CC BY
37
© Коллектив авторов, 2022
Кожихова К.В.1, Андреев С.М.1, Успенская Д.В.1' 2, Шатилова А.В.1, Турецкий Е.А.1' 2, Шатилов А.А.1, Лушникова А.А.3, Вишнякова Л.И.1, Шиловский И.П.1, Смирнов В.В.1 2, Кудлай Д.А.1 2, Хаитов М.Р.1 4
Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 115478, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Использование нуклеиновых кислот (НК) для модуляции экспрессии генов или введения нового гена - кардинальное направление в современной биомедицинской науке. Однако такие манипуляции требуют использования эффективных средств доставки, которые могли бы обеспечить трансмембранный перенос, стабильность нук-леотидной цепи и средства доставки. Перспективными соединениями-носителями для доставки НК в клетки являются суперкатионные дендримерные пептиды (КДП), обладающие разветвленной структурой, обусловленной наличием е-амидных связей, и относительно стабильные в условиях биологической среды.
Цель работы - конструирование и синтез нетоксичных КДП, способных эффективно проникать в клетки млекопитающих и стимулировать внутриклеточное введение модельных ДНК-плазмид. Анализ связи между структурой и стимулирующей активностью КДП. Оценка участия шаперонных молекул нуклеолина и нуклофозмина в трансмембранном переносе КДП.
Материал и методы. Пептиды синтезировали твердофазным методом, очищали методом высокоэффективой жидкостной хроматографии и анализировали масс-спектрометрией. Для оценки цитотоксичности был проведен МТТ-тест на клетках линии ИеЬа и ФЭЧ. Изучали взаимосвязь между структурой КДП и их трансфекционной активностью, которая была охарактеризована в культурах клеток ИеЬа и А549 по экспрессии репортерных генов люциферазы и зеленого флуоресцирующего протеина. Изучение транспортной активности и анализ внутриклеточной локализации проводили методом конфокальной флуоресцентной микроскопии с применением специфичных флуоресцентно меченных антител и флуоресцентно меченного КДП.
Результаты. Синтезированные молекулы КДП имели 3 функциональных участка (модуля): М-концевой катионный фрагмент, представленный остатками аргинина, центральный фрагмент, представленный гидрофобным ядром из остатков лизина с короткими гидрофобными вставками, и С-концевой гидрофобный фрагмент. Последний участок содержит остаток цистеина, удобный для присоединения репортерной группы. Исследование позволило установить взаимосвязь между трансфекционной активностью пептидов и их структурой, зарядом и гидрофобностью С-концевого фрагмента. Показано, что шаперонные молекулы нуклеолин и нуклеофозмин участвуют в процессе трансмембранного переноса КДП в ядро клетки.
Заключение. Получены новые дендримерные пептиды, перспективные для доставки молекул НК в клетки млекопитающих. Установлена роль шаперонных белков нуклеолина и нуклеофозмина во внутриядерной транслокации КДП. Ввиду того что в клетках боль-
Для корреспонденции
Андреев Сергей Михайлович -кандидат химических наук, заведующий лабораторией пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
шинства злокачественных новообразований повышен уровень экспрессии шаперонных белков нуклеофозмина, нуклеолина, NPM, NCL, предполагается, что такие пептидные конструкции можно рассматривать и как потенциальные противоопухолевые агенты.
Ключевые слова: дендримеры; катионные пептиды; твердофазный синтез; невирусные векторы; генная терапия; нуклеиновые кислоты; РНК-интерференция; трансфекция; нуклеолин
Статья получена 27.04.2022. Принята в печать 30.05.2022.
Для цитирования: Кожихова К.В., Андреев С.М., Успенская Д.В., Шатилова А.В., Турецкий Е.А., Шатилов А. А., Лушникова А. А., Вишнякова Л.И., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Кудлай Д. А., Хаитов М.Р. Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Иммунология. 2022; 43 (3): 320-332. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-320-332
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках конкурса 2020 г. «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными, научный проект № 20-73-00368.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Разработка концепции и дизайна исследования - Кожихова К.В., Андреев С.М.; проведение экспериментов по токсичности и трансфекции - Успенская Д.В., Турецкий Е.А., Вишнякова Л.И.; синтез пептидов и их очистка - Шатилова А.В., Шатилов А. А.; расчеты гидрофобности, статистическая обработка - Шиловский И.П., Смирнов В.В.; дизайн экспериментов с мечеными пептидами - Лушникова А.А.; обсуждение концепции, правка и утверждение окончательного варианта статьи - Хаитов М.Р.
Благодарности. Авторы благодарят студентов-дипломников, принимавших участие в этой работе: Кума-шеву Р.А. [ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)] -участие в проведении трансфекции, Бабихину М.О. и Хохлову А.М. (ФГБОУ ВО РТУ МИРЭА Минобрнауки России) - участие в синтезе пептидов.
Kozhikhova K.V.1, Andreev S.M.1, Uspenskaya D.V.1' 2, Shatilova A.V.1, Turetskiy E.A.1' 2, Shatilov A.A.1, Lushnikova A.A.3, Vishniakova L.I.1, Shilovskiy I.P.1, Smirnov V.V.1' 2, Kudlay D.A.1 2, Khaitov M.R.1 4
Supercationic peptide dendrimers as vectors for nucleic acids delivery to mammalian cells
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 11552, Moscow, Russian Federation
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
3 N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology оf the Ministry of Health of the Russian Federation, 115478, Moscow, Russian Federation
4 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University оf the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The usage of nucleic acids (NA) for modulation of gene expression or introduction new genes is a cardinal trend in modern biomedical science. However, such manipulations require the use of efficient delivery vehicles that could provide transmembrane transfer, nucleotide chain stability, and delivery vehicles themselves. Promising delivery vehicles for NA described in this work are supercationic dendrimeric peptides ^DPs), which have a branched structure due to the presence of e-amide bonds and are relatively stable under biological conditions.
The aim of the study - design and synthesis of non-toxic CDPs which, as we expect, will be capable to penetrate efficiently into mammalian cells and stimulate transfection of eukaryotic cultures with model DNA plasmids. Other aim was to access the relationship between the structure and activity of the CDP and also an assessment of nucleolin and nucleophosmin chaperone molecule's role in the transmembrane transfer of the CDPs.
Material and methods. All peptides for this study were synthesized using solid-phase synthesis method with Fmoc-protection of a-groups, purified by solid-phase HPLC and analyzed by mass spectrometry. Their cytotoxicity was assessed by the MTT assay using cell cultures HeLa and FEH. We studied the relationship between the structure of CDPs and their trans-
For correspondence
Sergey M. Andreev -PhD, Head of Peptide Immunogens Laboratory, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
fection activity, which was characterized in cell cultures Hela and A549 by the expression of reporter genes for luciferase and green fluorescent protein. Transport activity and analysis of intracellular localization of the CDPs were studied by confocal fluorescence microscopy using specific fluorescently labeled antibodies and fluorescently labeled CDP.
