Научная статья на тему 'Серотипнезависимая протективная активность экспериментальных белоксодержащих препаратов Streptococcus pneumoniae, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов'

Серотипнезависимая протективная активность экспериментальных белоксодержащих препаратов Streptococcus pneumoniae, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

  • … еще 3
CC BY
81
19
Читать
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE / СЕРОТИПНЕЗАВИСИМАЯ ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ / ВИРУЛЕНТНОСТЬ / ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИЙ ПРЕПАРАТ / SEROTYPE-INDEPENDENT PROTECTIVE ACTIVITY / VIRULENCE / EXPERIMENTAL PROTEIN-CONTAINING PREPARATION

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Кукина О. М., Грубер И. М., Ахматова Н. К., Курбатова Е. А., Жигунова О. В.

Актуальность. Вакцины на основе капсульных полисахаридов пневмококка не активны в отношении серотипов, не входящих в состав вакцины, бескапсульных штаммов и не защищают от носительства, вызванного другими серотипами. Их применение приводит к замещению доминирующих серотипов пневмококка, появлению высоковирулентных штаммов, изменению микробного пейзажа слизистых оболочек за счет появления других этиологически значимых возбудителей заболеваний респираторного тракта. Это требует создания внутривидового противопневмококкового иммунитета, чему будет способствовать разработка серотипнезависимых препаратов, в состав которых будут входить белоксодержащие антигены пневмококка.Цель работы. Исследование серотипнезависимой протективной активности белоксодержащих антигенных компонентов, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов S. pneumoniae.Материалы и методы. Использованы штаммы трёх серотипов S. pneumoniae: музейных серотипов 6В № 296, 19F № 298 и 10А № 297 и свежевыделенных (из ликвора больных гнойным менингитом) серотипов 6В № 1121, 19F № 1055 и серогруппы 10 № 1193. В полученных экспериментальных белоксодержащих препаратах (ЭБСП) определяли содержание белка. Протективную активность ЭБСП и вирулентность штаммов определяли при внутрибрюшинных иммунизации и заражения мышей линии BALB/c; LD50 рассчитывали по общепринятой модифицированной формуле Кербера. Иммунофенотип лимфоцитов, предварительно выделенных из цельной крови доноров, изучали с помощью метода проточной цитометрии. Статистический анализ материалов проведен с применением параметрических и непараметрических методов с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows», ver. 7.0 (Stat Soft, Inc); при статистическом анализе уровень значимости р принимался равным < 0,05.Результаты и обсуждение. При культивировании происходило интенсивное накопление биомассы музейного штамма № 296 при низкой его вирулентности и более низкое вирулентного штамма № 1121, выделенного из ликвора больного. По содержанию белка препараты из штаммов серотипа 6В не различались. Штаммы других серотипов, выделенные при генерализованном инфекционном процессе, были более вирулентны, чем музейные. Влияние на иммунофенотип лимфоцитов человека фракций 50-100 kDa, выделенных из исходных препаратов, полученных при культивировании штаммов серотипа 6В значимо возрастало только под действием препарата из музейного штамма. При исследовании протективной активности исходных препаратов из штаммов серотипа 6В и фракций с ММ 50-100 kDa только при трёхкратной иммунизации исходным препаратом из штамма № 296, в дозе 20 мкг белка на мышь, выявлена существенно большая выживаемость иммунизированных мышей, от заражения свежевыделенным вирулентным штаммом № 1121 гомологичного серотипа. Фракция 30-100 kDa обеспечила защиту мышей, двукратно иммунизированных 50 мкг белка на мышь, с высоким индексом эффективности, равным 8,9, даже после заражения свежевыделенным штаммом гетерологичного серотипа S. pneumoniae серотипа 3 № 10196.Выводы. Белоксодержащая фракция с ММ 30-100 кДа, полученная из слабовирулентного музейного штамма S. pneumoniae серотипа 6В № 296, при двукратной иммунизации обладала протективной активностью в отношении свежевыделенного вирулентного штамма гетерологичного серотипа. Под действием изученных белоксодержащих фракций показана активация клеточного звена иммунной системы с вовлечением врожденных эффекторов и Т-лимфоцитов. Эти данные можно считать обоснованием дальнейшего изучения ЭБСП для оценки возможности их использования при конструировании противопневмококкового препарата с серотипнезависимой протективной активностью.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Кукина О. М., Грубер И. М., Ахматова Н. К., Курбатова Е. А., Жигунова О. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
Предварительный просмотр
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Experimental Protein-Containing Preparations Streptococcus pneumoniae, Obtained from Fresh Isolated Strains and Museum

