CC BY
70
Роль транскрипционного фактора Ikaros |
в нормальном гемопоэзе и лейкозогенезе: ^
биологические и клинические аспекты s
О. С. Вшивкова, А. Н. Мелешко ^
ГУ«Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» ЗС
Минздрава Республики Беларусь; Беларусь, 223053, Минский район, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, 43 ^
Контакты: Ольга Сергеевна Вшивкова [email protected] >25
Изучение патогенеза, факторов прогрессии и развития рецидивов, причин лекарственной резистентности острых лейкозов (ОЛ) ^ остается главной задачей онкогематологии и смежных областей. В патогенезе ОЛ достоверно известна роль более 50 генов и бел- ЕЕ ков, в числе которых хорошо изученные опухолевые супрессоры (CDKN2A/CDKN2B, RB1, PTEN, p53) и классические химерные ^ онкогены (BCR/ABL1, TEL/AML1, E2A/PBX, транслокации с участием MLL). Помимо этого установлена высокая частота ЭС аберраций в генах, ответственных за лимфоидную дифференцировку, таких как транскрипционные факторы (PAX5, IKZF1 ^ и EBF1), гены регуляции транскрипции (ETV6, ERG), сигнальных путей и антигенных рецепторов (BTLA, CD200, TOX, BLNK, о VPREB1), а также гены, участвующие в развитии химиорезистентности лейкозов (NR3C1). Согласно результатам исследований 5 последних 5лет, частым молекулярным событием при лейкозах являются аберрации гена IKZF1 (Ikaros), белковый продукт ко- т^ торого относится к ДНК-связывающим белкам семейства К-uppel наряду с другими членами семейства IKZF2 (Helios), IKZF3 Ж (Aiolos), Eos и Pegasus. JÍ
В гемопоэтических клетках Ikaros функционирует как транскрипционный фактор, является ключевым белком, контролирующим jj ранние этапы дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, натуральных киллеров и дендритных клеток. На ранних стадиях гемопоэза ^ регуляторная роль Ikaros как транскрипционного фактора сводится к репрессии генов миелоидной и эритроидной линий диффе-ренцировки и стимуляции генов, ответственных за лимфоидную дифференцировку.
Ikaros выступает в роли модулятора иммунного ответа и является опухолевым супрессором для лимфоидных опухолей. Данные многочисленных клинических исследований подтверждают связь между наличием аберраций IKZF1 и развитием В-клеточных и, в меньшей степени, Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов. Вместе с тем в публикациях последних лет нарушения функций Ikaros связывают с развитием миелопролиферативных заболеваний и острого миелоидного лейкоза у детей. В контексте клинической значимости особая роль отводится внутригенным делециям IKZF1, а также коротким (нефункциональным) изоформам белка Ikaros, которые могут появляться в результате внутригенных делеций или аберрантного сплайсинга. Продемонстрировано, что перечисленные нарушения гена IKZF1 и его белкового продукта играют ключевую роль в лимфоидной трансформации, опухолевой прогрессии и, возможно, в развитии химиорезистентности лейкозных клеток, что может отражаться в некорректной стратификации по группам риска, плохом результате лечения и низких показателях выживаемости. В данном обзоре описаны частота и типы нарушений гена IKZF1 и его белкового продукта Ikaros, целесообразность включения этих маркеров в диагностические панели всех типов лейкозов и учета при определении минимальной остаточной болезни. Несмотря на то, что Ikaros уже находит применение в клинической практике, с развитием интереса к этому молекулярному маркеру появляется ряд открытых вопросов. С точки зрения молекулярной биологии недостаточно исследованы механизмы регуляции экспрессии IKZF1 на этапах транскрипции и сплайсинга.
Предстоит определить клиническую роль точечных и субклональных делеций IKZF1, более точно выяснить прогностическое значение внутригенных делеций и аберрантного сплайсинга для разных групп пациентов с ОЛ и другими гемобластозами в связи с известными генетическими маркерами и схемой проводимой химиотерапии. Более детального изучения аберрации Ikaros требуют в качестве прогностического фактора развития костномозгового рецидива. Следует также решить вопрос о возможности учета статуса Ikaros при стратификации пациентов по группам риска, а также при определении уровня минимальной остаточной болезни.
Ключевые слова: Ikaros, IKZF1, альтернативный сплайсинг, гемобластозы, делеции, изоформы, лейкозогенез, опухолевый супрес-сор, острый лимфобластный лейкоз, прогностический маркер, транскрипционный фактор
DOI: 10.17650/2313-805X.2015.2.1.013—026
The role of Ikaros transcriptional factor in normal hematopoiesis and leukemogenesis: biological and clinical aspects
V. S. Vshivkova, A. N. Meleshko
Republican Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology, Ministry of Health of Belarus; 43 Frunzenskaya St., v. Borovlyany, Minsk region, 223053, Belarus
Investigation of the pathogenesis and factors effecting recurrence, progression and drug resistance in acute leukemia (AL) remains a major challenge for hematology and other related areas. The role of more than 50 genes and proteins in the AL pathogenesis has been shown, including the well-studied tumor suppressor (CDKN2A/CDKN2B, RB1, PTEN, p53), and classical fusion genes (BCR/ABL1, TEL/AML1,
in сч
Ж
E2A/PBX, MLL translocations). In addition, high frequency of aberrations in genes responsible for lymphoid differentiation have been identified such as transcription factors (PAX5, IKZF1 and EBF1), transcriptional regulation of the genes (ETV6, ERG), and signaling pathways of antigen receptors (BTLA, CD200, TOX, BLNK, VPREB1), as well as genes involved in chemoresistance of leukemia cells (NR3C1). In recent studies, Ikaros abnormalities have been reported to be frequently associated with AL. Ikaros is a member of a Kruppel-like family of zinc finger transcription factors that also includes IKZF2 (Helios), IKZF3 (Aiolos), Eos and Pegasus, and encoded by the IKZF1 gene. In hematopoietic cells Ikaros functions as a transcription factor, a key protein controlling T-, B-, NK-, and dendritic cells early differentiation. At the early hematopoiesis stages, it represses the myeloid and erythroid lineages, and stimulates the lymphoid differentiation. Ikaros also normally modulates immune response and plays role of a tumor suppressor in lymphoid malignances.
Data from numerous clinical studies confirmed an association between the presence of IKZF1 aberrations and B-cell and, to a lesser extent, T-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) development.
Besides, loss of Ikaros function was associated with progression of myeloproliferative diseases to acute myeloid leukemia (AML) in children. From clinical point of view, particular intragenic IKZF1 deletions and a short (non-functional) protein Ikaros isoforms, which may occur as a result of intragenic deletions or aberrant splicing, are the most significant features.
