CC BY
90
Раздел - обзоры и лекции
Синхронизация клеточных культур (лекция)
Боженко В.К., 2Шрамова Е.И., хКулинич Т.М., Киселева Я.Ю.,1Шишкин А.М.
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России), Москва
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Контактная информация: Кулинич Татьяна Михайловна, ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России, Москва, ул. Профсоюзная, 86, sobral@mail.ru
Резюме
Большая часть медико-биологических исследований проводится на клетках in vitro (то есть, не на живом организме, а на клетках «в пробирке»). Клетки используют в качестве модельного биологического объекта в научных исследованиях, при выяснении механизмов дифференцировки и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической подвижности, злокачественной трансформации, при тестировании и производстве лекарственных препаратов. Термином «культура клеток» определяют гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях, в специальной питательной среде при контролируемых температуре, влажности и уровне углекислого газа. Клеточные культуры многочисленны, разнообразны, доступны, относительно просто культивируются. Для них легко контролировать внешние условия и воздействовать изолированными стимулами, а для анализа имеется богатый арсенал методов. Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления нужны
такие суспензии, в которых клетки делились бы одновременно (синхронно). Синхронизировать деление в какой-либо популяции клеток можно с помощью различных искусственных приемов. В статье представлен ряд методик, позволяющих добиться синхронизации клеток на разных стадиях клеточного цикла. Ключевые слова: клеточная культура, пролиферация, клеточный цикл, синхронизация клеточной культуры
Synchronization of cell cultures (lecture)
1Bojenko V.K., 2Shramova E.I., 1Kulinich T.M., 1Kiseleva Y. Y., 1Shishkin A.M.
1Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, 117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, 117997, Russian Federation, Moscow, GSP-7, Ulitsa Miklukho-Maklaya, 16/10
Summary
Most biomedical investigations arecarried out on cells in vitro. Cells are used as a biological model in scientific research, for elucidation of the mechanisms of cell differentiation and proliferation, adaptation, aging, biological mobility, malignant transformation in drug testing. The term "cell culture" defines a population of genetically homogeneous cells growing under constant conditions in a special nutrient medium under control of temperature, humidity and carbon dioxide level. Cell cultures are numerous, diverse, accessible, relatively easy to cultivate. It is easy to control external conditions and expose cell cultures to isolated stimuli; cell cultures may be analyzed with a rich panel of methods. To study metabolic processes
during cell cycle division, it is necessary to have cell suspensions dividing simultaneously. Synchronization of the fission of any cell population is possible by various artificial methods. The article presents a number of techniques that allow to achieve synchronization of cells at different stages of cell cycle.
Key words: cell culture, proliferation, cell cycle, synchronization of cell culture Сведения об авторах
Боженко Владимир Константинович - зав. отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, д.м.н., профессор Шрамова Елена Ивановна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии, Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН), к.б.н.
Кулинич Татьяна Михайловна - заведующая лабораторией иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н. Киселева Яна Юрьевна - научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.
Шишкин Александр Михайлович - старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н. Введение
В настоящее время культуры клеток широко используются в биологии и медицине. С их помощью решаются многие вопросы, имеющие как теоретическое, так и практическое значение. Культуры представляют собой великолепную модель in vitro для изучения влияния различных факторов (рН, температуры, аминокислот, витаминов, гормонов, лекарственных препаратов и т.д.) на рост и развитие клеток in vivo [3, 5]. При работе с культурами клеток исследуемые соединения могут быть введены в заданной концентрации и в определенный момент времени. Количество этих соединений
существенно меньше, чем при постановке экспериментов на животных. Клеточные культуры очень удобны при постановке широкомасштабных экспериментов, когда требуется большое количество объектов, находящихся в одинаковых, строго определенных условиях [1].
Однако условия in vitro принципиально отличаются от условий in vivo. Клеточная культура не отражает всех процессов, происходящих в целом организме, и может дать лишь приблизительное представление о реальном поведении клеток in vivo, и, поэтому, клеточные культуры используются только на предварительном этапе исследования [9].