Relevance. Vaccines based on capsular polysaccharides of pneumococci are not active against serotypes that are not included in the vaccine, non-capsulated strains and do not protect against carriage caused by other serotypes. Their use leads to the replacement of dominant serotypes of pneumococci, the appearance of highly virulent strains, changes in the microbial landscape of mucous membranes due to the appearance of other etiologically significant pathogens of respiratory tract diseases. This requires the creation of intraspecific anti-pneumococcal immunity, which will be facilitated by the development of serotype-dependent drugs, which will include protein-containing antigens of pneumococci.Objective. Study of serotype-independent activity of protein-containing antigenic components obtained from freshly isolated and archival strains of S. pneumoniae.Materials and methods. Strains of three serotypes of S. pneumoniae were used: archival strains of serotypes 6B N296, 19F N 298 and 10A N297 and freshly isolated serotypes 6B N 1121, 19F N 1055 and serogroup 10 N 1193 (from the cerebrospinal fluid of patients with purulent meningitis).. In the experimental protein-containing preparations EPCP obtained, the protein content was determined. Protective activity of EPCP and virulence of strains were determined in the model of intraperitoneal immunization and infection of BALB/c mice; LD50 was calculated using the generally accepted modified Kerber formula. The immunophenotype of lymphocytes previously isolated from donor-mice whole blood was studied by flow cytometry. Statistical analysis of the materials was carried out using parametric and nonparametric methods using the application package «Statistica for Windows», ver. 7.0 (Stat Soft, Inc); in statistical analysis, the significance level of p was assumed to be < 0.05.Results and discussion. During cultivation there was the analysis of growth dynamics showed intensive accumulation of biomass of the archival strain N296 with low virulence, and lower by virulent strain N 1121 isolated from the patient's cerebrospinal fluid. The protein content of drugs from serotype 6B strains did not differ. The strains of other serotypes isolated during the generalized infectious process were also more virulent than the archival strain. The effect on the immunophenotype of human lymphocytes of fractions of 50-100 kDa isolated from the initial preparations obtained by culturing serotype 6B, significantly increased only under the influence of the preparation from the archival strain. In the study of protective activity of the initial preparations from strains of serotype 6B and fractions with MM 50-100 kDa only triple immunization with the initial preparation from strain N 296, at a dose of 20 micrograms of protein per mouse, led to significantly greater survival of immunized mice from infection with the newly isolated virulent strain N 1121 of homologous serotype. A fraction of 30-100 kDa provided protection of mice twice immunized with 50 mkg of protein per mouse, with a high efficacy index of 8.9, even after infection with a freshly isolated strain of heterologous S. pneumoniae serotype 3 N 10196.Conclusion. The protein-containing fraction with MM 30-100 kDa obtained from a low virulent archival strain of S. pneumoniae serotype 6B N296 possessed protective activity against a newly isolated virulent strain of heterologous serotype after double immunization. Under the action of the studied protein-containing fractions, activation of the cellular component of immune system with the involvement of innate immunity effectors and T-lymphocytes is shown. These data can be considered as a evidence for further study of EPCP to assess the possibility of their use in the design of anti-pneumococcal drug with serotype-independent protective activity.

Текст научной работы на тему «Серотипнезависимая протективная активность экспериментальных белоксодержащих препаратов Streptococcus pneumoniae, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов»

Original Articles

https://doi.org/10.31631/2073-3046-2020-19-1-35-42

Серотипнезависимая протективная активность экспериментальных белоксодержащих препаратов Streptococcus pneumoniae, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов

О. М. Кукина*1, И. М. Грубер1, Н. К. Ахматова1, Е. А. Курбатова1, О. В. Жигунова1, Н. Е. Ястребова1, И. С. Королёва2, Г. В. Белошицкий2

1 ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова», Москва

2 ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва

Резюме

Актуальность. Вакцины на основе капсульных полисахаридов пневмококка не активны в отношении серотипов, не входящих в состав вакцины, бескапсульных штаммов и не защищают от носительства, вызванного другими серотипами. Их применение приводит к замещению доминирующих серотипов пневмококка, появлению высоковирулентных штаммов, изменению микробного пейзажа слизистых оболочек за счет появления других этиологически значимых возбудителей заболеваний респираторного тракта. Это требует создания внутривидового противопневмококкового иммунитета, чему будет способствовать разработка серотипнезависимых препаратов, в состав которых будут входить белоксодержащие антигены пневмококка. Цель работы. Исследование серотипнезависимой протективной активности белоксодержащих антигенных компонентов, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов S. pneumoniae. Материалы и методы. Использованы штаммы трёх серотипов S. pneumoniae: музейных - серотипов 6В № 296, 19F № 298 и 10А № 297 и свежевыделенных (из ликвора больных гнойным менингитом) - серотипов 6В № 1121, 19F № 1055 и серогруппы 10 № 1193. В полученных экспериментальных белоксодержащих препаратах (ЭБСП) определяли содержание белка. Протективную активность ЭБСП и вирулентность штаммов определяли при внутрибрюшинных иммунизации и заражения мышей линии BALB/c; LD50 рассчитывали по общепринятой модифицированной формуле Кербера. Иммунофенотип лимфоцитов, предварительно выделенных из цельной крови доноров, изучали с помощью метода проточной цитометрии. Статистический анализ материалов проведен с применением параметрических и непараметрических методов с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows», ver. 7.0 (Stat Soft, Inc); при статистическом анализе уровень значимости р принимался равным < 0,05. Результаты и обсуждение. При культивировании происходило интенсивное накопление биомассы музейного штамма № 296 при низкой его вирулентности и более низкое вирулентного штамма № 1121, выделенного из ликвора больного. По содержанию белка препараты из штаммов серотипа 6В не различались. Штаммы других серотипов, выделенные при генерализованном инфекционном процессе, были более вирулентны, чем музейные. Влияние на иммунофенотип лимфоцитов человека фракций 50-100 kDa, выделенных из исходных препаратов, полученных при культивировании штаммов серотипа 6В значимо возрастало только под действием препарата из музейного штамма. При исследовании протективной активности исходных препаратов из штаммов серотипа 6В и фракций с ММ 50-100 kDa только при трёхкратной иммунизации исходным препаратом из штамма № 296, в дозе 20 мкг белка на мышь, выявлена существенно большая выживаемость иммунизированных мышей, от заражения свежевыделенным вирулентным штаммом № 1121 гомологичного серотипа. Фракция 30-100 kDa обеспечила защиту мышей, двукратно иммунизированных 50 мкг белка на мышь, с высоким индексом эффективности, равным 8,9, даже после заражения свежевыделенным штаммом гетерологичного серотипа S. pneumoniae - серотипа 3 № 10196. Выводы. Белоксодержащая фракция с ММ 30-100 кДа, полученная из слабовирулентного музейного штамма S. pneumoniae серотипа 6В № 296, при двукратной иммунизации обладала протективной активностью в отношении свежевыделенного вирулентного штамма гетерологичного серотипа. Под действием изученных белоксодержащих фракций показана активация клеточного звена иммунной системы с вовлечением врожденных эффекторов и Т-лимфоцитов. Эти данные можно считать обоснованием дальнейшего изучения ЭБСП для оценки возможности их использования при конструировании противопнев-мококкового препарата с серотипнезависимой протективной активностью.

Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae, серотипнезависимая протективная активность, вирулентность, экспериментальный белоксодержащий препарат Конфликт интересов не заявлен.

* Для переписки: Кукина Ольга Максимовна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова/+7 (495)-916-20-47, kukina1994@mail.ru, ©Кукина О. М. и др.

Original Articles

Для цитирования: Кукина О. М., Грубер И. М., Ахматова Н. К. и др. Серотипнезависимая протективная активность экспериментальных белоксодержащих препаратов Streptococcus pneumoniae, полученных из свежевыделенных и музейных штаммов. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2020; 19 (1): 35-42. https://doi: 10.31631/2073-3046-2020-19-1-35-42.

Experimental Protein-Containing Preparations Streptococcus pneumoniae, Obtained from Fresh Isolated Strains and Museum

OM Kukina**1, IM Gruber1, NK Akhmatova1, EA Kurbatova1, OVZhigunova1, NE Yastrebova1, IS Koroleva2, GVBeloshitsky2

1 Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russian Federation

2 Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russian Federation Absract

Relevance. Vaccines based on capsular polysaccharides of pneumococci are not active against serotypes that are not included in the vaccine, non-capsulated strains and do not protect against carriage caused by other serotypes. Their use leads to the replacement of dominant serotypes of pneumococci, the appearance of highly virulent strains, changes in the microbial landscape of mucous membranes due to the appearance of other etiologically significant pathogens of respiratory tract diseases. This requires the creation of intraspecific anti-pneumococcal immunity, which will be facilitated by the development of serotype-dependent drugs, which will include protein-containing antigens of pneumococci. Objective. Study of serotype-independent activity of protein-containing antigenic components obtained from freshly isolated and archival strains of S. pneumoniae. Materials and methods. Strains of three serotypes of S. pneumoniae were used: archival strains of serotypes 6B N296, 19F N 298 and 10A N297 and freshly isolated serotypes 6B N 1121, 19F N 1055 and serogroup 10 N 1193 (from the cerebrospinal fluid of patients with purulent meningitis).. In the experimental protein-containing preparations EPCP obtained, the protein content was determined. Protective activity of EPCP and virulence of strains were determined in the model of intraperitoneal immunization and infection of BALB/c mice; LD50 was calculated using the generally accepted modified Kerber formula. The immunophenotype of lymphocytes previously isolated from donor-mice whole blood was studied by flow cytometry. Statistical analysis of the materials was carried out using parametric and nonparametric methods using the application package «Statistica for Windows», ver. 7.0 (Stat Soft, Inc); in statistical analysis, the significance level of p was assumed to be < 0.05. Results and discussion. During cultivation there was the analysis of growth dynamics showed intensive accumulation of biomass of the archival strain N296 with low virulence, and lower - by virulent strain N 1121 isolated from the patient's cerebrospinal fluid. The protein content of drugs from serotype 6B strains did not differ. The strains of other serotypes isolated during the generalized infectious process were also more virulent than the archival strain. The effect on the immunophenotype of human lymphocytes of fractions of 50-100 kDa isolated from the initial preparations obtained by culturing serotype 6B, significantly increased only under the influence of the preparation from the archival strain. In the study of protective activity of the initial preparations from strains of serotype 6B and fractions with MM 50-100 kDa only triple immunization with the initial preparation from strain N 296, at a dose of 20 micrograms of protein per mouse, led to significantly greater survival of immunized mice from infection with the newly isolated virulent strain N 1121 of homologous serotype. A fraction of 30-100 kDa provided protection of mice twice immunized with 50 mkg of protein per mouse, with a high efficacy index of 8.9, even after infection with a freshly isolated strain of heterologous S. pneumoniae serotype 3 N 10196. Conclusion. The protein-containing fraction with MM 30-100 kDa obtained from a low virulent archival strain of S. pneumoniae serotype 6B N296 possessed protective activity against a newly isolated virulent strain of heterologous serotype after double immunization. Under the action of the studied protein-containing fractions, activation of the cellular component of immune system with the involvement of innate immunity effectors and T-lymphocytes is shown. These data can be considered as a evidence for further study of EPCP to assess the possibility of their use in the design of anti-pneumococcal drug with serotype-independent protective activity.

Key words: Streptococcus pneumoniae, serotype-independent protective activity, virulence, experimental protein-containing preparation

No conflict of interest to declare.

For citation: Experimental Protein-Containing Preparations Streptococcus pneumoniae, Obtained from Fresh Isolated Strains and Museum Kukina OM, Gruber IM, Akhmatova NK et al. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2020; 19 (1): 35-42 (In Russ.). https:// doi: 10.31631/2073-3046-2020-19-1-35-42.

Введение синусит, пневмония без бактериемии), так и тя-

Во всем мире S. pneumoniae является возбуди- жёлых инвазивных (сепсис, менингит, пневмо-

телем одних из самых распространенных инфекци- ния, сопровождающаяся плевритом) способных

онных заболеваний, протекающих часто как в виде привести к летальному исходу, особенно у детей

неинвазивных процессов (отит, конъюнктивит, до 5 лет и людей старше 65 лет. Для профилактики

For correspondence:, junior researcher of the Laboratory of experimental microbiology of Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera. +7 (495)-916-20-47, kukina1994@mail.ru. ©Kukina OM et al.