These mutations of IKZF1 gene and Ikaros aberrant expression play a key role in the lymphoid transformation, tumor progression, and may cause development of leukemic cells chemoresistance. Therefore, IKZF1 aberrations should be taken into account as a valuable prognostic marker for risk groups stratification, poor outcome and low survival rare.
This review compiles currently available data regarding the frequency and variants of the IKZF1 (Ikaros) aberrations, and the use of them in diagnostics of all types of leukemia and minimal residual disease detection.
Although Ikaros has already applied in clinical studies, a growing number of questions still remain unanswered. Molecular biology ofIKZF1 expression and splicing regulation is not well understood. Clinical value of point mutations and subclonal deletion in IKZF1 locus should be elucidated. Prognostic significance of intragenic deletions and aberrant splicing is necessary to clarify for different groups of ALL patients, in connection with other genetic markers and therapy protocol. More detailed clinical analysis required for proving IKZF1 impact on probability of relapse, improving patients' risk stratification and application of minimal residual disease.
i— Key words: Ikaros, IKZF1, alternative splicing, hemoblastoses, deletions, isoforms, leukemogenesis, tumor suppressor, acute lymphoblastic O leukemia, prognostic marker, transcription factor
Ген IKZF1. Структура и функции доменов «цинковых пальцев»
Ген IKZF1 (IKAROS family zinc finger 1; Ikaros; Lyf-1) общей протяженностью 120 тыс. пар оснований расположен на хромосоме 7p12.2, состоит из 8 экзонов, 7 из которых являются белок-кодирующими. Длина полноразмерного транскрипта IKZF1 насчитывает 6189 пар оснований, протяженность открытой рамки считывания (последовательность нуклеотидов, кодирующая белок) полноразмерной изоформы составляет 1560 пар оснований, при этом длина белкового продукта Ikaros - 519 аминокислотных остатков [1].
Ikaros — представитель отдельного семейства белков транскрипционных факторов (ТФ), отличительной особенностью которых является наличие ДНК-связывающих доменов, так называемых цинковых пальцев (Zn-fingers, ZnFs). «Цинковый палец» — это структурный домен, образованный полипептидной петлей, стабилизированной ионом цинка, который связан координационными связями с аминокислотными остатками двух молекул — цистеина и гистидина, что определяет отнесение этого домена к классу C2H2 [2].
Полноразмерная изоформа белка Ikaros содержит два отдельных кластера с «цинковыми пальцами»: 4 ZnFs на N-конце белковой молекулы (F1—4), необходимые для связывания с ДНК, а также 2 ZnFs на С-конце (F5, F6), обеспечивающие димеризацию Ikaros и его взаимодействие с другими белками (рис. 1). Отдельно можно выделить регион активации/репрессии, расположенный между кластерами «цинковых пальцев». В регионе активации локализована большая часть сайтов фосфорилирования для эпигенетическо-
го контроля работы белка - его «включения» или «выключения» на различных этапах клеточного цикла [2].
Функциональная активность Ikaros напрямую зависит от его способности связываться с ДНК при помощи четырех N-концевых «цинковых пальцев». Для стабильного связывания с ДНК белки семейства «цинковых пальцев» должны обладать как минимум 2 тан-демными ZnFs. Потеря 2 и более «цинковых пальцев» в результате альтернативного сплайсинга, внутриген-ных или хромосомных делеций приводит к появлению коротких изоформ белка с низкой аффинностью или полной инертностью к ДНК. Такие короткие изоформы оказывают доминантно-негативный (DN) эффект, нарушая способность длинных изоформ Ikaros и других членов белкового семейства, таких как Aiolos и Helios, к связыванию с ДНК (рис. 2в). В экспериментах in vivo подтвержден факт наличия разных генных мишеней для каждого из ZnFs Ikaros [2, 3]. Благодаря наличию «цинковых пальцев» на С-конце белковые молекулы Ikaros способны формировать гомо- или ге-теродимеры. Гомодимеризация происходит за счет взаимодействия аналогичных изоформ белка (рис. 2а). Партнерами для гетеродимеризации могут служить как различные изоформы Ikaros, так и другие члены этого семейства (Helios, Aiolos и др.), несущие белок-связывающие «цинковые пальцы» (рис. 2б, г). Существует предположение, что гетеродимеры, состоящие из разных изоформ белка, обладают различными функциями [3]. Тем не менее основная задача димери-зации - контроль работы белкового комплекса при регуляции транскрипции и организации структуры хроматина.
Белок-кодирующие экзоны
0 1 2
5 6
N-конец
..........
F1 F2 F3 F4
мим т ш
С-конец
F5
F6
ДНК"связывающие Регион Белок-связывающие
домены активации домены
и репрессии
Рис. 1. Доменная структура полноразмерного белкового продукта IKZF1. ДНК-связывающие цинковые пальцы F1—4 отмечены красным, белок-связывающие мотивы F5, F6 — зеленым
in сч
FS FS
F6 F6
ГЦ
Fl
F2
F3
V \
F4
Fl
F2
i,
ДНК
FS F5
F6 \р Ll_
1 г
Г2 F3
ж
ш
CJ
/
Fl F2 F3 F4
FS FS
F6 F6
ДНК
FS FS
F6 F6
Fl
F2
Helios/Aiolos
\
FUF2 F3 F4
ДНК
3
4
7
б
а
в
г
Рис. 2. Способы димеризации Ikaros: а - образование гомодимера между двумя молекулами Ik1; б — гетеродимеризация двух длинных изоформ белка; в — гетеродимеризация Ik1 и короткой изоформы (DN) Ikaros — комплекс не способен к связыванию ДНК и выполнению своих функций по причине отсутствия ДНК-связывающих доменов; г — образование гетеродимера между Ik1 и другим белком этого семейства (Helios, Aiolos и др.). Адаптировано из [3]
Альтернативный сплайсинг
Семь белок-кодирующих экзонов IKZF1 транскрибируются по меньшей мере в 13 различных транскрип-тов посредством альтернативного сплайсинга (рис. 3). В результате образуются изоформы белка, отличающиеся между собой размерами и функциональной активностью.