Активно делящиеся in vitro клетки широко используются для изучения процессов пролиферации клетки. Они являются очень удобной моделью, так как предоставляют возможность для анализа изменений макроструктур клетки и для изучения изменений молекулярного профиля во время процессов прохождения клеточного цикла [4].
В процессе деления клетка проходит следующие фазы клеточного цикла: G1 - фаза подготовки к делению, S - синтетическая фаза, в ходе которой происходит репликация ДНК и синтез всех необходимых компонентов для деления клетки, G2 -фаза подготовки клетки к митозу, М - непосредственно процесс деления клетки, в результате которого образуются две клетки, находящиеся в G0 - фазе [10, 12].
Важную роль при выборе культуры клеток как модели для изучения пролиферации играет возможность синхронизовать культуру в определенной фазе клеточного цикла. В настоящее время известно большое количество эффективных методов, позволяющих синхронизовать или вызвать остановку пролиферации в определенной фазе клеточного цикла [10, 11]. Среди наиболее часто применяемых методов синхронизации клеток можно выделить методы обедненной среды и контактное торможение. Они позволяют добиться остановки пролиферации клеток на
стадии G0/G1 клеточного цикла [11]. Введение в культуральную среду различных компонентов позволяет вызвать задержку пролиферации на разных стадиях клеточного цикла [8]. Так, гидроксимочевина вызывает блокировку в Gl-фазе, добавление тимидина в культуральную среду позволяет останавливать пролиферацию клеток на разных стадиях, добавление нокадазола и лекарственного препарата таксола блокирует клетки в метафазе и Gl-фазе клеточного цикла соответственно.
Одной из новых методик синхронизации клеток является центрифугирование. Известно, что объем клетки зависит от того, в какой фазе цикла клетка находится. Если для культуры клеток точно известны объемы клеток для разных фаз клеточного цикла, то путем сепарации можно несинхронизованную клеточную культуру разделить на фракции, преимущественно содержащие клетки на стадиях G0/G1, S и G2/M клеточного цикла [6].
Методы синхронизации (Основная часть) Несинхронизованная клеточная культура
Обычно в несинхронизированой культуре наблюдается примерно одинаковое распределение клеток по фазам клеточного цикла, несколько больший процент в G0/G1 и/или S фазах, и несколько меньший в G2/M (Рисунок 1) [10].
G0/G1-29,8%
S-44,1%
G2/M-26,1%
0
200
400
600
800
100
Channels (FL3)
Рисунок 1. Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в несинхронизованной культуре. Гистограмма получена с помощью метода проточной цитофлуориметрии, окраска фиксированных образцов йодидом пропидия.
Однако не на всем протяжении пассажа в несинхронизованной культуре можно наблюдать такое распределение фаз клеточного цикла. Обычно после посадки клеткам требуется какое-то время для адаптации (синтез поверхностных рецепторов, адгезия на субстрат, распластывание и т.п.). В этот момент не происходит увеличения количества клеток, наблюдается лаг-фаза (Рисунок 2), активно пролиферирующие клетки в культуре практически отсутствуют. Затем клетки начинают пролиферировать, и, соответственно, происходит увеличение доли клеток в S и G2/M фазах. Когда количество клеток удваивается через равные промежутки времени, то культура находится на стадии экспоненциального роста. Обычно после короткой фазы экспоненциального роста тот или иной фактор (истощение среды, накопление метаболитов, образования монослоя) становится лимитирующим. Скорость роста культуры замедляется. Клетки перестают делиться, их количество достигает насыщения. Это самая продолжительная стационарная фаза роста. При восстановлении лимитирующего фактора (пересеве) клетки вновь начинают делиться. Если лимитирующий фактор не будет удален, то через некоторое время наступает гибель клеточной популяции.