Original Articles

пневмококковых инфекционных заболеваний применяют полисахаридные и конъюгированные пневмококковые вакцины, вызывающие выработку антител к капсульным полисахаридам актуальных серотипов пневмококка, входящих в состав импортных вакцин, без учета циркуляции клинически значимых серотипов пневмококка на территории РФ. Внедрение в практику пневмококковых конъ-югированных вакцин (ПКВ), охватывающих от 7 до 13 серотипов пневмококков, ожидаемо вывело из циркуляции бактерии вакцинных серотипов [1,2]. Резко снизилось число инвазивных форм пневмококковой инфекции, которые были ассоциированы преимущественно с этими серотипами. В то же время, ПКВ оказали выраженное влияние на структуру пневмококковой популяции, в которой появились невакцинные серотипы и выросла доля ранее редких генетических линий и клонов (серо-тип 19А и его клон ST320, отличающийся множественной устойчивостью к антибиотикам) [3].

На фоне проведения массовой вакцинации, отмечается замещение доминирующих сероти-пов пневмококка, появление высоковирулентных штаммов, изменение микробного пейзажа слизистых оболочек за счет появления других этиологически значимых возбудителей заболеваний респираторного тракта [4-7]. Внедрение в 2014 г. в России в практику вакцинации пневмококковых конъюгированных вакцин (ПКВ) требует постоянного мониторирования циркулирующих серотипов, поскольку значимое изменение серотипового состава под давлением ПКВ на популяционном уровне можно ожидать не ранее, чем через 5 лет после начала ее применения при условии высокого охвата вакцинацией [8].

Вакцины на основе капсульного полисахарида не активны в отношении серотипов, не входящих в состав вакцины, бескапсульных штаммов и не защищают от носительства, вызванного другими серотипами пневмококка, которых насчитывается более 90. Всё это вызывает необходимость разработки серотипнезависимых, основанных на белках, и цельноклеточных вакцин [9,10].

Таким образом, одним из актуальных направлений совершенствования пневмококковых вакцин является использование белков пневмококка с внутривидовой перекрестной протективной активностью в качестве серотипнезависимых вакцин и новых белков-носителей. Известно, что ни один отдельный белок не может создать эффективную перекрестную защиту от всех серотипов пневмококка, необходимо использовать комплекс белков для создания внутривидового противопневмокок-кового иммунитета [11,12]. Несколько белоксо-держащих вакцин находятся на разных стадиях клинических испытаний [10], однако коммерческих препаратов на мировом фармацевтическом рынке не зарегистрировано.

В проведенных ранее исследованиях было показано, что белоксодержащие антигены штаммов

серотипов 6В, 10А и 19F индуцировали наибольший перекрестный протективный эффект [13], в связи с чем в настоящей работе использованы эти штаммы, а как основной объект исследования выбран штамм серотипа 6В.

Цель работы - изучить серотипнезависимую протективную активность белоксодержащих антигенных компонентов, полученных из свежевыде-ленных и музейных штаммов S. pneumoniae.

Материалы и методы

Исследования проведены на модели штаммов S. pneumoniae трёх музейных, депонированных в 2016 г серотипов: 6В № 296, 19F № 298 и 10А № 297, и на свежевыделенных штаммах сероти-пов 6В № 1121, 19F № 1055 и серогруппы 10 № 1193, выделенных из ликвора больных гнойным менингитом (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Периодическое культивирование штаммов проводили в полусинтетической среде [14] в стационарных условиях при 5% СО2 в течение 5-7ч (до конца фазы экспоненциального роста). В качестве посевной использовали 24-часовую бактериальную культуру, выросшую на кровяном агаре. Ростовые свойства штаммов оценивали по динамике накопления биомассы на основании расчета продуктивности процесса по среднему увеличению количества микробных клеток (м.к.) в час Йх, м.к./ч), максимальной удельной скорости роста (mmax, ч-1) и числу прошедших генераций (n) [15].

После центрифугирования микробную массу инактивировали и высушивали диметилкетоном, проводили водную экстракцию и лиофилизацию (исходный препарат); с помощью фильтров Amikon получали фракции с ММ 30-50, 50-100 и 30-100 kDa. В полученных экспериментальных белоксодержащих препаратах (ЭБСП) определяли содержание белка [16].

Протективную активность ЭБСП и вирулентность штаммов определяли при внутрибрюшинных (в/бр) иммунизации и заражении мышей линии BALB/c (320 самцов, 12-14 г), полученных из питомника филиал Андреевка ГУ НЦБМТ. Протективную активность изучали в опытах активной защиты мышей при заражении иммунизированных мышей (опытная группа) и интактных неиммунизированных мышей (контрольная группа), свежевыделенными штаммами S. pneumoniae серотипов 6В № 1121 и 3 № 10196 (выделенного в НЦЗД РАМН). Все эксперименты на животных проводили в соответствии с межгосударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными (ГОСТ 33217-2014). LD50 рассчитывали по общепринятой модифицированной формуле Кербера; использован t-критерий Стьюдента и непараметрический критерий согласия Пирсона - х2 [17]. В динамике выживаемость мышей рассчитывали по методу Гланса С. А. [18].

