb02485a
15. Battles M.B., McLellan J.S. Respiratory syncytial virus entry and how to block it. Nat. Rev. Microbiol. 2019; 17 (4): 233-45. DOI: https:// www.doi.org/10.1038/s41579-019-0149-x
16. McLellan J.S. Neutralizing epitopes on the respiratory syncytial virus fusion glycoprotein. Curr. Opin. Virol. 2015; 11: 70-5. DOI: https:// www.doi.org/10.1016/j.coviro.2015.03.002
17. McLellan J.S., Chen M., Leung S., Graepel K.W. et al. Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody. Science. 2013; 340 (6136): 1113-7. DOI: https://www.doi. org/10.1126/science.1234914
18. Donalisio M., Rusnati M., Cagno V., Civra A. et al. Inhibition of human respiratory syncytial virus infectivity by a dendrimeric heparan sulfate-binding peptide. Antimicrob. Agents Chemother. 2012; 56: 527888. DOI: https://www.doi.org/10.1128/AAC.00771-12
19. Wild C., Dubayt J.W., Greenwell T., Baird T. et al. Propensity for a leucine zipper-like domain of human immunodeficiency virus type 1 gp4l to form oligomers correlates with a role in virus-induced fusion rather than assembly of the glycoprotein complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91 (26): 12676-680. DOI: https://www.doi.org/10.1073/pnas. 91.26.12676
20. Lambert D.M., Barney S., Lambert A.L., Guthrie K. et al. Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion. J. Med. Sci. 1996; 93: 2186-91. DOI: https://www. doi.org/10.1073/pnas.93.5.2186
21. Shepherd N.E., Hoang H.N., Desai V.S., Letouze E. et al. Modular a-helical mimetics with antiviral activity against respiratory syncitial virus. J. Am. Chem. Soc. 2006; 128 (40): 13284-9. DOI: https://www.doi. org/10.1021/ja064058a
22. Tayyari F., Marchant D., Moraes T.J., Duan W. et al. Identification of nucleolin as a cellular receptor for human respiratory syncytial virus. Nat. Med. 2011; 17: 1132-5. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nm.2444
■ References
1. Troeger C., Blacker B., Khalil I., Rao P., et al. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018; 18 (11): 191-210. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30310-4
2. Edwards R., Walton P., Jackson J., Feleszko W., et al. The potential of anti-infectives and immunomodulators as therapies for asthma and asthma exacerbations. Allergy. 2017; 73: 50-63. DOI: https://www.doi. org/10.1111/all.13257
3. Shi T., McAllister A., O'Brien L., Simoes F., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 2017; 90 (10098); 946-58. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S0140-6736(17)30938-8
4. Halasa B., Williams V., Wilson J., Walsh F., et al. Medical and economic impact of a respiratory syncytial virus outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatr Infect Dis J. 2005; 24: 1040-4. DOI: https://www. doi.org/10.1097/01.inf.0000190027.59795.ac
5. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogenesis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies. Expert Rev Vaccines. 2017; 16: 351-60. DOI: https://www.doi. org/10.1080/14760584.2017.1260452
6. Wang D., Cummins C., Bayliss S., Sandercock J., et al. Immuno-prophylaxis against respiratory syncytial virus (RSV) with palivizumab in children: A systematic review and economic evaluation. Health Tech-nol Assess (Rockv). 2008; 12: 1-86. DOI: https://www.doi.org/10.3310/ hta12360
7. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc N., Pena-Löpez Y. et al. Ribavirin for treatment of subjects with respiratory syncytial virus-related infection: a systematic review and meta-analysis. Adv Ther. 2022; 39: 4037-51. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s12325-022-02256-5
8. Janai K., Marks I., Zaleska M., Stutman R. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr Infect Dis J. 1990; 9: 209-11.
9. Khaitov M.R., Litvin L.S., Shilovskiy I.P., Bashkatova Yu.N., et al. RNA interference. New approaches to the development of antiviral drugs. Immunologiya. 2010; 31 (2): 69-76. (in Russian)
10. Osminkina L.A., Timoshenko V.Yu., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V. et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. J Nanopart Res. 2014; 16 (8): 1-10. DOI: https://www.doi. org/10.1007/s11051-014-2430-2
11. Heylen E., Neyts J., Jochmans D. Drug candidates and model systems in respiratory syncytial virus antiviral drug discovery. Bio-chem Pharmacol. 2017; 127: 1-12. DOI: https://www.doi.org/10.1016Zj. bcp.2016.09.014
Сведения об авторах
Шиловский Игорь Петрович - д-р биол. наук, зам. директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Юмашев Кирилл Валерьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: yumashev.k.98@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
23. Mastrangelo P., Chin A.A., Tan S., Jeon A.H. et al. Identification of RSV fusion protein interaction domains on the virus receptor, nucleolin. Viruses. 2021; 13 (2): 1-13. DOI: https://www.doi.org/10.3390/v13020261
12. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikolskii A.A. et al. Prospects for the use of peptides against respiratory syncytial virus. Mol Biol. 2019; 53: 484-500. DOI: https://www.doi.org/10.1134/ S0026893319040125
13. Greber K.E., Dawgul M. Antimicrobial peptides clinical trials. Curr Top Med Chem. 2017; 17: 620-8. DOI: https://www.doi. org/10.2174/156802661666616
14. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva A.V., et al. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J Mater Chem B. 2020; 8 (13): 2607-17. DOI: https://www.doi.org/10.1039/c9tb02485a
15. Battles M.B., McLellan J.S. Respiratory syncytial virus entry and how to block it. Nat Rev Microbiol. 2019; 17 (4): 233-45. DOI: https:// www.doi.org/10.1038/s41579-019-0149-x
16. McLellan J.S. Neutralizing epitopes on the respiratory syncytial virus fusion glycoprotein. Curr Opin Virol. 2015; 11: 70-5. DOI: https:// www.doi.org/10.1016/j.coviro.2015.03.002
17. McLellan J.S., Chen M., Leung S., Graepel K.W., et al. Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody. Science. 2013; 340 (6136): 1113-7. DOI: https://www.doi. org/10.1126/science.1234914
18. Donalisio M., Rusnati M., Cagno V., Civra A., et al. Inhibition of human respiratory syncytial virus infectivity by a dendrimeric heparan sul-fate-binding peptide. Antimicrob Agents Chemother. 2012; 56: 5278-88. DOI: https://www.doi.org/10.1128/AAC.00771-12
19. Wild C., Dubayt J.W., Greenwell T., Baird T., et al. Propensity for a leucine zipper-like domain of human immunodeficiency virus type 1 gp4l to form oligomers correlates with a role in virus-induced fusion rather than assembly of the glycoprotein complex. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91 (26): 12676-80. DOI: https://www.doi.org/10.1073/pnas.91.26.12676