Рисунок 2. Кривая роста культуры клеток. Примерная схема, отражающая зависимость количества клеток от времени культивирования. 1 - лаг-фаза; 2 - фаза экспоненциального роста; 3 - стационарная фаза; 4 - гибель клеток.
Синхронизация в 00/01-фазе
Фаза G0 или фаза покоя может продолжаться достаточно долго. Клетки «уходят» в нее пережидая неблагоприятные условия или после завершения деления, в таком случае, в активно делящихся клетках, фаза G0может быть и непродолжительной. Известно, что при недостатке питательных веществ (фетальной сыворотки), процессы клеточного деления приостанавливаются, и клетки тормозятся в фазе «покоя» - G0/G1. Клетки синхронизуют в G0/G1 путем их культивирования в среде, содержащей 0,1-0,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и, следовательно, лишённой в требуемом количестве ростовых факторов [7, 10].
Клетки культивируют при 37 ^ в атмосфере 5% CO2 при высокой влажности в течение 3 дней в среде RPMI-1640 или DMEM (в зависимости от типа клеток), содержащей 10% ЭТС. Далее клетки отмывают от сыворотки центрифугированием в
течение 2 мин при 1200 об./мин (для суспензионных культур) и переносят в среду, содержащую 0,5% ЭТС в концентрации 1*105 клеток на 1 мл среды. Для адгезивных клеточных культур (293, А549 и МСБ-7) среду для культивирования, содержащую 10% ЭТС, отбирают, не снимая клетки с подложки. Затем клетки отмывают 3-5 мл на флакон площадью 25 см фосфатно-солевым буфером (рН 7.4) и добавляют среду, содержащую 0,5% ЭТС. У клеток в условиях обедненной среды замедляются синтез ДНК и скорость деления, клетки переходят в фазу покоя 00.
На рисунке 3 изображены диаграммы, отражающие распределение клеток по фазам клеточного цикла для несинхронизованной клеточной линии и синхронизованной в 00/01-фазе клеточного цикла с помощью метода обедненной среды. Видно, что в синхронизированной культуре процент клеток в 00/01-фазе выше, чем в несинхронизованной, и составляет 61,65%, в то время как в несинхронизованной культуре - 29,8%. Количество клеток в Б и 02/М-фазах клеточного цикла в синхронизованной культуре ниже, чем в несинхронизованной, и составляет, соответственно, 26,24% и 12,11%. В несинхронизованной культуре в Б-фазе находится 44,1%, а в 02/М - 26,1% клеток.
С.
Рисунок 3. Синхронизация культуры клеток линии MCF-7 (рак молочной железы человека) в G0/G1-фазе клеточного цикла методом обедненной среды. А -несинхронизованные клетки линии MCF-7, Б - синхронизованные в G0/G1-фазе клетки линии MCF-7, С - диаграмма относительного распределения клеток по фазам клеточного цикла для синхронизованной и несинхронизованной культуры.
Снятие блока синхронизации или выход из синхронизации проводиться путем удаления из среды лимитирующего фактора. При использовании метода обедненной среды таким фактором служит отсутствие питательных веществ и замена среды на новую, содержащую 10% ЭТС, служит пусковым механизмом для выхода клеток из фазы G0. При снятии блока синхронизации происходит инициация роста культуры клеток, причем в течение первого цикла, или даже нескольких, сохраняется синхронность прохождения клетками фаз клеточного цикла.
Как уже говорилось, кроме естественных факторов синхронизации клеток в G0/G1-фазе клеточного цикла, существуют различные препараты, также блокирующие пролиферацию клеток на этой стадии. К таким веществам относится и гидроксимочевина, вызывающая остановку деления клеток на стадии G1 [8].