Для изучения иммунофенотипа лимфоцитов предварительно были выделены мононуклеарные

Original Articles

Таблица.1. Параметры роста и вирулентность штаммов S. pneumoniaе серотипа 6В разного происхождения Table 1. Growth parameters and virulence of S. pneumoniae serotype 6B strains of different origin

Штамм Strain Параметры роста Growth parameters м.к. microbial cell

Длительность фаз роста, ч Duration of growth phases, h M max, ч.-1 / через ч. от начала выращивания M max, h-1 / through h. from the beginning of cultivation qx, м.к.|ч microbial cell|h n

№ Происхождение Origin Лаг-ф Lag-phase Лог-ф Log-phase

296 Музейный Archivai 0-2,0 4,0-4,5 1,92 ± 0,27/2-3 0,97 7,48 ± 3,06 > 109

1121 Свежевыделенный Freshiy isoiated 3,5-4,0 3,5-4,0 1,36 ± 0,05/6 0,41 5,35 ± 1,07 4,36*105

лейкоциты из цельной крови доноров в градиенте плотности фиколл-урографина и далее 10 млн клеток/мл в ростовой среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотика (стрептомицин) инкубировали с 15 мкл ЭБСП (5 мкг белка) в течение 72 часов. Иммунофенотип лимфоцитов изучали с помощью метода проточной цитометрии на приборе FC-500 (Beckman Coulter, США) с использованием FITC- и PE-меченых моноклональных антител (мАТ) к CD45/CD3, CD45/CD3/CD4, CD45/CD3/ CD8, CD16/56, CD3/CD16/56, CD45/CD19, CD8/ HLA-DR (eBioscience, США).

Статистический анализ материалов был проведен с применением параметрических и непараметрических методов с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows», ver. 7.0 (Stat Soft, Inc). Средние выборочные значения количественных признаков приведены в виде Ме (Q1,25;Q2,75), где Ме — медиана, Q1 - нижний квартиль, Q2 - верхний квартиль; использованы непараметрические методы - критерий Крускал-Уоллиса, U-критерий Манна-Уитни. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости р принимался равным < 0,05.

Результаты и обсуждение

При культивировании на кровяном агаре изучаемые штаммы S. pneumoniae серотипа 6В были представлены колониями разного типа, в зависимости от происхождения: музейный штамм № 296 представлен очень мелкими круглыми прозрачными колониями с ровными краями; колонии штамма № 1121, выделенного от больного генерализованной формой (гнойный менингит), в виде плоских прозрачных колоний с валиком по краю, приподнятым центром и неровной поверхностью; у этого штамма отмечена наиболее выраженная капсула.

Анализ динамики роста исследуемых штаммов на основании изученных параметров роста позволил выявить интенсивное накопление биомассы при культивировании музейного штамма № 296: короткая лаг-фаза; высокая максимальная удельная скорость роста; высокая продуктивность процесса накопления биомассы при низкой вирулентности штамма (табл. 1). В тоже время, штамм № 1121, выделенный из ликвора больного (гнойный менингит) был вирулентным, но характеризовался более низкими показателями роста.

При сравнительном изучении вирулентности штаммов S. pneumoniae других серотипов разного

Таблица.2. Содержание белка в экспериментальныхбелоксодержащихпрепаратах (ЭБСП)* Table 2. Protein content in experimental protein-containing preparations (EPCP)*

Название ЭБСП Name of EPCP Содержание белка в ЭБСП из штаммов Containing of protein in EPCP from strains

№ 296 № 1121

Исходный препарат Initial drug 209 ± 33 мкг/мг с.в** mkg/mL d.w. 219 ± 35 мкг/мг с.в mkg/mL d.w.

Фракция 50-100 kDa Fraction 50-100 kDa 348 ± 21 мкг/мл mkg/mL 329 ± 45 мкг/мл mkg/mL

Фракция 30-50 kDa Fraction 30-50 kDa 299 ± 73 мкг/мл mkg/mL 281 ± 0,7 мкг/мл mkg/mL

Примечание:*средние данные по 3 экспериментам; **с.в. - сухой вес. Note:*average data for 3 experiments;**d.w. - dry weight.

Original Articles

Рисунок 1. Влияние ЭБСП S. pneumoniae (из штаммов № 296 и №1121, фракция 50-100 kDa) на иммунофенотип лимфоцитов периферической крови у доноров in vitro

Figure 1. Influence of S. pneumoniae e EPCP (from strains N 296 and N 1121, fraction 50-100 kDa) on immunophenotype of peripheral blood lymphocytes in donors in vitro

Примечание: Данные представлены индивидуальными значениями содержания CD-экспрессирующих клеток и Me [Q1-Q2]. Kruskal-Wallis ANOVA & Median test.

Note: The data are presented by individual values of CD-expressing cells and Me [Q1-Q2]. Kruskal-Wallis ANOVA & Median test.

Original Articles

Таблица 3. Протективная активность белоксодержащих препаратов, полученных из штаммов различного происхождения, при заражении мышей свежевыделенным штаммом гомологичного серотипа Table 3. Protective activity of protein-containing preparations obtained from strains of different origin during infection of mice with freshly isolated strain of homologous serotype

Штамм S. pneumoniaе серотипа 6В для получения иммуногена S. pneumoniae strain of serotype 6B for obtaining the immunogen Белоксодержа-щий препарат для иммунизации Protein-containing preparation for immunization Кратность иммунизации The multiplicity of immunization

Двукратная Double Трехкратная Triple

Выжило/всего Alive/total P Выжило/всего Alive/total P/Z

Музейный, № 296 Archival Исходный initial 6/10 > 0,05 4/7* < 0,05/2,92

50-100kDa 2/10 > 0,05 3/7** > 0,05/2,04

Свежевыделенный, №1121 Freshly isolated Исходный initial 4/10 > 0,05 3/7** > 0,05/2,04

50-100kDa 1/10 > 0,05 2/7** > 0,05/1,76

Контроль заражающей дозы штамма №1121 Control of the infecting dose of the strain 106 1/5 2/3 -

107 2/5 2/5

108 3/8 0/5 -

LD50, м.к. microbial cells 3 х 106 3,7 х 106 -

Примечание: Достоверность различий между опытом и контролем (для заражающей дозы 108 м.к); * Z=2,92, р< 0,05 при критическом значении > 2,23 (при 12 мышах в опыте). **Z = 2,04 и 1,76, р> 0,05, при критическом значении > 2,23 (при 12 мышах в опыте). Note: significance of differences between experience and control (for an infecting dose of 108 microbial cells); * Z=2,92, р< 0,0 5, at critical value > 2,23 (with 20 mice in the experiment) **Z = 2,04and 1,76, р > 0,05,at critical value (with 12 mice in the experiment).