Известные в настоящее время изоформы имеют идентичные белок-связывающие С-концевые домены, но различаются составом ДНК-связывающих ZnFs на N-конце. Изоформы белка Ikaros, в которых отсутствует 2 и более ДНК-связывающих «цинковых пальца», называются короткими: они не способны к взаи-
модействию с ДНК и, соответственно, выполнению своей основной функции [4]. Полноценно функционирующие, т. е. длинные изоформы Ikaros (1, 2, 2a, 3, 3a), содержат 3 или все 4 ZnFs в ДНК-связывающем домене. Длинные изоформы характеризуются внутриядерной локализацией в клетке и обладают высокой аффинностью к определенному промотору ДНК, функционируют как ТФ и участвуют в организации структуры хроматина. Мутационный анализ показал, что наличие функциональных ZnF2 и ZnF3 критично для высокоаффинного связывания мотива TGGGAAT в регуляторных участках контролируемых генов. Два соседних домена ZnF1 и ZnF4 моделируют это связы-
in сч
Белок-кодирующие экзоны
0 1 2
Ж ш
u
Геномные экзоны
1
2
3
4
5
6
7
8
Рис. 3. Продукты альтернативного сплайсинга Ikaros (изоформы), описанные в настоящее время. Адаптировано из [12]. Кодирующие экзоны схематично представлены в виде светло-серых прямоугольников, красные и зеленые прямоугольники символизируют домены типа «цинковых пальцев». ДНК-связывающие «цинковые пальцыi» кодируются 3-5-м экзонами (красные), 7-й экзон кодирует два дополнительных «цинковых пальца» для белковых взаимодействий (зеленые). Длинные (1, 2, 2a, 3, 3a) и короткие изоформы Ikaros (4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9) выделены блоками
3
4
5
6
7
вание. N-концевые домены (ZnF5, ZnF6) определяют ядерную локализацию Ikaros [3, 4].
Короткие изоформы Ikaros (4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9) обладают DN-эффектом: они не только не способны к связыванию с ДНК, но и препятствуют функционированию длинных изоформ, а также других белков семейства Ikaros (см. рис. 2в); локализованы в цитоплазме. Наиболее распространенным вариантом коротких изоформ белка является Ik6 (80 % от всех DN-форм Ikaros). Транскрипционный вариант Ik10 описан как нетранслируемый транскрипт матричной РНК. В нем отсутствует большая часть кодирующего региона, включая 2-й геномный экзон, в котором находится старт-кодон [2, 5].
Разнообразие изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, усложняется дополнительными вариациями на уровне «редактирования» РНК. Так, в нормальных гемопоэтических клетках
человека, а также линиях лейкозных клеток K. J. Payne et al. (2001) обнаружили инсерцию 60 пар оснований между 1-м и 2-м экзонами, характерную для транскрипционных вариантов Ik1, Ik2, Ik4, Ik7, Ik8, а также делецию 30 пар оснований для транскрипционных вариантов Ik1, Ik2. Авторы сообщают о необходимости дальнейших исследований для установления значения этих вариаций [5]. Был идентифицирован новый сплайс-вариант — Ik3a (другие используемые обозначения IkH, Ikx, Ik1+), идентичный Ik3, за исключением транскрибируемого экзона 6. Кроме того, в Ik3a обнаружена инсерция 60 пар оснований между экзо-нами 2 и 3, которая предположительно является добавочным экзоном. Таким образом, Ik3a является самой длинной из известных изоформ Ikaros у человека, за исключением полноразмерного транскрипта Ik1. Результаты иммуноблот-анализа продемонстрировали, что преобладающим в нормальных гемопоэтических
клетках является Ik3a, в то время как для опухолевого клона более характерна экспрессия Ik1, что может свидетельствовать о значительной роли Ik3a в контроле нормального гемопоэза у человека [5]. Однако, согласно нашим результатам, как в нормальных гемопоэти-ческих, так и в лейкозных клетках наиболее высокий уровень экспрессии имеют изформы Ik2 и Ik3/3a, каждая из которых превосходит Ik1 по уровню экспрессии в 1,5—2 раза [6].
L. Jhanjun et al. (2011) провели оценку функциональных различий двух наиболее длинных изоформ у человека - Ik1 и Ik3a. Исследование впервые позволило предположить, что Ik1 и Ik3a, а возможно и другие изоформы, могут иметь свои уникальные или даже противоположные функции в клетке, локализуясь при этом в различных субклеточных регионах [3].
Функционирование Ikaros как транскрипционного фактора
Основная функция белков семейства Ikaros — диф-ференцировка лимфоцитов, их созревание и модуляция иммунного ответа. Функционируя как ТФ, белок Ikaros связывается с определенными последовательностями в регуляторных районах генов и осуществляет избирательный контроль экспрессии генов-мишеней. Кроме того, Ikaros задействован в организации структуры хроматина, поскольку способен переводить ДНК в конденсированное состояние (гетерохроматин) и удерживать ее в такой форме. При этом Ikaros работает в составе белковых комплексов, контролирующих химические модификации гистонов и, следовательно, плотность упаковки ДНК в хроматине, ее доступность для транскрипции регулируемых генов.
Описано участие Ikaros в трех комплексах такого типа. В составе комплекса NuRD (nucleosome remodeling and deacetylating) белок Ikaros связывает ключевой компонент комплекса, белок Mi-2p, и рекрутирует его к промоторам генов-мишеней. Гистон-деацетила-за (HDAC) в составе комплекса NuRD деацетилирует гистоны и сохраняет хроматин в конденсированном состоянии, что подавляет экспрессию генов-мишеней на протяжении нескольких клеточных делений [7, 8].
Часть белка Ikaros входит в состав комплекса Sin3. В этом случае Ikaros связывается с транскрипционно-активными генами, ассоциирует с ко-репрессором Sin3, что приводит к рекрутированию HDAC, конденсированию хроматина и снижению экспрессии генов [7, 8].
Наконец, Ikaros может выступать в качестве активатора экспрессии генов, рекрутируя комплекс Swi/Snf к генам-мишеням. Этот комплекс способствует «открытию» структуры хроматина за счет привлечения гистон-ацетилаз (HAC) или другого аденозинтрифос-фат-зависимого механизма, что способствует активации транскрипции генов [7, 8]. Ikaros также способен кооперироваться с другими активаторами транскрипции, такими как Sp1 и USF1 [9, 10].
В целом на ранних стадиях гемопоэза регулятор-ная роль Ikaros как ТФ сводится к репрессии генов миелоидной и эритроидной линий дифференцировки и стимуляции генов, ответственных за лимфоидную дифференцировку.
Регуляция функциональной активности Ikaros
Существуют немногочисленные данные о механизмах, регулирующих экспрессию гена IKZF1 на этапе транскрипции, однако механизмы посттранскрипционной регуляции его активности и/или уровня экспрессии белка изучены в большей степени. Функциональная активность Ikaros может определяться по крайней мере четырьмя механизмами: 1) альтернативный сплайсинг длинных изоформ, приводящий к изменению сродства Ikaros к ДНК или специфичности этого связывания; 2) альтернативный сплайсинг, приводящий к появлению DN-изоформ Ikaros, инги-бирующих ДНК-связывающую активность других изоформ и белков семейства; 3) фосфорилирование белка Ikaros, приводящее к снижению сродства к ДНК и изменению его локализации в ядре (например, сайт-специфическое фосфорилирование казеинкиназой-2); 4) вызванные фосфорилированием изменения в стабильности белка Ikaros, обеспечивающие его восприимчивость к убиквитин-опосредованной деградации [11].