При синхронизации клеток с помощью гидроксимочевины клетки культивируют
при 37 ^ в атмосфере 5% CO2 при высокой влажности в течение 3-4 дней в среде
9
КРМ1-1640 или БМБМ (в зависимости от типа клеток), содержащей 10% ЭТС. Затем сначала проводят пресинхронизацию клеток в среде с пониженным содержанием сыворотки. Клетки суспензионных культур при этом отмывают от сыворотки центрифугированием в течение 2 мин при 1200 об./мин, ресуспендируют осадок и рассевают в концентрации 1*105 клеток на 1 мл среды в среде, содержащей 0,5% ЭТС. У адгезивных культур (293, А549 и МСБ-7) среду, содержащую 10% ЭТС, отбирают, не снимая клетки с подложки, затем промывают клетки 3-5 мл фосфатно-солевого буфера (рН 7.4) (на флакон площадью 25 см ) и добавляют среду, содержащую 0,5% ЭТС. Клетки инкубируют в обедненной среде 24 часа, после чего культуральную среду заменяют средой, содержащей 10% ЭТС, и добавляют гидроксимочевину в концентрации 1-2 тМ на 12 часов. Оптимальную концентрацию гидроксимочевины подбирают для каждой клеточной линии, но обычно она варьируется в пределах 1 -2 тМ. Из рисунка 4 видно, что использование гидроксимочевины приводит к остановке пролиферации клеток в 00/01-фазе клеточного цикла.
00/01-71,97%
8-19,27%
02/М-8,76%
^ I 1
400 600
ОИаппе|Б (р|_3)
80 70 60 50 40 30 20 10 0
/ 7197
//29,8
/ 1
30/31
■ несинхронизиро ванная
□ синхронизирова
32/М
А.
Б
I
100
0
Рисунок 4. Синхронизация клеток МСБ-7 в 00/01-фазе клеточного цикла с помощью гидроксимочевины. А - синхронизированная в 00/01-фазе клетки линии МСБ-7, Б -
диаграмма относительного распределения клеток по фазам для синхронизированной и несинхронизированной культуры.
Снятие блока синхронизации проводят путем замены среды на полную ростовую среду, содержащую 10% ЭТС. При успешно проведенной синхронизации после снятия блока можно наблюдать последовательные переходы клеточных фаз (рисунок 5), время прохождения полного клеточного цикла и каждой фазы индивидуально для различных культур клеток и обычно варьирует в пределах от 18 до 40 часов. На рисунке 5 представлены примеры гистограмм распределения клеток культуры линии НЕК293 (эмбриональная почка) по фазам клеточного цикла после снятия блока синхронизации гидроксимочевиной. Показано, что происходит быстрое нарастание клеток в S-фазе и снижение количества клеток в G0/G1-фазе, увеличение G2/M-фазы происходит более медленно и только через 8 часов после снятия блока синхронизации наступает переход клеток в G2/M-фазу. Наибольший уровень G2/M наблюдался через 10 часов, а затем наступало обратное смещение фаз: снижение S и G2/M, и увеличение G0/G1.
А. 0 часов.
: в0Ю1 - 45.7%
а> " -О -£ S - 43.6%
^ _ ,1 1 G2/M - 10.7%
] . |..,.г , .......
200 400 600 800 1
СИаппе!в (Р1-3)
Б. 2 часа
Рисунок 5. Изменение соотношения клеток НЕК293 в фазах клеточного цикла после снятия блока синхронизации гидроксимочевины, приведены примеры гистограмм анализа фаз клеточного цикла через каждые два часа после снятия блока. Синхронизация в 8-фазе, тимидиновый блок
Тимидин вызывает ингибирование репликации ДНК и задержку клеток в S-фазе. Клетки, находящиеся в момент начала инкубации в среде с высоким содержанием тимидина в митозе, в G2 или в G1 аккумулируются в ранней S-фазе, а клетки, бывшие на этот момент в S-фазе, задерживаются в ней. Тимидиновый блок инициируется заменой ростовой среды средой, содержащей 2 тМ тимидина. При этом клетки инкубируют в течение 12-16 часов в нормальных условиях культивирования в среде,
содержащей 10% ЭТС. Это время подбирают непосредственно для каждой клеточной линии. Затем клетки промывают 2 раза не содержащей ЭТС средой и помещают в ростовую среду с 24 мкМ дезоксицитидина. Через 9 часов инициируют тимидиновый блок добавлением к клеткам 2 mM тимидина. Через 12-16 часов повторяют процедуру замены среды, содержащей тимидин, средой, содержащей только 24 мкМ дезоксицитидина. На рисунке 6 показано распределение клеток в разных фазах клеточного цикла при использовании метода тимидинового блока. Видно, что в синхронизированной культуре большая часть клеток находиться в S-фазе.