происхождения установлено, что музейные штаммы серотипов 10А и 19^ отобранные ранее, поскольку индуцировали наибольший перекрестный протективный эффект [13], обладали низкой вирулентностью >109 м.к), в то время как штаммы, выделенные из ликвора больных при генерализованном инфекционном процессе (гнойный менингит), были более вирулентны ^50 2,29*107 и 3,16*108 соответственно). Учитывая наибольшую вирулентность штамма № 1121 серотипа 6В из приведенных свежевыделенных штаммов, дальнейшие исследования были направлены на изучение экспериментальных белоксодержащих препаратов, выделенных из штаммов серотипа 6В различной вирулентности.

При изучении экспериментальных белоксодержащих препаратов - исходных и выделенных из них фракций 30-50 и 50-100 кДа определено, что по содержанию белка препараты из изучаемых штаммов серотипа 6В № 296 и № 1121 не различаются (табл. 2).

Исследование влияния на иммунофенотип лимфоцитов человека фракций 50-100 кДа, выделенных из исходных препаратов, полученных при культивировании штаммов № 296 и № 1121, показало, что после 72-х часовой инкубации в присутствии фракций выявлено изменение численности клеток по сравнению с контролем (без препаратов) (рис. 1). Достоверно повышалась численность

Т-клеток (CD45+/CD3+), p < 0,001, а так же количество Т-хелперов (CD45+/CD3+/CD4+) и NK- клеток (CD16+/56+), p < 0,0003 и p < 0,05 соответственно. Уровень NKT-клеток (CD3+/CD16/56+) значимо возрастал только под влиянием препарата из штамма № 296 (p < 0,037).Таким образом, изученные препараты S. pneumoniae индуцировали изменение численности иммунных клеток в культуре клеток, что свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета с вовлечением врожденных эффекторов и Т-лимфоцитов.

При исследовании протективной активности исходных препаратов из штаммов серотипа 6В и фракций с ММ 50-100 kDa мышей по двукратной и трехкратной схеме иммунизировали в/ бр дозой 20 мкг белка/мышь (в объёме 0,5мл) с 14-дневным интервалом. Заражение проводили через 14 суток после последней иммунизации вирулентным штаммом гомологичного серотипа 6В № 1121 в дозе 108м.к. (в 0,5мл), составляющей 33 и 27 LD50(LD50 3 х 106-3,7 х 106 м.к.) (табл. 3). Установлено, что двукратная иммунизация не защищала от заражения мышей, иммунизированных указанной дозой. После трехкратной иммунизации выявлена существенно большая выживаемость мышей, иммунизированных исходным препаратом только из маловирулентного музейного штамма № 296 по сравнению с группой контроля (р < 0,05) и отмечена тенденция к защите фракцией с ММ

Original Articles

Таблица 4. Протективная активность фракции 30-100 kDa при заражении мышей свежевыделенным штаммом гетерологичного серотипа

Table 4. Protective activity of 30-100 kDa fraction in mice infected with freshly isolated strain of heterologous serotype

Иммуноген Immumogen Заражающая доза штамма S. pneumoniae серотипа 3 № 10196, м.к. Infecting dose of S. pneumoniae strain serotype 3 N10196, microbial cells Выжило/всего, сут Alive/total, days LD50 M K. Microbial cells ИЭ EI -Effi-cacy index

2 3 4 7 8

Фракция 30-100 kDa штамма S. pneumoniae серотипа 6В №296 Fraction 30-100 kDa of S. pneumoniae strain serotype 6B N296 103 8/10 4/10 4/10 4/10 4/10 5012* ** 8,9

104 6/10 6/10 6/10 6/10 6/10

105 4/5 1/5 1/5 1/5 1/5

Контроль Control 103 8/8 2/8 2/8 2/8 2/8 562 -

104 5/10 0/10 0/10 0/10 0/10

105 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Примечание: Достоверность различий между опытом и контролем для заражающей дозы 104 м.к.: *при сравнении кривых выживаемости по С.А. Гланцу по критерию значимости Z = 2,28, р<0,05 при критическом значении > 2,086 (при 20 мышах в опыте); **по критерию согласиях2= 5,95, р<0,02; ***по критерию Стьюдента tp = 2,98, p<0,01. Note: Significance of differences between experiment and control for the infecting dose 104 microbial cells: *when comparing survival curves by

S. A. Glantz criterion by significance Z = 2,28,p<0.05, at a critical value > 2,086 (with 20 mice in the experiment),; **according to the criterion of consent x2 = 5.95, p<0.02; ***according to Student's criterion tp = 2,98, p<0,01.

50-100 kDa. В тоже время препараты из свеже- Выводы выделенного штамма не защищали от заражения 1. большой дозой (33-27 LD50) этого вирулентного штамма.

В связи с тем, что было показано отсутствие выраженного протективного эффекта фракции 50-100 kDa, в последующих исследованиях использовали фракцию 30-100 кДа, полученную из штамма № 296 и большую иммунизирующую 2. дозу. Изучение протективной активности фракции 30-100 kDa, выделенной из исходного препарата, полученного при культивировании музейного штамма S. pneumoniae 6В № 296, показало защиту мышей, двукратно иммунизированных 50 мкг 3. белка на мышь, после заражения даже штаммом свежевыделенного гетерологичного серотипа -S. pneumoniae серотипа 3 № 10196 (табл. 4). При этом достоверность разницы между опытом и контролем - р < 0,05, а индекс эффективности (ИЭ), то есть отношение LD в опыте к LD в контроле,

Ь0 Ь0 1

составил 8,9.