Results. The synthesized CDPs had 3 functional regions (modules): the N-terminal super-cationic module, represented by arginine residues, the central module, represented by a hydrophobic core of lysine residues with short hydrophobic inserts and the C-terminal hydrophobic module including cysteine residue intended for attaching a reporter group. The study made it possible to access the relationship between the transfection activity of the peptide with its charge and the hydrophobicity of the C-terminal fragment. It has been shown that chaperone molecules, nucleolin and nucleophosmin, are involved in process of transmembrane transfer of CDP into the cell nucleus.
Conclusion. New dendrimeric peptides promising for effective delivery of NA molecules into mammalian cells have been obtained. The role of the chaperone proteins nucleolin and nucleophosmin in the transmembrane transport of the CDPs has been established. In the cells of most malignant tumors, the level of expression of these chaperone proteins is increased; therefore, these peptides can also be considered as potential antitumor agents.
Keywords: dendrimers; cationic peptides; solid-phase synthesis; non-viral vectors; gene therapy; nucleic acids; RNA interference; transfection; nucleolin
Received 27.04.2022. Accepted 30.05.2022.
For citation: Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Uspenskaya D.V., Shatilova A.V., Turetsky E.A., Shatilov A.A., Lushnikova A.A., Vishnyakova L.I., Shilovskiy I.P., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Supercationic peptide dendrimers as vectors for nucleic acids delivery to mammalian cells. Immunologiya; 2022; 43 (3): 320-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-320-332 (in Russian)
Funding. The study was supported by RSF within the competition for Grants 2020 «Initiative research conducting by young scientists» of Presidential research funding program, being implemented by lead scientists, including young scientists, at project number 20-73-00368.
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
Author's contribution. Concept development and design of the study - Kozhikhova K.V., Andreev S.M.; conducting experiments on toxicity and transfection - Uspenskaya D.V., Turetsky E.A., Vishnyakova L.I.; peptide synthesis and purification - Shatilova A.V., Shatilov A.A.; statistical processing and calculations - Shilovskiy I.P., Smirnov V.V.; design of experiments with labeled peptides - Lushnikova A.A.; discussion of the concept, editing and approval of the final version of the article - Khaitov M.R.
Acknowledgments. The authors thank the graduate students who took part in this work: Kumasheva R.A. [I.M. Sechenov First MSMU (Sechenov University), MOH of Russia] - participated in implementation of transfection, Babikhina M.O. and Khokhlova A.M. (RTU MIREA of the MSHE of Russia) - participated in peptide synthesis.
Введение
Трансфекция клеток нуклеиновыми кислотами (НК) является эффективным способом введения нового гена, а также целенаправленного подавления экспрессии собственного или чужеродного гена. Способ регуляции генной экспрессии в формате РНК-интерференции [1] реализуется путем внутриклеточного введения малой интерферирующей РНК (миРНК) и охватывает широкий спектр применения - от фундаментальных исследований до разработок генно-терапевтических решений в области иммунологии и онкологии. Для проявления специфической активности НК/миРНК должны проникнуть в цитоплазму клетки-мишени, но выполнение этого условия осложнено тем, что свободная НК в биологической среде быстро разрушается эндогенными нуклеазами, а также тем, что из-за высокой гидрофиль-ности и значительного отрицательного заряда молекулы НК затрудняется ее прохождение через клеточную мембрану. Данные факторы создают область повышен-
ного внимания к критерию эффективности получаемых транспортеров НК. К перспективным транспортерам НК следует отнести катионные пептиды (КП), характеризующиеся высокой трансмембранной активностью, стабильностью при хранении, наличием регулярной структуры, что позволяет проводить анализ их подлинности и чистоты инструментальными методами. Рассматривая классификацию КП, способных проникать в клетки, выделяют следующие классы: фрагменты белков, нацеленные на связывание молекул НК, транс-дукционные домены и сигнальные структуры белков, природные антимикробные пептиды (чаще их фрагменты), последовательности из вирусных и бактериальных адгезионных белков и пептиды оригинального дизайна, включая пептиды из фаговых библиотек [2]. Важно отметить, что устойчивость линейных КП к про-теолизу весьма ограничена, поскольку а-амидные связи аминокислотной цепи легко расщепляются в биологической среде [3]. Для повышения протеолитической устойчивости применяют различные подходы: замену
L-аминокислот на D-формы, модификацию пептидного скелета синтетическими фрагментами [4, 5]. Введение в пептиды остатков жирной кислоты увеличивает их сродство к липидным мембранам [6, 7], но приводит к снижению растворимости в водной среде.
В качестве альтернативных векторов применяются катионные дендримерные пептиды (КДП), представляющие собой разветвленные трехмерные структуры с плотным ядром и внешним слоем, состоящим из положительно заряженных групп. Наличие большого количества катионных групп позволяет КДП эффективно связывать и конденсировать НК в более компактные формы. Известно, что такие пептиды менее токсичны, чем линейные, и способны эффективнее проникать через клеточные мембраны [3, 8-11]. Кроме того, они более устойчивы к действию протеолитических ферментов из-за разветвленной структуры и наличия неприродных е-пептидных связей. КДП являются полиэлектролитами: они обладают высокой растворимостью в водной среде даже при наличии в составе гидрофобных аминокислот, что важно при их системном введении [12]. Изменяя структуру терминальных групп, можно регулировать заряд, гидрофобность и в конечном счете фармакокинетику - КДП прочно связываются с мембранами, вызывая их временную деформацию, а затем проникают в клетки с помощью эндоцитоза, при этом не исключаются и иные механизмы, в том числе рецептор-зависимый путь [13, 14].
Цель данного исследования заключалась в конструировании, синтезе КДП, анализе связи - структура КДП/трансфекционная активность и оценке участия некоторых рецепторных молекул в трансмембранном транспорте КДП.
Материал и методы
Реагенты и растворители для пептидного синтеза и хроматографии. Диметилформамид (DMF), ацето-нитрил, метиленхлорид, N-метилпирролидон, 4-ме-тилпиперидин, N-метилморфолин (NMM), тиоанизол, 1,2-этандитиол, метил-трет-бутиловый эфир (Acros Organics, США), трифторуксусная кислота (Merck, Германия); смола для синтеза ChemMatrix® H-Rink amide (PCAS BioMatrix, Канада). Fmoc-защищенные аминокислоты, N-гидроксибензотриазол (HOBt), ди-изопропилкарбодиимид (DIC) - гексафторфосфат-бен-зотриазол-тетраметилуроний (HBTU) от Iris Biothech (Германия).
Культуры клеток. Клетки линий HeLa, A549 и ФЭЧ получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России. Клетки линии melIS получены из коллекции клеточных культур ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.
Синтез пептидов. Для автоматического синтеза использовали синтезаторпептидовPS3 (ProteinTechnologies Inc., США), в случае ручного синтеза - стеклянные реакторы от Sigma-Aldrich (США) и аналогичные реакторы, сделанные на заказ. При ручном варианте для ре-
акции конденсации использовалась смесь DIC/HOBt, в автоматическом синтезе для конденсации использовали HBTU/NMM. Отщепление пептидов от смолы проводили в 95 % растворе TFA с добавлением тиоанизола, 1,2-этандитиола и деионизированной воды. Сырые пептидные продукты осаждали трет-бутил-этиловым эфиром, экстрагировали разбавленной уксусной кислотой и затем высушивали лиофильно.