Рисунок 6. Синхронизация культуры клеток эмбриональной почки человека линии НЕК293 в S-фазе методом двойного тимидинового блока. А - синхронизированные в S-фазе клетки линии 293, Б - диаграмма относительного распределения клеток по фазам клеточного цикла для синхронизированной и несинхронизированной культуры клеток.
Также синхронизацию в S-фазе индуцирует Афидиколин (aphidicolin) -ингибитор ДНК полимеразы, который применяется в концентрациях 1-10 мкг/мл, обладает относительно низкой токсичностью для клеток и хорошо отмывается.
Оптимальная концентрация Афидиколина может отличаться для разных клеточных культур и обычно подбирается экспериментально. Например, для клеток человеческой меланомы для ингибирования синтеза ДНК до уровня ниже 20 % необходимо использовать концентрацию Афидиколина 10 мкг/мл [2]. Лекарственный препарат Этопозид (etoposide - VP16), ингибитор ДНК-топоизомеразы 2, вызывает задержку клеток в S- фазе клеточного цикла и блок на границе G2/M. Для синхронизации культивируемых in vitro клеток он применяется в концентрациях от 0,7 до 10цМ. Этопозид вызывает специфическую инактивацию киназной активности, связанной с циклином А (CDK2), что приводит к активации S-фазного и G2/M «check-point» (точка рестрикции) контроля, вызывает остановку пролиферации на уровне перехода S- G2/M. Однако при длительной инкубации обработка клеток Этопозидом вызывает апоптоз, также часто отмечается неспособность клеток вернуться к пролиферации после снятии блока синхронизации. Синхронизация в G2/M
G2/M-фаза клеточного цикла является относительной короткой, и интересна она тем, что клетки в ней являются наиболее чувствительны к воздействию различных повреждающих агентов - УФ лучей, ионизирующего излучения, лекарственных препаратов и т.п. Для остановки пролиферации клеток в G2/M-фазе используется, например, такой препарат как Таксол (Паклитаксел). При синхронизации клеток с помощью Таксола клетки культивируют при 37 °C в атмосфере 5% CO2 при высокой влажности в течение 3-4 дней в среде RPMI-1640 или DMEM (в зависимости от типа клеток), содержащей 10% ЭТС. Далее заменяют среду для культивирования средой, содержащей 100 нМоль Таксола и 10% ЭТС, и инкубируют в течение 24 часов. Оптимальные концентрации Таксола подбирают для каждой клеточной линии. На рисунке 7 приведен пример типичной гистограммы культуры клеток MCF-7 (рак молочной железы человека) при синхронизации с помощью Таксола. Добиться
увеличения G2/M-фазы более 60% с тем условием, чтобы после снятия блока синхронизации, клетки вступили в процесс деления, часто представляет определенные трудности.
00/01-12,49%
8-31,83%
02/М-55,68%
"*1—■'■*11"]' г
600
ОИаппе^ (П_Э)
О
60 50 40
2 30
I-
о
® 20
° 10
□несинхронизированная □синхронизированная
А.
Б.