Белоксодержащая фракция с ММ 30-100 kDa, полученная из слабовирулентного музейного штамма S. pneumoniae серотипа 6 В № 296, при двукратной иммунизации обладала протективной активностью в отношении свежевыде-ленного вирулентного штамма гетерологичного серотипа.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Показана активация клеточного звена иммунитета с вовлечением врожденных эффекторов и Т-лимфоцитов под действием бе-локсодержащих фракций, полученных из штаммов S. pneumoniae.

Приведенные данные являются обоснованием дальнейших исследований по выявлению спектра внутривидовой протективной активности изучаемых экспериментальных препаратов для оценки возможности их использования при конструировании противопневмококкового препарата с серотипнезависимой протективной активностью.

Литература

Richter SS, Diekemo DJ, Heilmann KP et al. Changes in pneumococcal serotypes and antimicrobial resistance after introduction of the 13-valent conjugate vaccine in the United States. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2014; 58:6484-6489. DOI: 10.1128/AAC.03344-14

Weinberger DM, Malley R, Lipsitch М. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 2011; 378:1962-1973. DOI: 10.1016/S0140-6736(10)62225-8 Маянский Н. А, Савинова Т. А., Алябьева О. А. и др. Антибиотикорезистентность и клональная эволюция Streptococcus pneumoniae серотипа 19 А в России, 2003-2013 гг. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. //2017. Т. 19, № 2. С. 145 -151. Feldman C, Anderson R. Review: current and new generation pneumococcal vaccines // Journal of Infection. 2014; 69 (4): 309-325._

Poland GA. The prevention of pneumococcal disease by vaccines: promises and challenges. // Infectious Disease Clinics of North America. 2001. Vol. 15. P. 97-122. Hicks LA, Harison LH, Flannery B et al. Incidence of pneumococcal disease due to non-pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) serotypes in the United States during the era of widespread PCV7 vaccination. 1998-2004. // The Journal of Infectious Diseases. 2007. Vol. 196. Р. 1346-1354.

Pelton SI, Huot H, Finkelstein JA et al. Emergence of 19A as virulent and multidrug resistant pneumococcus in Massachusetts following universal immunization of infants with pneumococcal conjugate vaccine. // The Pediatric Infectious Disease Journal. 2007. Vol. 26. N 6. Р. 468-472.

Pilishvili T, Bennett NM. Pneumococcal disease prevention among adults: strategies for the use of pneumococcal vaccines. // The American Journal of Preventive Medicine. 2015. Vol. 49, N 4. P. 383-390.

Original Articles

9. Pichichero ME, Khan MN, Xu Q. Next generation protein based Streptococcus pneumoniae vaccines. // Human Vaccines & Immunotherapeutics. 2016. Vol. 12. N1. Р. 194-205.

10. Pichichero ME. Pneumococcal whole-cell and protein -based vaccines: Changing the paradigm. Expert Review of Vaccines. 2017; Vol. 16. N12. Р. 1181-1190.

11. Darrieux M., Goulart C., Briles D., Leite LC. Current status and perspectives on protein-based pneumococcal vaccines. Critical Reviews in Microbiology. 2015. Vol. 41. N. 2. Р. 190-200.

12. Principi N, Esposito S. Development of pneumococcal vaccines over the last 10 years. Expert Opinion on Biological Therapy. 2018. Vol. 18. N1. Р. 7-17.

13. Курбатова Е.А., Воробьёв Д.С., Егорова Н.Б. и др. Штаммовые различия внутривидовой иммуногенной активности антигенных компонентов Streptococcus pneumaniae. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. № 5. С. 60-69.

14. Грищенко Н.В., Токарская М.М, Калина Н.Г. и др. Влияние состава питательной среды на продукцию капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 19А. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012. №2. С. 12-17.

15. Перт С.Дж,. ред. Работнова И.Л. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.:Мир; 1978.

16. Lowry OH., Rosebrough NJ., Farr AL., Randall RJ. Protein measurement with Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 1951. Vol. 193. N1. Р. 265-275.

17. Юнкеров В.И., Григорьев С. Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб. 2001.266 с.

18. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М.: Издательство «Практика»; 1999.

References

1. Richter SS, Diekema DJ, Heilmann KP et al. Changes in pneumococcal serotypes and antimicrobial resistance after introduction of the 13-valent conjugate vaccine in the United States. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2014; 58:6484-9. DOI: 10.1128/AAC.03344-14

2. Weinberger DM, Malley R, Lipsitch M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 2011; 378 (9807):1962-73. DOI: 10.1016/S0140-6736(10)62225-8

3. Mayansky NA., Savinova TA., Alyabyeva NM. et al. Antimicrobal resistence and clonal evolution of Streptococcus pneumoniae serotype 19A in Russia during 2002-2013. Clinical Miccrobiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2017; 19 (2): 145-51 (In Russ.).

4. Feldman C, Anderson R. Review: current and new generation pneumococcal vaccines. Journal of Infection. 2014; 69 (4): 309-25. DOI: 10.1016/j.jinf.2014. 06.006.

5. Poland GA. The prevention of pneumococcal disease by vaccines: promises and challenges. Infectious Disease Clinics of North America. 2001; 15:97-122. DOI: 10.1016/ s0891-5520 (05)70270-1.