Таким образом, существование многочисленных механизмов контроля функциональной активности Ikaros позволяет предположить, что полная картина регуляции более сложна и подчеркивает важность исследований Ikaros на уровне белка [11, 12].
Изучение функций Ikaros на мышиных knockout-моделях
Первоначально IKZF1 был описан как лимфоид-специфичный ТФ, отвечающий за регуляцию Т-кле-точной дифференцировки. Было показано, что белок Ikaros выступает как энхансер, связывающийся с ре-гуляторными последовательностями и усиливающий экспрессию ранних маркеров дифференцировки Т-кле-ток [13, 14]. Позже на нокаутных линиях мышей была более детально установлена функция этого гена в гемо-поэзе и формировании иммунной системы.
В первом in vivo исследовании функций Ikaros K. Georgopoulos et al. (1994) получены knockout-мыши с гомозиготными и гетерозиготными делециями ДНК-связывающих доменов IKZF1 (делеция 3-го и 4-го эк-зонов) [15]. Мутация не оказалась летальной in utero. Мыши с гомозиготной делецией (фенотип IkarosDN/DN, рис. 4а) отставали в росте и погибали от множественных инфекций до 4 недель. Животные имели рудиментарный тимус, лимфатические узлы отсутствовали, селезенка была увеличена и заполнена клетками эри-троидного и миелоидного происхождения. Наблюдалось полное отсутствие зрелых Т- и В-лимфоцитов, у5-Т-клеток, эпидермальных дендритных клеток (ДК) (табл. 1).
in сч
Ж ш
CJ
in сч
Ж ш
и
IkarosD
домены
Регион активации и репрессии
Ikaros"
у
7V
Белок-связывающие домены
Рис. 4. Характеристика нокаутныхмышей, использованных в in vivo исследованиях функций Ikaros:у IkarosDN-Mbmeü отсутствуют ДНК-свя-зывающие домены; у Ikaros^'-Mbrneü из-за отсутствия белок-связывающих доменов Ikaros не способен к взаимодействию с другими белками и функционально неактивен. Адаптировано из [16]
Таблица 1. Основные фенотипические проявления дисфункции Ikaros, установленные в экспериментах на knockout-моделях мышей
а
Мутация Экспрессия белка Фенотип
Ikarosnull/nul1 Полная дисфункция белка. №11-фенотип Снижение клоногенной активности стволовой клетки крови в 30—40 раз. Снижение количества В-, Т-клеток, натуральных киллеров (па1ига1 кШеге, NK), ДК. Клональная Т-клеточная экспансия. Смещение баланса CD4/CD8 Т-лимфоцитов в сторону CD4-клеток. Относительное снижение миелоидных клеток
IkarosDN/DN Все экспрессирующиеся изоформы белка являются DN-изоформами Снижение клоногенной активности стволовой клетки крови более чем в 100 раз. Полное отсутствие всех лимфоцитов, NK, ДК
Ikarosnull/wt №11-мутация в гетерозиготе. Экспрессируется одна аллель гена Нормальное количество и фенотип лимфоцитов. Увеличенная ТСЯ-опосредован-ная лимфопролиферация. Повышенная частота Т-клеточных лейкозов и лимфом
IkarosDN/wt DN-мутация в гетерозиготе. Экспрессия как длинных, так и коротких фЭД изоформ белка Нормальное количество и фенотип лимфоцитов. Увеличенная ТСЯ-опосредованная лимфопролиферация. Развитие Т-клеточных лейкозов и лимфом с частотой 100 %
Aiolosnull/nu" Полное отсутствие белка. №11-фенотип Повышение пре-В и В-лимфоцитов в костном мозге. Снижение рециркулиру-ющих, перитонеальных и других периферических В-лимфоцитов. Продукция аутоантител. Увеличенная ВСЯ-опосредованная лимфопролиферация. Переключение изотипа иммуноглобулина без иммунизации. Развитие В-клеточных опухолей
Aiolosnull/nu" Ikarosnull/wt Усиленный эффект мутации Аю^п|Ш/тШ в периферии. Повышенная частота Т- и В-клеточных опухолей
Примечание. TCR — Т-клеточный рецептор (T-cell receptor).
В последующей работе авторов [16] на кпоскоШ-мышах с гомозиготными и гетерозиготными делеци-ями ДНК-связывающих доменов IKZF1 установлено его влияние на процессы Т-клеточной пролиферации. Мыши с гетерозиготной делецией демонстрировали значительную TCR-опосредованную лимфопролифе-рацию Т-клеток в отсутствие антигенной стимуляции. По истечении 3 мес у 100 % мышей развились лимфа-денопатии, характеризовавшиеся увеличением лим-
фоузлов в 20—50 раз, развитием Т-клеточных лейкозов или лимфом. Аберрантная популяция лимфоцитов имела клональную природу и происходила из тимуса. При этом в опухолевых клетках наблюдалась потеря гетерозиготиности, т. е. инактивация нормальной аллели гена IKZF1.
J. H. Wang et al. [17] получили knockout-мышей с делецией 7-го экзона, кодирующего белок-связыва-ющие домены на C-конце Ikaros. Эта мутация в гомо-
зиготном состоянии выражается в Ikarosnun^eHorane (рис. 4б).
Такой белок не способен к димеризации, взаимодействию с другими белками и функционально не активен. Однако нарушения в лимфоидной системе у null-мышей оказались менее фатальными, чем у животных с DN-фенотипом: полностью отсутствовали зрелые В-лимфоциты; тимоциты накапливались в тимусе в количестве в 100—300 раз меньшем, чем у равновозрастных мышей дикого типа. Дальнейшая диф-ференцировка Т-клеток также была нарушена в сторону значительного преобладания CD4+CD8— Т-клеток. Не обнаруживались у5-Т-клетки, NK и эпи-дермальные ДК. При этом эритроидная и миелоидная линии дифференцировки существенно не пострадали. Гетерозиготные мыши с генотипом Ikarosnun/wt также были склонны к образованию Т-клеточных опухолей, но в меньшей степени, чем ^ЮБ^^-мыши (см. табл. 1).
При сравнении фенотипических эффектов двух типов мутаций Ikarosnu\ IkarosDN и их гетерозигот привлекают внимание более тяжелые нарушения лимфо-идной дифференцировки DN-генотипа в сравнении с null-генотипом. Различия в фенотипе этих двух мутаций определяются комплементарным действием других членов семейства — Helios и Aiolos. Короткие изоформы у 1кагоБт-мышей не способны к связыванию ДНК, однако сохраняют способность к гетероди-меризации с другими членами семейства, подавляя их активность по доминантно-негативному механизму.