Очистка пептидов. Сырые пептиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя препаративный хроматограф LC-20 Prominence Shimadzu (Япония), колонки Vydac 218TP1022 (Grace, Великобритания) в режиме линейного градиента: 0-70 % элюента A (25 мин) и 100-30 % элюента В при 30 мл/мин с детектированием при 226 нм. Элюент А содержал 0,1 % TFA/H2O; элюент B содержал чистый аце-тонитрил. Чистоту пептидов анализировали с помощью масс-спектрометрии на приборе Microflex™ LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics, США).
Трансфекционный тест. Для скрининга транс-фекционной активности, способности синтетических пептидов в форме комплексов с НК осуществлять трансмембранный перенос, использовали тест, основанный на внутриклеточной доставке плазмиды pGL3, кодирующей репортерный ген люциферазы светлячка, в клетки линий HeLa и А549. 48-луночный планшет засевали клетками из расчета 80 тыс. клеток на лунку в 300 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали 24 ч при 37 °С в атмосфере 5 % CO2. Затем в лунки вносили трансфекционную смесь, содержащую в 40 мкл бессывороточной среды OptiMEM (Thermo Fisher, США) 0,25 мкг плазмиды pGL3 и 20 или 10 мкг исследуемого пептида или 0,3 мкл реактива Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher, США) (положительный контроль). Трансфекционную смесь инкубировали в течение 15 мин и вносили в лунки. Трансфекционная смесь для отрицательного контрольного образца содержала 0,25 мкг плазмиды без добавления трансфекционного агента. Клетки инкубировали в течение 24 ч, после чего среду отбирали, в лунки вносили по 150 мкл лизирующего буфера Glo (Promega, США). Клеточный лизат переносили в пробирки, вносили 50 мкл субстрата люциферазы, показатель люминесценции определяли на люминометре GloMax 20/20 (Promega, США).
Для более детального изучения активности пептидов проводили опыт по трансфекции плазмиды ptagGFP2, кодирующей репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Для теста использовали клетки линии HEK293T. 48-луночный планшет засевали клетками из расчета 80 тыс. клеток на лунку в 300 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали 24 ч при 37 °С в атмосфере 5 % CO2. Затем в лунки вносили трансфекционную смесь, содержащую в 40 мкл бессывороточной среды OptiMEM (Thermo Fisher, США) 0,25 мг плазмиды ptagGFP2 и 20 или 10 мкг исследуемого пептида или 0,3 мкл реактива Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher, США) (положительный контроль).
Трансфекционную смесь инкубировали в течение 15 мин, после чего отбирали клеточную среду, промывали клетки фосфатно-солевым буфером и вносили трансфекционную смесь в лунки. Трансфекционная смесь для отрицательного контрольного образца содержала 0,25 мг плазмиды без добавления трансфекци-онного агента. После инкубации в течение 1 ч в лунки вносили по 300 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали в течение 48 ч, клеточную среду собирали и отбрасывали, инкубировали клетки 10 мин в 100 мкл раствора трипсина. К клеточной суспензии прибавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера, пропускали через клеточное сито с диаметром пор 70 мкм и центрифугировали 5 мин со скоростью 500 g. Над-осадочную жидкость отбрасывали, клетки ресуспенди-ровали в 300 мкл FACS-буфера (BD Biosciences, США) и исследовали с помощью проточной цитометрии на аппарате BD FACSCanto II (BD Biosciences , США).
Цитотоксичность. Для определения цитотоксич-ности полученных пептидов применялся описанный в литературе МТТ-тест [15]. Тест проводили на клетках линий HeLa и ФЭЧ. В 96-луночный планшет вносили клетки из расчета 15 тыс. клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия) и инкубировали в течение суток. Клеточную среду отбирали и вносили 100 мкл среды DMEM, содержащей один из исследуемых пептидов в концентрации 32, 63, 125, 250, 500, 1000 или 2000 мкг/мл. В положительный контрольный образец вносили 100 мкл воды деионизованной, в отрицательный контрольный образец вносили 100 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Образцы инкубировали в течение суток, вносили 25 мкл раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) в концентрации 4 мг/мл. Образцы инкубировали в течение 4 ч, после чего вносили лизирующий буфер, представляющий собой 20 % раствор додецилсульфата натрия (Sigma-Aldrich, США) в 0,02 н водном растворе серной кислоты. Образцы инкубировали 24 ч и проводили измерение светопоглощения при характеристической длине волны 570 нм и длине волны сравнения 650 нм.
Введение флуоресцентной метки в пептид NC-811. Флуорофор Cy5 (BioDye, Россия), содержащий ма-леимидный фрагмент, присоединяли к КДП по тио-ловой группе С-концевого цистеина (мольное соотношение 1 : 1) в растворе ДМСО без доступа света в течение 4 ч при комнатной температуре и 12 ч при 4 °С. Неприсоединившийся краситель экстрагировали этила-цетатом. Остаток промывали эфиром, высушивали и полученный синий порошок очищали на смоле Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich, США), используя 5 % уксусную кислоту как элюент. Масс-спектр лиофилизированного продукта показывал основной молекулярный пик с показателем m/z 2946, соответствующий к молекулярному иону целевого соединения. Меченый пептид имеет характерные полосы возбуждения и испускания при 650 и 670 нм соответственно.
Анализ колокализации меченого дендримерного пептида и клеточных белков. Для визуализации ме-
ченых пептида и белков клетки меланомы линии melIS культивировали 1 сутки в микроячейках (Lab Cell Imaging Slides, Eppendorf, Германия). Затем в каждую ячейку, кроме контрольных, добавляли по 0,5 мкг/мл меченого пептида (NC-811-Cy5), инкубировали в течение 2-6 ч и далее анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ni-U (Nikon, Япония). Для иммуногистохимического анализа клетки после их фиксации на стекле 4 % параформальдегидом в течение 10 мин пермеабилизовали 0,1 % Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 10 мин и блокировали 1 % BSA (Sigma-Aldrich, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки метили флуоресцентно меченными моноклональными антителами к NCL/C23, NPM/B23 (Life Technology, США), используя систему визуализации CyGel Sustain™ (Abcam, Великобритания).
Результаты
1. Дизайн и синтез пептидов. Основная задача данной работы состояла в получении пептидной конструкции с низкой токсичностью, стабильной в сывороточной среде, при этом структура должна демонстрировать значительную эффективность в стимуляции трансфекции. Наш план предполагал создание модульных конструкций. Одним из таких модулей является N-концевой суперкатионный участок, представленный остатками аргинина. Он необходим для взаимодействия с НК и с поверхностью клетки. Центральный модуль представлен гидрофобным ядром из остатков лизина и короткими гидрофобными/амфифильными вставками. С-концевой модуль также формирует гидрофобный участок, обеспечивающий дополнительное сродство с мембраной клетки, и содержит остаток цистеина со свободной тиольной группой, предназначенной для присоединения репортерной метки. Все синтезы были проведены твердофазным методом с использованием Fmoc-защиты для a-аминогрупп и высоконабухающей смолы Rink-amide ChemMatrix (Iris Biothech, Германия), что обусловлено объемной структурой этих пептидов. Выходы конечных продуктов (список в табл. 1) после очистки составляли 20-30 %.