6. Hicks LA, Harison LH, Flannery B et al. Incidence of pneumococcal disease due to non-pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) serotypes in the United States during the era of widespread PCV7 vaccination. 1998-2004. The Journal of Infectious Diseases. 2007; 196:1346-54. DOI: 10.1086/521626

7. Pelton SI., Huot H, Finkelstein JA. et al. Emergence of 19A as virulent and multidrug resistant pneumococcus in Massachusetts following universal immunization of infants with pneumococcal conjugate vaccine. The Pediatric Infectious Disease Journal. 2007; 26 (6):468-72. DOI: 10.1097/inf.0b013e31803df9ca

8. Pilishvili T, Bennett NM. Pneumococcal disease prevention among adults: strategies for the use of pneumococcal vaccines. The American Journal of Preventive Medicine. 2015; 49(4):383-90. DOI: 10.1016/j.vaccine.2015.05.102

9. Pichichero ME, Khan MN, Xu Q. Next generation protein based Streptococcus pneumoniae vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 2016; 12 (1): 194-205. DOI: 10.1080/21645515.2015.1052198.

10. Pichichero ME. Pneumococcal whole-cell and protein -based vaccines: Changing the paradigm. Expert Review of Vaccines. 2017; 6 (12): 1181-90. DOI: 10.1080/14760584.2017.1393335.

11. Darrieux M, Goulart C, Briles D, Leite LC. Current status and perspectives on protein-based pneumococcal vaccines. Critical Reviews in Microbiology 2015; 41(2):190-200. DOI: 10.3109/1040841X.2013.813902.

12. Principi N, Esposito S. Development of pneumococcal vaccines over the last 10 years. Expert Opinion on Biological Therapy. 2018; 18 (1): 7-17. DOI: 10.1080/14712598.2018.1384462.

13. Kurbatova EA, Vorobiev DS, Egorova NB et al. Strain difference of intra-species immunogenic activity of Streptococcus pneumoniae antigen components. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. Moscow. 2013; 5: 60-9 (In Russ.).

14. Grischenko NV, Tokarskaya MM, Kalina NG, et al. Influence of nutrient medium composition on the production of capsule polysaccharide by Streptococcus pneumonia 19A serotype. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. Moscow. 2012; 2:12-7 (In Russ.).

15. Pirt SJ. Principles of microbe and cell cultivation / S.J. Pirt // Ed. Professor I.L. Rabotnova. Moscow: Mir. 1978 (In Russ.).

16. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry.1951, 193 (1): 265-275.

17. Yunkerov VI, Grigoriev SG. Mathematical and statistical processing of medical research data. Saint Petersburg. 2001:266 (In Russ.).

18. Glantz SA. Primer of biostatistics. 4th ed. Moscow: Praktika; 1999 (In Russ.).

Об авторах

About the Authors

• Ольга Максимовна Кукина - младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова. +7 (495)-916-20-47, kukina1994@mail.ru, Ь«рз://о^. огд/0000-0003-0875-4141

• Ирина Мироновна Грубер - д. м. н., профессор, заведующая лабораторией экспериментальной микробиологии НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова. +7 (495)-916-20-47, igruber_instmech@mail.ru.

• Нэлли Кимовна Ахматова - д. м. н, заведующая лабораторией механизмов регуляции иммунитета НИИ вакцин и сывороток им И. И. Мечникова. +7 (919)-7765570, anelly@mail.ru.

• Екатерина Алексеевна Курбатова - д. м. н., профессор,заведующая лабораторией терапевтических вакцин НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова. +7(495)-917-57-74, kurbatova6162@yandex.ru.

• Ольга Валерьевна Жигунова - младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, +7(495)-916-20-47, kileva@mail.ru.

• Наталия Евгеньевна Ястребова - д. м. н., профессор, заведующая лабораторией иммунохимической диагностики НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, +7 (495)-917-07-41, yastreb03@rambler.ru.

• Ирина Станиславовна Королева - д. м. н., заведующая лабораторией эпидемиологии менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов ЦНИИ эпидемиологии. +7 (495)-672-11-28, irina-korol@yandex.ru.

• Григорий Владимирович Белошицкий - старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов ЦНИИ эпидемиологии, +7 (495)-672-11-28, g-belosh1@yandex.ru.

Поступила: 17.12.2019. Принята к печати: 05.02.2020.

Контент доступен под лицензией СС БУ 4.0.

• Olga M. Kukina - junior researcher of the laboratory of experimental microbiology, Mechnikov of Research Institute of Vaccines and Sera. +7 (495)-916-20-47, kukina1994@mail.ru, https://orcid.org/ 0000-0003-0875-4141.

• Irina M. Gruber - Dr. Sci (Med), professor, head of the laboratory of experimental microbiology of Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera. +7 (495)-916-20-47, igruber_instmech@mail.ru.

• Nelli K. Akhmatova - Dr. Sci (Med), head of the laboratory of immunity regulation mechanisms, Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, +7 (919)-7765570, anelly@mail.ru.

• Ekaterina A. Kurbatova - Dr. Sci (Med), professor, head of the laboratory of therapeutic vaccines, Mechnikov of Research Institute of Vaccines and Sera, +7 (495) -917-57-74, kurbatova6162@yandex.ru.

• Olga V. Zhigunova - junior researcher of the laboratory of experimental microbiology, Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, +7 (495)-916-20-47, kileva@mail.ru.

• Natalia E. Yastrebova - Dr. Sci (Med), professor, head of the laboratory of immunochemical diagnostics, Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, +7 (495) -917-07-4, e-mail: yastreb03@rambler.ru.

• Irina S. Koroleva - Dr. Sci (Med), head of the laboratory of epidemiology of meningococcal infection and purulent bacterial meningitis, Central Research Institute of Epidemiology, Russian Federation, 8 (495) -672-11-28; e-mail: irina-korol@yandex.ru.

• Grigory V. Beloshitsky - senior researcher of the laboratory of epidemiology of meningococcal infection and purulent bacterial meningitis, Central Research Institute of Epidemiology, Russian Federation, +7 (495) -672-11-28, g-belosh1@yandex.ru.

Received: 17.12.2019. Accepted: 05.02.2020.

Creative Commons Attribution CC BY 4.0.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.