Ikaros - ключевой фактор развития Т-клеток
Согласно современным представлениям, в норме развитие клеточных элементов костного мозга начинается от плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки (hematopoietic stem cell, HSC). Лимфомиело-идный росток подвергается сложной дифференци-ровке, на первом этапе которой HSC индуцируется в мультипотентную лимфоидную клетку-предшественника (lymphoid-primed multipotent progenitor, LMPP). Она дифференцируется до клетки-предшественника миелоцитов (granulocyte-macrophage progenitor, GMP) и ранней лимфоидной клетки-предшественника (early lymphoid progenitor, ELP) — клетки с широким потенциалом дифференцировки, включая миелоидный путь. Последняя мигрирует из костного мозга в тимус, где в результате ее праймирования каскад событий приводит к появлению ранних предшественников лимфоцитов (earliest thymic precursors, ETP) и общей лимфоидной клетки-предшественника (common lymphoid progenitor, CLP) [18, 19].
ETP являются наиболее ранними представителями Т-клеточного ряда и имеют фенотип CD4—CD8—, в связи с чем их называют дважды отрицательными (ДО, англ. double negative). ETP проходят несколько последовательных стадий развития (от ДО1 до ДО3), оставляя за собой фенотип CD4—CD8—, претерпевают при этом реаранжировку тяжелых цепей иммуногло-
булинов (Уф^-рекомбинация), что приводит к формированию антиген-распознающих участков иммуноглобулинов (a-, ß-, у- и 5-цепей) и TCR. Созревают популяции TCRaß и TCRy5 (aß- и у5-Т-клетки) предшественников Т-клеток, параллельно с этими событиями происходит созревание пула NK-клеток и эпидермальных ДК (клеток Лангерганса). Клетки с функциональным TCR переходят на стадию ДО4 и подвергаются процессу позитивной селекции, превращаясь в дважды положительные (ДП, англ. doublepositive) CD4+CD8+-клетки. ДП-тимоциты активно делятся, теряют один из рецепторов CD4 или CD8 (негативная селекция), переходят в стадию моноположительных клеток (single-positive) и мигрируют из тимуса в периферические органы иммунной системы для осуществления своей функции [18, 20].
Экспрессия белка Ikaros появляется уже на раннем этапе дифференцировки (рис. 5), когда стволовая клетка крови дифференцируется до общих LMPP, которые, в свою очередь, дают начало миелоидным и общим лимфоидным предшественникам (GMP, ELP) [18]. Выбор дальнейшей дифференцировки между В-и Т-лимфоцитами зависит от ряда вне- и внутриклеточных сигналов. При обособлении Т-клеточного ряда такими триггерами служат белки Gata-3 и Notch-1, экспрессия которых находится под контролем Ikaros [21, 22]. Дальнейшие этапы дифференцировки лимфоцитов контролируются совместно с другими линейно-специфическими ТФ.
Показано участие ТФ Ikaros в контроле этапов ре-аранжировки генов TCR [23]. В данном случае целевыми для Ikaros являются гены a-, ß- и 5-цепи TCR, субъединицы CD3, CD4, CD2, интерлейкин-2 (IL-2), IL-2Ra и др. [24]. При наличии мутаций IKZF1 на поверхности клеток снижается плотность функционирующих TCR, в результате подавляющее большинство клеток не способно воспринимать достаточный для последующей дифференцировки уровень сигнала извне и вступать в фазу позитивной селекции [25]. K. W. Tinsley et al. отметили неспособность ДП-клеток к дифференцировке в зрелый Т-лимфоцит при экспрессии доминантно-негативных изоформ Ikaros. Вместо этого клетки приобретали смешанный профиль маркеров дифференцировки, характерный как для зрелых, так и для незрелых тимоцитов. Такой фенотип не приводил к развитию опухолей, поскольку атипичные клетки подвергались аресту и массовому апоптозу, однако влек за собой полное отсутствие зрелых форм лимфоцитов, ДК и NK [26].
Таким образом, Ikaros является ключевым фактором как минимум на трех различных стадиях Т-клеточ-ной дифференцировки: 1) на стадии деления LMPP; 2) при обособлении лимфоидных предшественников (ELP, а затем и ETP) от общего ствола и 3) на ранних этапах Т-клеточной дифференцировки при реаран-жировке TCR и переходе ДО3/ДО4-клеток в ДП CD4+CD8+ пре-Т-клетки [17, 18, 27, 28].
in сч
Ж ш
CJ
in сч
Ж ш
и
Gata-3 пре-TCR
Notch-1
TCR
HSC
CLP riDO-B npe-B
Flt3
МЕР
Эритроциты, мегакариоциты
Миелоидный росток
Уровень экспрессии Ikaros
Рис. 5. Уровень экспрессии Ikaros отражает степень его участия на разных этапах созревания Т-клеток. Адаптировано из [13]
Контроль В-клеточной дифференцировки
Параллельно с созреванием Т-клеток в костном мозге несколько последовательных стадий развития проходят В-клетки, предшественником которых является CLP. Дифференцировка CLP в направлении про- и пре-В-клеток (от англ. progenitor — предок и precursor — предшественник) происходит в случае активация поверхностных рецепторов Flt3 и IL-7 (IL-7R). На этом этапе характерна экспрессия ТФ EBF1, что делает возможным дальнейшее прогресси-рование к стадии про-B и индуцирует экспрессию генов, специфичных для В-клеток. В частности, ген Pax5, который является ключевым фактором обособления В-линии, ограничивает возможности развития лимфоидных прогениторов только путем развития В-клеток [19, 29, 30]. Начиная экспрессироваться в ELP, Ikaros стимулирует экспрессию генов Flt3и IL-7R [20, 31] на поверхности CLP (рис. 6).
В дальнейшем, на этапе про-B, клетки подвергаются V(D)J-рекомбинации, что приводит к экспрессии поверхностного В-клеточного рецептора (B-cell receptor, BCR) и обеспечивает клеткам способность воспринимать сигнал к созреванию до пре-В-клеток. Далее, после нескольких раундов деления и реаран-жировки легких цепей Ig, клетки, экспрессирующие функциональные BCR, мигрируют в селезенку для заключительных стадий созревания [20]. На данном этапе специфика работы Ikaros заключается в регуляции реаранжировки генов Ig, в первую очередь путем активации экспрессии генов Rag1/2, осуществляющих
рекомбинацию [19, 32]. На этапе реаранжировки легких цепей Ig Ikaros принимает участие в контроле процесса аллельного исключения, т. е. обеспечивает специфичность антигенсвязывающего участка зрелой В-клетки. Дисфункция ТФ на данном этапе отражается в нарушениях сигнальных путей предшественников В-клеток и их неспособности к дальнейшей диффе-ренцировке в зрелые лимфоциты [13]. Исследования последних лет демонстрируют вклад Ikaros в динамическое регулирование генов адгезии и миграции клеток: обеспечение репрессии этих генов на стадии проВ-клеток и более высокой экспрессии на стадиях CLP и пре-В-клеток [19].