Почти все пептиды содержали короткие гидрофобные фрагменты, как в N-, так и в С-концевых участках КДП с целью повышения гидрофобности и гибкости звеньев дендримера в качестве своеобразных шарниров для облегчения подвижности катионного модуля пептида. Пептид NC-811, как один из самых простых полученных нами КДП, не содержал таких вставок и потому был использован в качестве контрольного соединения для сравнения трансфекционной активности.
2. Анализ трансфекционной активности. Результаты доследований с помощью люциферазного теста отражены в табл. 1. Мы проанализировали связь между гидрофобностью отдельных участков КДП и трансфекци-онной активностью. В табл. 1 приведены предсказанные параметры гидрофобности N- и C-концевых участков, основанные на сумме индексов гидрофобности аминокислот [16], входящих в состав этих участков. Анализ диа-
Таблица 1. Структура и свойства суперкатионных дендримерных пептидов
Шифр Аминокислотная последовательность Молекулярная масса, Да Заряд при рН 7,0 Параметр гидрофобности* 1\-ко11-цевого участка Параметр гидрофобности С-кон-цевого участка Эффективность в трансфекции* Ьо«|(| интенсивности свечения клеток ± стандартное отклонение % трансфе-цированных клеток ± стандартное отклонение 1С50, мг/мл
НеЬа А-549 НЕК293Т НеЬа ФЭЧ
Б-8.2 1352 8 0 2,52 2,26 ±0,023 2,32 ±0,020 0,0 ± 0,0 >2000 >2000
Б-20 ЯДК0К1>]\1РГ8К1УКЕТ1ЕТЕТ> 2955 10 0 1,97 2,29 ± 0,044 2,32 ±0,028 0,0 ± 0,0 >2000 >2000
Б-21 3438 15 -1,68 2,75 3,06 ±0,058 2,92 ±0,021 0,2 ± >2000 >2000
Б-22 2923 16 4,88 3,22 3,31 ±0,445 4,83 ±0,423 5,2 ± 1,2 1871 744
Б-23 (Я),(КО)а(К)ДСУСУС 2807 10 0 3,98 4,70 ±0,390 5,06 ±0,564 3,6 ±0,9 1881 864
Б-24 ОТ),(К1)0кпс 2130 12 4,52 5,14 5,49 ±0,819 5,28 ±0,856 7,2 ± 2,5 2131 632
Б-25 (ДУЦЩО), (КЬ)„КР 3856 16 7,12 0,72 2,66 ± 0,462 4,16 ±0,564 2,5 ±0,7 >2000 1201
ТА-26 ДО, (КЬТРЕУ), (КЩДГС 4847 18 13,04 3,33 2,34 ±0,044** 2,27 ±0,035** 0,0 ± 0,0 1015 482
КК-58 (ЮЖ), (К)0КЫШКЪР 3431 12 2,48 3,35 5,93 ±0,683 6,99 ±0,819 17,8 ± 1,5 233 95
КК-46 (ДЦТСШРЕ V), (КН),СТС 5140 12 15,24 3,49 6,60 ± 0,592 5,70 ±0,505 17,0 ± 1,9 1955 972
N0-811 (Я),(К)а(К)ДАС 2338 16 0 1,85 2,96 ±0,019 3,22 ±0,501 15,3 ±2,4 1785 628
КК-50 (ТО/КОХКАЛУЛУС 1688 8 0 6,35 3,42 ±0,498 3,68 ±0,422 2,4 ± 1,1 861 850
8А-32 (Р)д(К),(КУ)0КР\¥С 2876 16 1,92 4,67 5,51 ±0,813 2,90 ±0,041 1,6 ±0,8 605 540
КК-61 ДОД-К0)2КА\¥\¥С-(С4Н2К02)- сз.-со-ж-с^н,, 2077 8 0 -9,75 2,29 ±0,067 2,30 ±0,047** 0,0 ± 0,0 250 108
8А-40 (ТЖШЛт^КЮЧТС 2758 9 3,07 0,21 3,06 ±0,069 2,65 ±0,034 2,7 ± 0,4 >2000 934
Ы'ЗООО Коммерческий трансфецирую-щий агент 6,31 ±0,845 6,94 ±0,933 16,0 ±2,0
Примечание. * Параметр гндрофобности - сумма индексов шкалы гидрофобиости аминокислот [20]. ** Пептид с высокой цитотоксичностъю. У-концевые гидрофобные фрагменты выделены подчеркиванием; С-концевые гидрофобные фрагменты выделены жирным шрифтом.
7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
-5
Зависимость эффективности трансфекции от физико-химических свойств
• R2=0,4( 25 • •
• • i •
1 ё R2=0,1633
* ......J......_ .r2 =0,0818
• / •• • •
0 5 10 15
• N-гидрофобность
..........Polynomial (N-гидрофобность)
• C-гидрофобность
..........Polynomial (C-гидрофобность)
Э Cумма гидрофобности ..........Polynomial ^умма гидрофобности)
20
В
7,00
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
Зависимость эффективности трансфекции от физико-химических свойств
10 12 14 16 18
• Заряд ........ Polynomial (Заряд)
20
Рис. 1. Зависимость эффективности трансфекции от гидрофобности N и С-концевых фрагментов (А) и от суммарного заряда (Б) пептида
грамм (рис. 1), построенных на основе этих данных, указывает на определенную тенденцию: слишком высокая гидрофобность и слишком высокий суммарный заряд снижают эффективность трансфекции. Это, по-видимому, связано с «залипанием» пептида на мембране и/или повышением его токсичности, что отмечалось ранее [4]. Интересно, что повышение гидрофобности С-концевого участка дает более значимый вклад в стимуляцию трансфекции. Пептиды, показавшие наибольшую активность в этом тесте, обладают суммарным зарядом +12 при физиологическом значении рН. Этот тест, однако, не позволяет учесть гибель трансфецированных клеток под воздействием КДП, а также различие в интенсивности экспрессии репортерного гена в зависимости от механизма трансфекции. Для более детального изучения активности пептидов было проведено исследование методом проточной цитометрии с использованием гена, кодирующего вБР, в качестве репортерного гена. Настройки гейтинга и примеры распределения интенсивности флуоресценции в канале Б1ТС представлены на рис. 2. Следует обратить внимание на разницу в интенсивности экспрессии репортерного гена при липофекции (рис. 2В) и трансфекции пептидами (рис. 2Г-Д). При сравнимой численности популяций трансфецированных клеток липофекция демонстрирует значительно больший разброс значений с более высоким уровнем экспрессии. Такое различие может указывать на различие в механизмах трансмембранного переноса.