55,68
0
100
0
Рисунок 7. Синхронизация клеток MCF-7 с помощью Таксола в G2/M-фазе клеточного цикла. А - синхронизированные в G2/М-фазе клетки линии MCF-7, Б - диаграмма относительного распределения клеток по фазам клеточного цикла для синхронизированной и несинхронизированной культуры клеток.
Для синхронизации клеток в М-фазе возможно также использование таких химических соединений, как нокодазол (nocodazole) или кольцемид (colcemid), которые взаимодействуют с тубулинами и ингибируют образование (полимеризацию) микротрубочек, что приводит к остановке клеток в прометафазе. Для синхронизации обычно используется добавление нокодазола в среду в концентрации 40-100 нг/мл и дальнейшая инкубация в течение 12-18 часов [12]. Следует, однако, иметь в виду, что более длительная инкубация обычно ведет к клеточной смерти через апоптоз. Заключение
В настоящее время, существуют различные способы синхронизации клеток на всех стадиях клеточного цикла. Эти методы отличаются по эффективности синхронизации в зависимости от типа клеток, разные клеточные линии могут по-разному реагировать на определенные воздействия. При этом подбор метода должен учитывать характеристики культуры и цели исследования. Некоторые варианты синхронизации клеток являются обратимыми (синхронизация обедненной средой, тимидиновый блок), и позволяют после снятия блока получить несколько генераций клеток, синхронизовано вступающих в клеточный цикл. В других случаях, например, при синхронизации таксолом, очень трудно добиться выхода из блока.
Возможность синхронизации клеточных линий широко используется в экспериментальной биологии и медицине. На синхронизованных культурах клеток изучают механизмы клеточного цикла, исследуется влияние различных препаратов на определенные фазы клеточного цикла. Методы синхронизации клеток позволяют оптимизировать полученные результаты.
Список литературы
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М. Мир. 1983. 263 с.
2. Алиева И.Б., Киреев И.И., Курчашова С.Ю., Узбеков Р.Э. Методы клеточной биологии, используемые в цитогенетике. Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу «Цитогенетика». МОСКВА. Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова Факультет биоинженерии и биоинформатики. 2010.
3. Гудвин Б. Аналитическая физиология клеток и развивающихся организмов. М. Мир. 1979. 287 с.
4. Холпер Дж., Макферсон Ян. и др. Методы вирусологии и молекулярной биологии. М. Мир. 1972. 444 с.
5. Davis P.K., Ho A., Dowdy S.F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Bitechniques. 2001. V. 30. No. 6. P. 1322-1331.
6. Fu H., Gao H., Qi X., et al. Aldolase A promotes proliferation and G1/S transition via the EGFR/MAPK pathway in non-small cell lung cancer. Cancer Commun (Lond). 2018. V. 38. No. 1. P. 18. doi.org/10.1186/s40880-018-0290-3.
7. Guo L, Jiang L, Lu X.L., Liu CM ANAPHASE PROMOTING COMPLEX/CYCLOSOME - mediated cyclin B1 degradation is critical for cell cycle synchronization in syncytial endosperms. J Integr Plant Biol. 2018. V. 60. No. 6. P. 448-454. doi: 10.1111/jipb.12641.
8. Lui J.L., YE Y., Qian Z., et al. Functional Interactions between Herpesvirus Oncoprotein MEQ and Cell Cycle Regulator CDK2. J Virol. 1999. V. 73. No. 5. P. 4208-4219.
9. Kitzmann M., Carnac G., Vandromme M., et al. The Muscle Regulatory Factors MyoD and Myf-5 Undergo Distinct Cell Cycle-specific Expression in Muscle Cells. J Cell Biol. 1998. V. 142. No. 6. P. 1447-1459.
10. Merrill G.F. Cell synchronization. Methods in Cell Biology. 1998. No. 57. P. 229-249.
11. Pardee A.B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science. 1989. V. 246. P. 603-608.
12. Samake S. and Smith L. C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced in vitro: effects of aphidicolin. Theriogenology. 1997. V. 48. No. 6. P. 969976.