После дифференцировки клеток из про-В в пре-В Ikaros подавляет экспрессию компонента пре-В-кле-точного рецептора Lambda5 [19, 20].
В периферических отделах Ikaros регулирует порог активации B-клеток по отношению к антигену или Т-клеточной ко-стимуляции; ингибирует пролиферацию гиперактивированных В-клеток. Наконец, во время переключения изотипа антител Ikaros контролирует выбор изотипа путем ингибирования перехода на IgG2b и IgG2a и инициирует переход ко всем другим изоти-пам [13, 20].
Таким образом, исследования функций Ikaros у нокаутных мышей наряду с клиническими данными убедительно свидетельствуют о роли этого белка в качестве опухолевого супрессора, однако механизмы контроля опухолесупрессорной функции Ikaros до настоящего времени не определены [33]. Данные много-
ДП
IL-7R I
HSC — LMPP ELP
МЬР
Эритроциты, мегакариоциты
Flt3
QM
IL-7 Rag1/2 Flt3L EBF1 Pax5
CLP -рпро-В
tambda*
lgh[V-(D-J)] lgl[V-J] рекомбинация рекомбинация
Миелоидный росток
Антиген
Активация; выбор изотопа
lgG2b и lgG2a lgM, lgE, lgA, lgG3
1 I Уровень экспрессии Ikaros
Рис. 6. Ikaros контролирует клеточную дифференцировку на нескольких этапах развития В-лимфоцитов. Адаптировано из [19]
численных клинических исследовании подтверждают связь между наличием аберраций IKZF1 и развитием В-клеточных и, в меньшей степени, Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). Вместе с тем в публикациях последних лет нарушения функций Ikaros связывают с развитием миелопролифера-тивных заболеваний [13, 34, 35] и острого миелоидно-го лейкоза (ОМЛ) у детей [36].
Характеристика структурных нарушений IKZF1
При лейкозах обнаружены следующие варианты структурных мутаций гена IKZF1: геномные аберрации (моносомия 7-й хромосомы), хромосомные перестройки (крупные делеции и транслокации) и внутригенные мутации (небольшие делеции и точечные мутации). Также известны нарушения сплайсинга, выраженные в сверхэкспрессии коротких изоформ (рис. 7).
В функциональном отношении все структурные аберрации являются loss-of-function, т. е. приводят к потере или нарушению функции белка. Моносомия 7-й хромосомы, делеция ее короткого плеча и в особенности хромосомные перестройки во всех случаях выражаются серьезными комплексными нарушениями
физиологических функций не только со стороны системы гемопоэза. Частота перечисленных аберраций не превышает 5 % и всегда ассоциирована с полной потерей как минимум одного из аллелей IKZF1.
Наиболее распространенным (45 %) типом аберраций IKZF1 при острых лейкозах (ОЛ) являются вну-тригенные делеции 15—200 тыс. пар оснований, приводящие к потере нескольких экзонов (рис. 8).
Среди внутригенных делеций наиболее часто (не менее 30 %) обнаруживается делеция экзонов 3—6 (AEx3—6). Стабильность точек разрыва ДНК можно объяснить расположением в этих локусах последовательностей, между которыми происходит ошибочная RSS-рекомбинация при V(D)J-реаранжировке про-B-клеток из-за аберрантной активации генов Rag1/2 (контроль над активностью которых, как сказано выше, осуществляет Ikaros) [37]. Вторая распространенная делеция (15 %) также происходит в результате аберрантной RSS-рекомбинации и захватывает экзоны 1—6 (AEx1—6). Мутация, вероятнее всего, приводит к образованию нефункционального аллеля гена, поскольку 1-й экзон включает в себя стоп-кодон ATG. Частота встречаемости других известных делеций (AEx1—7 и AEx3—7) по разным данным не превышает 4 %.
in сч
Ж ш
CJ
К дисфункции белка Ikaros приводят:
Моносомия 7-й хромосомы,
делеция р7 или хромосомные перестройки
Внутригенные делеции(45 %)
Нарушения сплайсинга
Рис. 7. Варианты нарушений, приводящие к дисфункции гена IKZF1
ем
Ж ш
CJ
Белок-кодирующие экзоны
0 1 2
3 4 5 6
Делеция Ех1-7
Делеция Ех3-7
Делеция Ех1-6
Делеция Ех3-6
Рис. 8. Схемы образования внутригенных делеций IKZF1. Полупрозрачные элементы — участки гена, которые удаляются во время альтернативного сплайсинга при образовании разных изоформ белка
7
Логично предположить, что в результате делеций такого типа механизм сплайсинга будет нарушен, и это, вероятно, приведет к образованию нефункциональных, т. е. DN-изоформ белка. Так, наиболее часто встречающаяся DN-изоформа Ik6 образуется в результате делеции Ex3—6 и последующего сплайсинга между экзонами 2 и 7. Однако до настоящего времени вопрос взаимосвязи этих двух молекулярных событий остается спорным — в литературе высказаны две гипотезы появления коротких изоформ Ikaros. Согласно первой (F. Klein et al., 2006), такой альтернативный сплайсинг является результатом эпигенетического воздействия, в том числе вызванного биохимическими эффектами химерного онкогена BCR/ABL. Другой точки зрения придерживаются проф. C.G. Mullighan et al., указывая, что наличие делеций в гене является единственной причиной аберрантного сплайсинга [38, 39]. Сопоставив частоту внутригенных делеций в гене IKZF1 и уровень экспрессии коротких изоформ гена Ikaros у пациентов с ОЛЛ и здоровых доноров, мы поддерживаем теорию C. Mullighan и продолжаем дальнейшие исследования в этой области [6].
У здоровых доноров может регистрироваться невысокий уровень экспрессии коротких изоформ Ikaros [40]. Предполагается, что их появление отражает естественный механизм отрицательной регуляции функции IKZF1 как ТФ [10].
Таким образом, полная потеря функции гена может быть вызвана делецией сразу двух аллелей IKZF1 (12 % всех IKZFl-мутаций), а также мутациями, приводящими к образованию DN-форм Ikaros (33 % всех
IKZFl-мутаций). Частичная потеря функции IKZF1 может быть связана с инактивацией одной аллели [5, 36, 39]. Аберрации, связанные с потерей функции Ikaros, — биаллельные делеции и DN-формы — особенно характерны для Ph+ ОЛЛ. Другие мутации приводят к менее выраженному угнетению функции Ikaros, т. е. гаплодефициту, что наблюдается в 55—70 % всех мутаций IKZF1 при Ph- ОЛЛ [39].