3. Анализ цитотоксичности КДП. Цитотоксическое действие пептидов на различные клеточные культуры
исследовали с помощью МТТ-теста в широком диапазоне концентраций, рассчитывая ингибирующую цито-токсическую концентрацию 1С50 (табл. 1). Следует отметить, что природа клеток не оказывала сильного влияния на чувствительность к КДП. Диапазон 1С50 к большинству пептидов лежал в интервале 0,100-2000 мкг/мл. В то же время введение в С-концевую часть КДП длинного остатка жирной кислоты (пептид КК-61) и катион-ного амфифильного фрагмента в вконец КДП заметно повышало их токсичность. Следует обратить внимание, что зависимость токсического действия пептида N€-811 на клетки ИеЬа от его концентрации выражалась в немонотонной кривой со снижением токсичности при повышении концентрации (рис. 3). Возможно, что при высоких концентрациях пептид образует агрегаты с понижением эффективной концентрации.
4. Анализ внутриклеточной локализации КДП. Мы предположили, что хорошими неспецифическими мишенями для суперкатионных пептидов являются анионные структуры или кластеры на поверхности и внутри клеток, такие как гепарансульфат, шаперон-ные белки, нуклеолин/С23 ^СЬ) и нуклеофозмин/ В23 (№М), присутствующие во всех клетках и регулирующие ключевые клеточные функции [17]. С учетом этих соображений был изучен внутриклеточный транспорт суперкатионного пептида N^811, содержащего флуоресцентную метку, и проведена оценка возможности его взаимодействия с клеточными белками NCL и NPM путем анализа их колокализации в клетках шеИБ (рис. 4).
э
250 К^ 200 К
< 150 КО кп
100 К-50 К-0-
(250 К -200 К
Я 150 К
С) кп
^ 100 К 50 К 0
0 50 К 100 К 150 К 200 К 250 К Р8С-Л
^ 1,2 К
9006 600 3000-
■103 0 10
800 600 <3 400 200 0
1,5 К
1,0 К
500
ОРР +
15,4
.........1 Лтттпч.....................^
0 50 К 100 К 150 К 200 К 250 К Р8С-Л
ОРР +
16,8
Э
1,5 К 1,0 К 500
104
105
-103 0 103
104
105
ртте-л
ртте-л
-103 0 103
104
ртте-л
-103 0 103
104
ртте-л
105
105
Рис. 2. Проточно-цитометрический анализ клеток ИЕК293Т, трансфецированных плазмидой ptagGFP2
А - суммарная популяции клеток НЕК293Т; Б - единичные клетки; В - популяции клеток с флуоресценцией в ¥!ТС-канале (йЕР-положительные клетки) в положительном контрольном образце с трансфекцией липофектамином; Г - образец с трансфекцией с использованием пептида КК-46; Д - образец с трансфекцией с использованием пептида МС-811; Е - образец с трансфекцией с использованием пептида Б-24. Горизонтальной линией отмечена сортировка клеток с флуоресценцией в ¥!ТС-канале (расположены ниже линии).
0
0
На фотографиях (см. рис. 4) видны идентичные формы пятен в местах локализации меченого пептида и, соответственно, меченых NCL и №М (см. рис. 4А и 4В). Совместная локализация меченого р53 и N^811 (см. рис. 4Б) указывает на их расположение в ядре. Ранее было показано, что пептид N^811 с большой вероятностью способен блокировать РСВ-инфекцию, поскольку вход вируса в клетку опосредован нуклеолином и сульфатированными протеогликанами [18, 19]. Таким образом, эти данные дают большие основания считать вероятное участие этих белков в транспорте катионных пептидов в клетку.
Обсуждение
При проектировании пептидов выбор остатков аргинина (Я) в качестве терминальных групп во всех КДП был обусловлен следующими факторами. Экспериментально было установлено, что при трансфекции синтезированный нами КДП N^811 с терминальными остатками аргинина - (Я)8(К)4(К)2КАС, демонстрировал более высокую активность, чем пептид-аналог (К)8(К)4(К)2КАС (N^798). В последнем пептиде имеется единственная замена концевого аргинина (Я) на лизин (К). Ключом к пониманию такой повышенной активности именно Я-пептидов может служить особенность структуры гу-анидиновой группы аргинина, описанная ранее [20].
В водной среде гуанидиновый катион, содержащий 3 заряженные аминогруппы, формирует планарную псевдоароматическую структуру с 3 сопряженными связями при очень высоком рК. Такой ион образует прочные водородные связи с молекулами воды, расположенными в той же плоскости, образуя амфифиль-ный катион с гидрофобным анфасом. Он способен взаимодействовать с гидрофобными ароматическими аминокислотными остатками в мембранных белках (триптофаном, тирозином), а также активно связываться с карбоксилат-анионами (с атомами кислорода)
1,50
8 1,00
0
1
с 0,50 О
0,00
0,98 1,00 0,99 1.00 0,97 0 94
■ —•^0,79 0,51
-,—.......|-,—.......|-'—....... О7** Г -,—.......1
0,00 0,01 0,10 1,00 Концентрация МС-811, мг/мл
10,00
Рис. 3. Кривая титрования токсичности пептида ЫС-811 в отношении клеток ИеЬа
■Ц
7 мкм
Э
NC-811-Cy5
NCL-YeG
э
i fj # Jl Р i ■w 25 мкм
P53-GFP NC-811-Cy5
9 » ш
3 мкм
NPM-GFP
NC-811-Cy5
Рис. 4. Колокализация меченого суперкатионного пептида NC-811 и меченых нуклеолина (NCL), нуклеофозмина (NPM) и белка р53 в ядре клеток meЦS
А - N0-811-Су5 (красный), NCL-YeG (желто-зеленый); Б - P53-GFP (зеленый), NC-811-Cy5 (красный); В - NPM-GFP (зеленый), NC-811-Cy5 (красный).
аспарагиновой и глутаминовой кислот. Между тем, у K-пепгидов аминокатион имеет совсем иную структуру, аммонийную, где между этими катионами доминируют силы отталкивания. Катионы R-пептидов в водной среде не проявляют взаимного электростатического отталкивания, как следствие, наблюдается энергетически выгодное спаривание гуанидиновых групп в пло ско стной ориентации (л-л-стэкинг-взаимодействие). Принимая во внимание этот факт, становится очевидным, что связывание R-пептида с мембраной намного сильнее, чем у К-пептида. Так, ранее показано, что разветвленные дендримерные пептиды, содержащие только 2 остатка аргинина, способны прочнее связываться с мембранами и проникать в клетки более эффективно, чем пептиды с 2 остатками лизина [20]. Молекулярные кластеры аргинина в водных растворах имеют гидрофобную поверхность за счет сопряжения трех метиленовых групп [21, 22]. Мы полагаем, что транспорт R-пепгида в клетку может идти за счет различных вариантов эндо-
цитоза, как по энергонезависимому пути, так и за счет взаимодействия с анионными центрами клеточных белков, гепарансульфатом, NCL и NPM, играющими роль низкоаффинных рецепторов [18]. Но эффективность интернализации пептида, по-видимому, зависит от оптимальной величины положительного заряда и достаточного количества гидрофобных участков, играющих важную роль в проникновении через мембраны клетки.