20. Lambert D.M., Barney S., Lambert A.L., Guthrie K., et al. Pep-tides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion. J Med Sci. 1996; 93: 2186-91. DOI: https:// www.doi.org/10.1073/pnas.93.5.2186
21. Shepherd N.E., Hoang H.N., Desai VS., Letouze E., et al. Modular a-helical mimetics with antiviral activity against respiratory syncitial virus. J Am Chem Soc. 2006; 128 (40): 13284-9. DOI: https://www.doi. org/10.1021/ja064058a
22. Tayyari F., Marchant D., Moraes T.J., Duan W., et al. Identification of nucleolin as a cellular receptor for human respiratory syncytial virus. Nat Med. 2011; 17: 1132-5. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nm.2444
23. Mastrangelo P., Chin A.A., Tan S., Jeon A.H., et al. Identification of RSV fusion protein interaction domains on the virus receptor, nucleolin. Viruses. 2021; 13 (2): 1-13. DOI: https://www.doi.org/10.3390/v13020261
Authors' information
Igor P. Shilovskiy - Dr.Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Kirill V. Yumashev - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: yumashev.k.98@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Кожихова Ксения Вадимовна - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: k.v.kozhikhova@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5124-6826
Вишнякова Людмила Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: lyudmilochka94@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3555-3268
Смирнов Валерий Валерьевич - д-р фарм. наук, зав. лаб. клинической фармакологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: vall@mail.mipt.ru http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Гудима Георгий Олегович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. физиологии иммунитета и аллергии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: goudima@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2864-6949
Брылина Вера Евгеньевна - канд. вет. наук, доцент каф. иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина Минсельхоза России, Москва, Российская Федерация E-mail: integrin07@rambler.ru https://orcid.org/0000-0001-9917-2088
Каганова Мария Михайловна - студент ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина Минсельхоза России; лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mariya.kaganova.99@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2596-5779
Никольский Александр Аркадьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Тимотиевич Екатерина Драгановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: ed.barvinskaya@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Ksenia V. Kozhikhova - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: k.v.kozhikhova@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5124-6826
Lyudmila I. Vishniakova - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: lyudmilochka94@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3555-3268
Valery V. Smirnov - Dr.Sci., PhD, Head of Clinical Pharmacology Lab. of the NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair n.a. A.P. Arzamastsev, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: vall@mail.mipt.ru http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Georgii O. Gudima - Dr.Sci., PhD, Prof., Head of Physiology of Immunity and Allergy Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: goudima@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2864-6949
Vera E. Brylina - PhD, Associate Prof. of the Immunology and Biotechnology Chair, MVA n.a. K.I. Skryabin MOA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: integrin07@rambler.ru https://orcid.org/0000-0001-9917-2088
Mariya M. Kaganova - Student, MVA n.a. K.I. Skryabin MOA of Russia; Lab. Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mariya.kaganova.99@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2596-5779
Aleksandr A. Nikolskii - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Ekaterina D. Barvinskaia - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ed.barvinskaya@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Ковчина Валерия Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: kvi-91@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3134-5776
Русак Татьяна Евгеньевна - студент ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: tatarusak@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2671-4063
Шатилова Анастасия Витальевна - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: av.timofeeva@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-3780-2878Х
Шатилов Артем Андреевич - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.shatilov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4675-8074Х
Андреев Сергей Михайлович - канд. хим. наук, зав. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
Кудлай Дмитрий Анатольевич - член-корр. РАН, д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармакологии Института фармации ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: kudlay@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; зав. каф. иммунологии МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
Valeriia I. Kovchina - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: kvi-91@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3134-5776
Tatyana E. Rusak - Student, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University); Lab. Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA, of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: tatarusak@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2671-4063
Anastasia V. Shatilova - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: av.timofeeva@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-3780-2878Х
Artem A. Shatilov - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.shatilov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4675-8074Х
Sergey M. Andreev - PhD, Head of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
Dmitry A. Kudlay - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Leader Researcher of the Personalized Medicine and Molecular Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmacology Chair, Institute of Pharmacy, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: kudlay@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Prof., Director, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Head of the Immunology Chair, MBF of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