Открытым остается также вопрос наличия субкло-нальных делеций IKZF1. Нередко у пациентов с ОЛ помимо основного лейкемического клона регистрируется один или более субклонов, характеризующихся собственной кинетикой и молекулярными событиями. Исследование близнецов и отслеживание субклональ-ных нарушений в различных генах позволяет предположить, что транслокация BCR/ABL1 является первым событием онкогенеза, в то время как мутации IKZF1 происходят позже, уже на стадии развития лейкоза. Сообщается о случаях «конвергентной» эволюции мутаций IKZF1, при этом у одного и того же пациента могут обнаруживаться несколько субклонов, несущих различные мутации IKZF1, однако до сих пор эти данные не нашли практического применения [41].
Исследования частоты делеций IKZF1 (табл. 2) могут быть условно разделены на те, которые были проведены до 2008 г., и более поздние, опубликованные в период активного развития геномных технологий (что отражается в росте частоты обнаруживаемых мутаций). В настоящее время структурные изменения IKZF1 регистрируются в более чем 20 % случаев детских ОЛЛ (из них около 90 % - внутригенные делеции
Таблица 2. Частота встречаемости внутригенных делеций IKZF1 при лейкозах
Авторы, год [источник] Диагноз, число пациентов Частота делеций, %
в исследовании AEx1-7 AEx3-7 AEx1-6 AEx3-6 все
Mullighan C. G. et al., 2007 [43] B-ОЛЛ (BCR/ABL1+/ - ОЛЛ), n = 242 9
Mullighan C. G. et al., 2008 [39] BCR/ABL1+ B-ОЛЛ, n = 43 83,7
Хронический миелоидный лейкоз, n = 23 1,12
Kawamata N. et al., 2008 [44] B-ОЛЛ (BCR/ABL1+/ - ОЛЛ), n = 399 < 2
Paulsson K. et al., 2008 [45] ОЛЛ, n = 45 18
Martinelli G. et al., 2009 [46] BCR/ABL1+ ОЛЛ, n = 83 20 37 63
Mullighan C. G. et al., 2009 [47] BCR/ABL1- B-ОЛЛ, n = 221 28,6
Den Boer M. L. et al., 2009 [48] BCR/ABL1+ ОЛЛ 73
BCR/ABL1- ОЛЛ, n = 297 в 2 группах 39
Okamoto R. et al., 2010 [49] В-ОЛЛ 15
Т-ОЛЛ; в 2 группах n = 75 (взрослые) + 399 (дети) 0
Iacobucci I. et al., 2012 [50] BCR/ABL1+ B-ОЛЛ, n = 106 26 49 75
BCR/ABL1- B-ОЛЛ, n = 38 58
Caye A. et al., 2012 [51] BCR/ABL1+ B-ОЛЛ, n = 60 2 4 7 24 75*
BCR/ABL1- B-ОЛЛ, n = 512 1 4 8 34 13,5*
Tocunaqa K. et al., 2013 [52] BCR/ABL1+ B-ОЛЛ, n = 24 83,3
BCR/ABL1- B-ОЛЛ, n = 54 38,9
de Rooij J. et al., 2014 [53] ОМЛ, n = 258 4,3
in сч
Ж ш
CJ
Примечание. * — с учетом субклональных делеций.
и 10 % — точечные мутации; 70 % случаев приходится на BCR/ABLl-позитивный ОЛЛ); в 30—50 % случаев взрослых ОЛЛ, в том числе при de novo ОЛЛ, а также при ОМЛ и гораздо реже — при хроническом миело-идном лейкозе на стадии прогрессирования болезни в бластный криз [42].
Точечные мутации, как правило, представляют собой мутации сдвига рамки считывания, ведущие к появлению стоп-кодонов. Их клиническое значение еще предстоит установить. Известны точечные мутации в локусах ДНК-связывающих доменов «цинковых пальцев», приводящие к дисфункции Ikaros при Т-ОЛЛ у мышей [54]. В более ранних исследованиях больших когорт пациентов с В-ОЛЛ точечные мутации выявлены не были. Эти расхождения могут отражать технические недостатки методов исследования или же невысокую частоту точечных мутаций IKZF1 при BCR/ABL+ ОЛЛ [39, 54, 55]. Тем не менее частота точечных мутаций IKZF1 при ОЛЛ по результатам полногеномного секвенирования, обеспечившего получение более точных данных, составляет 10 % [56]. Появились данные о повышенной частоте некоторых точечных замен (например, полиморфизм rs4132601) при В-ОЛЛ [57].
Прогностическое значение мутаций IKZF1
Значение аберраций гена IKZF1 при ОЛЛ было установлено относительно недавно - в исследованиях, начатых проф. С. G. Mullighan в St. Jude Children^ Research Hospital (США). В первом исследовании деле-ции IKZF1 были охарактеризованы как наиболее часто встречающиеся генетические аберрации в BCR/ABL1+-лейкозах и, таким образом, установлена ассоциация между этими двумя структурными нарушениями ДНК. Были проанализированы BCR/ABL1+ В-линейные ОЛ у детей и взрослых методом SNP-arrays. Из 43 таких случаев в 36 (83,7 %) были выявлены делеции в IKZF1 (16 из 21 ребенка и 20 из 22 взрослых) [42].
В следующем исследовании тех же авторов геномный анализ был выполнен на большой группе детей с В-линейным ОЛЛ методом SNP-arrays на ДНК, выделенной из лейкозных клеток костного мозга [47]. Была доказана достоверно повышенная частота рецидивов в общей когорте больных: 46,3 % пациентов с делецией в гене IKZF1 против 22,5 % без нее (n = 258; р = 0,002). Еще большие различия выявлены в стандартизованной когорте пациентов (без BCR/ABL1, младенцев и гиподиплоидных ОЛЛ) — 55,2 % у па-
in сч
Ж ш
и
циентов с делецией в гене IKZF1 против 14 % без нее (n = 221;р < 0,001). В этом же исследовании продемонстрирована ассоциация между наличием делеций в ло-кусе IKZF1 и уровнем минимальной остаточной болезни (МОБ) на 15-й и 29-й день терапии. Из 67 пациентов с делециями в этом гене 16 (23,9 %) имели высокий уровень МОБ (> 1 %) на 29-й день в сравнении с 6,6 % пациентов без этой аберрации (р = 0,001).
Группа европейских исследователей по результатам геномного анализа высокого разрешения установила, что у пациентов с В-линейным ОЛЛ, развивших впоследствии рецидив (13 из 34; 38,2 %), частота делеций в гене IKZF1 на 2-м месте по частоте встречаемости после аберраций гена ингибитора циклин-зависи-мых киназ CDKN2A (15 из 34; 44,1 %) [58]. Пациенты с делециями IKZF1 имели значительно более низкую безрецидивную выживаемость (39 % с делециями против 89 % wt,р < 0,001) и сниженную общую выживаемость (56 % с делециями против 91 % wt, р < 0,001) в общей группе пациентов. Достоверные различия сохранялись как для группы высокого риска, так и для пациентов без высокого риска.