Хорошо известно, что основной механизм интер-нализации многих макромолекул в эукариотические клетки опосредуется клеточными рецепторами. Это относится и к природным пептидам. Например, тафтсин, катионный тетрапептид, стимулятора фагоцитоза и хемотаксиса, проникает в клетку после взаимодействия с клеточным рецептором нейропилином [23]. Положительно заряженные участки, сформированные из кати-онных аминокислотных остатков, часто присутствуют во внешней белковой оболочке вирусов (например, РСВ, ВИЧ) и электростатические взаимодействия этих протеинов дают заметный вклад в их связывание с клеткой и в интернализацию. КДП, очевидно, способны электростатически взаимодействовать с анионными кластерами на клетках-мишенях путем связывания как с фосфоли-пидными мембранами, так и с рецепторными молекулами. При этом, помимо эффективности интернализа-ции комплекса КДП-плазмида, существенное влияние на экспрессию гена в составе плазмиды оказывают кинетика их высвобождения из эндосомы и дальнейшая внутриклеточная локализация. Высокая скорость ин-тернализации в сочетании с низкой скоростью высвобождения плазмиды из эндосомы и наработки репортер-ного протеина, вероятно, указывает на макропиноцитоз как основной механизм трансфекции комплексов НК с КДП, в отличие от липоплексов липофектамина, для которых характерен путь клатрин-зависимого эндоци-тоза. Последний характеризуется более высокой скоростью высвобождения плазмиды из эндосом и, как следствие, более высоким уровнем экспрессии репор-терного гена, однако взаимодействие с сывороточными белками существенно ограничивает применение таких комплексов in vivo. Существенно, что введение цисте-ина в С-концевой участок КДП может значительно повышать эффективность трансфекции [24].
NCL и гепарансульфат (имеет сильный отрицательный заряд) были идентифицированы как клеточные ко-рецепторы для РСВ [19], причем способные взаимодействовать с одними и теми же природными лигандами. Молекулы КДП могут связываться с рецепторным NCL как за счет электростатических взаимодействий, так и путем формирования стабильных водородных связей. Например, белок эндостатин является мощным ингибитором ангиогенеза с гепарин-зависимой активностью, и NCL выступает как функциональный рецептор эндо-статина, опосредуя его интернализацию в эндотелиаль-ные клетки. Важно, что именно катионный кластер на поверхности эндостатина, собранный из остатков аргинина, дает основной вклад в высокоаффинное взаимодействие с клеткой и опосредует антиангиогенную
и противоопухолевую активность этого белка [25]. В этой связи имеется некая аналогия с катионным кластером в МТ-концевом участке молекул КДП и их функциональной активностью. В клетках большинства злокачественных образований повышен уровень экспрессии шаперонных белков ЫРМ и МТСЬ, причем гликозилиро-ванный МСЬ гиперэкспрессирован и на поверхности опухолевых клеток. Поэтому эти белки являются предпочтительными мишенями для суперкатионных КДП [26].
Заключение
Полученные результаты показывают, что суперкати-онные дендримерные пептиды способны эффективно переносить олигонуклеотиды в цитоплазму и ядро эукариотической клетки. Установлен ряд структурных параметров, которые определяют эффективность трансфекции. Успех процесса зависит от величины положительного заряда пептида, свойств терминального
аминокислотного остатка, наличия и распределения гидрофобных участков (гидрофобного момента). Основные преимущества использования дендримерных пептидов по сравнению с линейными заключаются в их устойчивости к ферментативной деградации и значительно меньшей токсичности. Ранее нами было показано, что время полураспада линейного и дендримерного пептидов в сывороточной среде (кровь человека) могут различаться на порядки (10 мин для линейного пептида ЬЬ-37 и 15 ч для дендримерного аналога МС-811 [18]). Клинические испытания уже показали эффективность применения КДП для доставки молекул миРНК при лечении инфекции, вызванной 8ЛЯ8-СоУ-2, с помощь препарата, действующего на основе РНК-интерференции [27]. Такие пептиды также рассматриваются как потенциальные противоопухолевые агенты, индуцирующие апоптоз трансформированных клеток и резко снижающие их про-лиферативную активность [24].
■ Литература
1. Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S., Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391: 806-11. DOI: https://doi. org/10.1038/35888
2. Milletti F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 2012; 17: 850-60. DOI: https://doi. org/10.1016/j.drudis.2012.03.002
3. Luo K., Li C., Wang G., Nie Y., He B., Wu Y., Gu Z. Peptide den-drimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J. Control. Rel. 2011; 55 (1): 77-87. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jconrel.2010.10.006
4. Takechi-Haraya Y., Saito H. Current understanding of physico-chemical mechanisms for cell membrane penetration of arginine-rich cell penetrating peptides: Role of glycosaminoglycan Interactions. Curr. Prot. Pept. Sci. 2018; 19 (6): 623-30. DOI: https://doi.org/10.1016/jjcon-rel.2010.10.006
5. Kumar V., Agrawal P., Kumar R., Bhalla S., Usmani S.S., Varsh-ney G.C., Raghava G. P. Prediction of cell-penetrating potential of modified peptides containing natural and chemically modified residues. Front Microbiol. 2018; 9: 725. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018. 00725
6. Hofland H.E., Shephard L., Sullivan S.M. Formation of stable cat-ionic lipid/DNA complexes for gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 7305-9.
7. Турецкий E.A., Колоскова O.O., Носова A.C., Шиловский И.П., Себякин Ю.Л., Хаитов M.P. Физико-химические свойства липосом на основе липопептидов и их комплексов с ми-РНК. Биомед. химия. 2017; 63 (5): 472-5. DOI: https://doi.org/10.18097/PBMC20176305472
8. Regberg J., Srimanee A., Erlandsson M., Sillard R., Dobchev D.A., Karelson M., Langel U. Rational design of a series of novel amphipath-ic cell-penetrating peptides. Int. J. Pharm. 2014; 464 (1-2): 111-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2014.01.018
9. Eggimann G.A., Blattes E., Buschor S., Biswas R., Kammer S.M., Darbre T., Reymond J.-L. Designed cell penetrating peptide dendrimers efficiently internalize cargo into cells. Chem. Comm. 2014; 50: 7254. DOI: https://doi.org/10.1039/C4CC02780A
10. Shcharbin D., Shcharbina N., Bryszewska M. Recent patents in dendrimers for nanomedicine: Evolution 2014. Recent patents on nano-medicine. 2014; 4 (1): 25-31. DOI: https://doi.org/10.2174/18779123046 66140609233256
11. Никольский А. А., Шиловский И.П., Юмашев К.В., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В. И., Корнеев А. В., Туренко В.Н., Каганова М.М., Брылина В.Е., Никонова А. А., Козлов И. Б., Кофиа-ди И.А., Сергеев И.В., Маерле А.В., Петухова О.А., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Влияние локального подавления экспрессии гена Stat3 на нейтрофильное воспаление легких в экспериментальной моде-
ли на мышах. Иммунология. 2021; 42 (6): 600-14. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-600-614
12. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V., Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V., Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org. Biomol. Chem. 2018; 16 (43): 8181-90. DOI: https://doi.org/10.1039/C8OB02039F
13. Allolio C., Magarkar A., Jurkiewicz P., Baxova K., Javanainen M., Mason P.E., Sachl R., Cebecauer M., Hof M., Horinek D., Heinz V, Rachel R., Ziegler C.M., Schrofel A., Jungwirth P. Arginine-rich cell-penetrating peptides induce membrane multilamellarity and subsequently enter via formation of a fusion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018; 115: 11923-8. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1811520115
14. Takechi-Haraya1 Y., Ohgita T., Kotani M., Kono H., Saito C., Tamagaki-Asahina H., Nishitsuji K., Uchimura K., Sato T., Kawano R., Sakai-Kato K., Izutsu K., Saito H. Effect of hydrophobic moment on membrane interaction and cell penetration of apolipoprotein E-derived argininerich amphipathic a-helical peptides. Sci. Reports. 2022; 12: 4959. DOI:
https://doi.org/10.1038/s41598-022-08876-9
15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immun. Methods. 1983; 65: 55-63. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4
16. Frommel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy. J. Theor. Biol. 1984; 111: 247-260. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-5193(84)80209-X
17. Понкратова Д.А., Лушникова А. А. Особенности структуры и экспрессии генов NPM NCL при меланоме кожи. Мол. Биол. 2019; 53 (4): 663-73. DOI: https://doi.org/10.1134/S0026898419040098
18. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva F.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.A., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J. Mater Chem. B. 2020; 8: 2607-17. DOI: https://doi.org/10.1039/C9TB02485A
19. Feng Z., Xu L., Xie Z. Receptors for respiratory syncytial virus infection and host factors regulating the life cycle of respiratory syncy-tial virus. Front Cell Infect. Microbiol. 2022; 12: 858629. DOI: https://doi. org/10.3389/fcimb.2022.858629
20. Vazdar M., Heyda J., Mason P.E., Tesei J., Allolio C., Lund M., Jungwirth P. Arginine «magic»: Guanidinium like-charge ion pairing from aqueous salts to cell penetrating peptides. Acc. Chem. Res. 2018; 51: 1455-64. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.accounts.8b00098
21. Chua B.Y., Zeng W., Jackson D.C. Simple branched arginine-based structures can enhance the cellular uptake of peptide cargos. Int. J. Pep. Therap. 2007; 13 (3): 431-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10989-006-9063-y
22. Das U., Hariprasad G., Ethayathulla A.S., Manral P., Das T.K., Pasha S., Mann A., Ganguli M., Verma A.K., Bhat R., Chandrayan S.K., Ahmed S., Sharma S., Kaur P., Singh T.P., Srinivasan A. Inhibition of protein aggregation: Supramolecular assemblies of arginine hold the key. PLoS ONE. 2007; 2 (11): e1176. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. pone.0001176
23. Huang J., Wang J., Li Y., Wang Z., Chu M., Wang Y. Tuftsin: A natural molecule against SARS-CoV-2 infection. Front. Mol. Biosci. 2022; 9: 859162. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.859162
24. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. NAR. 2003; 31 (11): 2717-24.
25. Fu Y., Chen Y., Luo X., Liang Y., Shi H., Gao L., Zhan S., Zhou D., Luo Y. The heparin binding motif of endostatin mediates its interaction
with receptor nucleolin. Biochemistry. 2009; 48 (49): 11655-63. DOI: https://doi.org/10.1021/bi901265z
26. Лушникова А.А., Морозова Л.Ф., Понкратова Д.А., Балбуц-кий А.В., Андреев С.М., Михайлов А.Э., Хаитов М.Р. Применение катионных пептидов для индукции гибели клеток меланомы кожи человека. Патент. RU2620170 С1.
27. Khaitov M., Nikonova А., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V, Barvinskaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Rybalkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin I., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850
■ References
1. Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S., Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391: 806-11. DOI: https://doi. org/10.1038/35888
2. Milletti F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 2012; 17: 850-60. DOI: https://doi. org/10.1016/j.drudis.2012.03.002
3. Luo K., Li C., Wang G., Nie Y., He B., Wu Y., Gu Z. Peptide den-drimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J Control Rel. 2011; 55 (1): 77-87. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jconrel.2010.10.006
4. Takechi-Haraya Y., Saito H. Current understanding of physico-chemical mechanisms for cell membrane penetration of arginine-rich cell penetrating peptides: role of glycosaminoglycan Interactions. Curr Prot Pept Sci. 2018; 19 (6): 623-30. DOI: https://doi.org/10.1016/jjcon-rel.2010.10.006
5. Kumar V, Agrawal P., Kumar R., Bhalla S., Usmani S.S., Varsh-ney G.C., Raghava G. P. Prediction of cell-penetrating potential of modified peptides containing natural and chemically modified residues. Front Microbiol. 2018; 9: 725. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00725
6. Hofland H.E., Shephard L., Sullivan S.M. Formation of stable cat-ionic lipid/DNA complexes for gene transfer. Proc Natl Acad Sci. USA. 1996; 93: 7305-9.
7. Turetsky E.A., Koloskova O.O., Nosova A.S., Shilovsky I.P., Se-byakin Yu.L., Khaitov M.R. Physicochemical properties of lipopeptide-based liposomes and their complexes with siRNA. Biomedical Chemistry. 2017; 63 (5): 472-5. DOI: https://doi.org/10.18097/PBMC20176305472 (in Russian)
8. Regberg J., Srimanee A., Erlandsson M., Sillard R., Dobchev D.A., Karelson M., Langel U. Rational design of a series of novel amphipathic cell-penetrating peptides. Int J Pharm. 2014; 464 (1-2): 111-6. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.ijpharm.2014.01.018
9. Eggimann G.A., Blattes E., Buschor S., Biswas R., Kammer S.M., Darbre T., Reymond J.-L. Designed cell penetrating peptide dendrimers efficiently internalize cargo into cells. Chem Comm. 2014; 50: 7254. DOI: https://doi.org/10.1039/C4CC02780A
10. Shcharbin D., Shcharbina N., Bryszewska M. Recent patents in dendrimers for nanomedicine: Evolution 2014. Recent patents on nano-medicine. 2014; 4 (1): 25-31. DOI: https://doi.org/10.2174/18779123046 66140609233256
11. Nikolskii A.A., Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Vishniakova L.I., Barvinskaia E.D., Kovchina V.I., Korneev A.V., Turenko V.N., Kaga-nova M.M., Brylina V.E., Nikonova A.A., Kozlov I.B., Kofiadi I.A., Sergeev I.V., Maerle A.V., Petukhova O.A., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Effect of local suppression of Stat3 gene expression in a mouse model of pulmonary neutrophilic inflammation. Immunologiya. 2021; 42 (6): 600-14. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-600-614 (in Russian)
12. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V., Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V., Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org Biomol Chem. 2018; 16 (43): 8181-90. DOI: https://doi.org/10.1039/C8OB02039F
13. Allolio C., Magarkar A., Jurkiewicz P., Baxovä K., Javanainen M., Mason P.E., Sachl R., Cebecauer M., HofM., Horinek D., Heinz V., Rachel R.,
Ziegler C.M., Schrofel A., Jungwirth P. Arginine-rich cell-penetrating peptides induce membrane multilamellarity and subsequently enter via formation of a fusion pore. Proc Natl Acad Sci USA. 2018; 115: 11923-8. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1811520115
14. Takechi-Haraya1 Y., Ohgita T., Kotani M., Kono H., Saito C., Tamagaki-Asahina H., Nishitsuji K., Uchimura K., Sato T., Kawano R., Sakai-Kato K., Izutsu K., Saito H. Effect of hydrophobic moment on membrane interaction and cell penetration of apolipoprotein E-derived argininerich amphipathic a-helical peptides. Sci Reports. 2022; 12: 4959. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-08876-9
15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immun Methods. 1983; 65: 55-63. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4
16. Frommel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy. J Theor Biol. 1984; 111: 247-260. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-5193(84)80209-X
17. Ponkratova D. A., Lushnikova A.A. Structural features and expression of NPM and NCL in cutaneous melanoma. Molecular Biology. 2019; 53 (4): 663-73. DOI: https://doi.org/10.1134/S0026898419040098 (in Russian)
18. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva F.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.A., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J Mater Chem. B. 2020; 8: 2607-17. DOI: https://doi.org/10.1039/C9TB02485A
19. Feng Z., Xu L., Xie Z. Receptors for respiratory syncytial virus infection and host factors regulating the life cycle of respiratory syncy-tial virus. Front Cell Infect. Microbiol. 2022; 12: 858629. DOI: https://doi. org/10.3389/fcimb.2022.858629
20. Vazdar M., Heyda J., Mason P.E., Tesei J., Allolio C., Lund M., Jungwirth P. Arginine «magic»: Guanidinium like-charge ion pairing from aqueous salts to cell penetrating peptides. Acc. Chem. Res. 2018; 51: 1455-64. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.accounts.8b00098
21. Chua B.Y., Zeng W., Jackson D.C. Simple branched arginine-based structures can enhance the cellular uptake of peptide cargos. Int J Pep Therap. 2007; 13 (3): 431-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10989-006-9063-y
22. Das U., Hariprasad G., Ethayathulla A.S., Manral P., Das T.K., Pasha S., Mann A., Ganguli M., Verma A.K., Bhat R., Chandrayan S.K., Ahmed S., Sharma S., Kaur P., Singh T.P., Srinivasan A. Inhibition of protein aggregation: Supramolecular assemblies of arginine hold the key. PLoS ONE. 2007; 2 (11): e1176. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. pone.0001176
23. Huang J., Wang J., Li Y., Wang Z., Chu M., Wang Y. Tuftsin: A natural molecule against SARS-CoV-2 infection. Front Mol Biosci. 2022; 9: 859162. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.859162
24. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. NAR. 2003; 31 (11): 2717-24.
25. Fu Y., Chen Y., Luo X., Liang Y., Shi H., Gao L., Zhan S., Zhou D., Luo Y. The heparin binding motif of endostatin mediates its interaction with receptor nucleolin. Biochemistry. 2009; 48 (49): 11655-63. DOI: https://doi.org/10.1021/bi901265z
26. LushnikovaA.A., Morozova L.F., Pankratova D.A., BalbutskyA.V., Andreev S.M., Mikhailov A.E., Khaitov M.R. Application of cationic peptides for induction of human skin melanoma cell death. Patent. RU26 20170C1
27. Khaitov M., Nikonova A., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvinskaya E.,
Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Ry-balkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin I., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850
Сведения об авторах
Кожихова Ксения Вадимовна - канд. хим. наук, ст. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: kv.kozhikhova@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5124-6826X
Андреев Сергей Михайлович - канд. хим. наук, зав. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
Успенская Диана Владимировна - студент ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); лаборант лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: d.v.uspenskaya@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-7490-063X
Шатилова Анастасия Витальевна - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: av.timofeeva@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-3780-2878X
Турецкий Евгений Александрович - канд. фарм. наук, мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; ассистент кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А. П. Арзамасцева ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: ea.turetskiy@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-6822-3409X
Шатилов Артем Андреевич - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.shatilov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4675-8074X
Лушникова Анна Александровна - д-р биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. онкогеномики РОНЦ ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России; E-mail: lan21@yandex.ru http://orchid.orig/0000-0002-7838-1005X
Authors' information
Ksenia V. Kozhikhova - PhD, Senior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: kv.kozhikhova@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5124-6826X
Sergey M. Andreev - PhD, Head of the of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
Diana V. Uspenskaya - Student of I.M. Sechenov First MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University); Laboratory Assistant of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: d.v.uspenskaya@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-7490-063X
Anastasia V. Shatilova - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: av.timofeeva@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-3780-2878X
Evgeny A. Turetskiy - PhD, Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Assistant of A.P. Arzamastsev Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair of I.M. Sechenov First MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: ea.turetskiy@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-6822-3409X
Artem A. Shatilov - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.shatilov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4675-8074X
Anna А. Lushnikova - Dr.Sci., PhD, Leader Researcher of the Oncogenomics Lab., N.N. Blokhin NMRC of oncology, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: lan21@yandex.ru http://orchid.orig/ 0000-0002-7838-1005X
Вишнякова Людмила Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: lyudmilochka94@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3555-3268X
Шиловский Игорь Петрович - д-р биол. наук, зам. директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230X
Смирнов Валерий Валерьевич - д-р фарм. наук, зав. лаб. клинической фармакологии, ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: vv.smirnov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-8232-6682X
Кудлай Дмитрий Анатольевич - член-корр. РАН, д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. кафедры фармакологии Института Фармации ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет); Москва, Российская Федерация
E-mail: D624254@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; зaв. гаф. иммyнoлoгии MБФ PHИMУ им. И.И. Пиpoгoвa Mинздpaвa Pocct^ Mocraa, Poccийcкaя Фeдepaция E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640X
Liudmila I. Vishniakova - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: lyudmilochka94@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3555-3268X
Igor P. Shilovskiy - Dr.Sci., PhD, Deputy Director for Science and Innovation, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230X
Valeriy V. Smirnov - Dr.Sci., PhD, Head of the Clinical Pharmacology Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Assistant Professor of A.P. Arzamastsev Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair of I.M. Seche-nov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: vv.smirnov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-8232-6682X
Dmitry A. Kudlay - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Leader Researcher of Personalized Medicine and Molecular Immunology Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Prof. of Pharmacology Chair, Institute of Pharmacy, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University); Moscow, Russian Federation E-mail: D624254@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Prof., Director of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Head of Immunology Chair, MBF of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640X