В исследованиях китайских авторов на большой группе больных ОЛЛ показана худшая безрецидивная выживаемость у пациентов со сверхэкспрессией короткой изоформы Ik6 [59, 60]. Ik6 оказался независимым неблагоприятным прогностическим фактором для показателей общей и безрецидивной выживаемости у детей, в том числе при BCR/ABL1 -негативных детских В-линей-ных ОЛ, но не BCR/ABL1 -негативных взрослых лейкозов.
Необходимость учета делеций гена IKZF1 для стратификации пациентов по группам риска поставлена под сомнение в исследовании итальянских авторов [61]. Делеции в локусе IKZF1 были оценены методом мультиплексной лигазозависимой амплификации проб (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) в группе из 410 детских В-линейных BCR/ ABLl-негативных ОЛЛ. В общей группе пациенты с делециями IKZF1 сохраняли сниженную бессобытийную выживаемость и повышенную вероятность рецидива. Пациенты с делециями IKZF1 неравномерно распределились по группам риска (выделенным согласно стратификации, основанной на оценке уровня МОБ): в группе стандартного риска делеции обнаружены у 8 (6,8 %) из 117 больных, промежуточного — у 42 (15,9 %) из 264 и высокого - у 4 (13,8 %) из 29. Ни у одного из 8 пациентов с делецией в группе стандартного риска не развился рецидив. В группе промежуточного риска пациенты с делециями IKZF1 имели повышенную частоту рецидивов, но различия не достигли достоверности. Таким образом, прогностическое значение IKZF1 зависит от применяемого протокола и может не иметь дополнительной ценности для стратификации после разделения на принятые группы риска. Авторы предполагают, что усиленное применение L-аспарагиназы в используемом протоколе могло снизить прогностическую роль гена IKZF1. Предпо-
лагается, что комбинирование такого классического прогностического критерия, как уровень МОБ, с анализом мутаций IKZF1 может значительно улучшить стратификацию пациентов с ОЛЛ по группам риска [62].
Наконец, группа немецких авторов детально изучила прогностические факторы для первого костномозгового рецидива В-линейного ОЛЛ у детей [63]. С использованием метода MLPA была выявлена высокая частота делеций IKZF1 (33,3 %). Анализ бессобытийной и общей выживаемости показал достоверно худший исход у пациентов с делецией IKZF1. Различия особенно велики для пациентов в группе высокого риска, для получивших аллотрансплантацию костного мозга, а также для больных с низким уровнем МОБ. Многофакторный анализ показал, что независимыми неблагоприятными факторами для рецидивов ОЛЛ выступают только делеции гена IKZF1 и мутации в гене опухолевого супрессора TP53.
Некоторые факты свидетельствуют о вкладе Ikaros в развитие лекарственной устойчивости лейкозов [64]. I. Iacobucci et al. (2008) впервые провели анализ связей между наличием молекулярных нарушений гена IKZF1 и устойчивостью к ингибиторам тирозинкиназ (ИТК) у пациентов с BCR/ABL1+ ОЛЛ. Короткая изоформа Ik6 была обнаружена у 49 % исследуемых пациентов, при этом наблюдалась высокая степень корреляции между наличием DN-изоформ Ikaros и уровнем транс-криптов BCR/ABL1. Для лейкозных клеток пациентов экспрессия коротких изоформ Ikaros была характерна до лечения ИТК и преимущественно на момент рецидива, но не во время ответа на ИТК [65].
Гиперэкспрессия in vitro Ik6 активирует синтез ДНК и ингибирует апоптоз в ИТК-чувствительных клетках. В эксперименте на клеточных линиях F. Zhou et al. (2014) подтвердили гипотезу развития множественной химиорезистентности за счет антиапоптотического эффекта, который наблюдался при гиперэкспрессии короткой изоформы Ik6 [66].
У BCR/ABLl-негативных больных B-ОЛЛ в работе N. A. Vitanza et al. закономерностей между наличием мутаций IKZF1 и развитием лекарственной устойчивости обнаружено не было. Исследователи предполагают, что плохой прогноз заболевания в данном случае мог быть обусловлен другими генетическими нарушениями или особенностями микроокружения клеток костного мозга [67].
Обобщив данные, можно констатировать, что Ikaros является опухолевым супрессором для лимфоидных опухолей. Мутации, приводящие к утрате функций белка, ассоциированы с неблагоприятным прогнозом заболевания. Анализ структурных аберраций и альтернативного сплайсинга гена IKZF1 целесообразно включать в диагностические панели всех типов лейкозов и в дальнейшем принимать во внимание при определении МОБ. Более точное прогностическое значение этих признаков еще предстоит выяснить для разных групп пациентов с учетом других генетических маркеров и схемы проводимой химиотерапии.
1. OriGene Technologies database. URL: http://www.origene.com / Human_ cDNA/SC331775. aspx.
2. Gounari F., Kee B. L. Fingerprinting Ikaros. Nat Immunol 2013;14(10):1034—5.
3. Jhanjun L., Perez-Casellas L. A., Savic A. et al. Ikaros isoforms the saga continues. World J Biol Chem 2011;2(6):140-5.
4. Molnar A., Georgopoulos K. The Ikaros gene encodes a family of functionally diverse zinc finger DNA-binding proteins. Mol Cell Biol 1994;14(12):8292-303.
5. Payne K. J., Nicolas J. H., Zhu J. Y. et al. Cutting edge: predominant expression
of a novel Ikaros isoform in normal human hemopoiesis. J Immunol 2001;167(4): 1867-70.
6. Meleshko A. N., Movchan L. V., Belevtsev M. V., Savitskaja T. V. Relative expression of different Ikaros isoforms
in childhood acute leukemia. Blood Cells Mol Dis 2008;41(3):278-83.
7. Georgopoulos K. Haematopoietic cell-fate decisions, chromatin regulation and ikaros. Nat Rev Immunol 2002;2(3):162-74.
8. Cortes M., Wong E., Koipally J., Georgopoulos K. Control of lymphocyte development by the Ikaros gene family. Curr Opin Immunol 1999;11(2):167-71.
9. Liu M., Whetstine J. R., Payton S. G. et al. Roles of USF, Ikaros and Sp proteins in the transcriptional regulation of the human reduced folate carrier B promoter. Biochem J 2004;383(Pt 2):249-57.
10. Zinc finger proteins: From atomic contact to cellular function. S. Iuchi, N. Kuldel (eds.). Landes Bioscience, 2005. P. 201.
11. Song C., Li Z., Erbe A. K. et al. Regulation of Ikaros function by casein kinase 2 and protein phosphatase 1. World J Biol Chem 2011;2(6):126-31.
12. Francis O. L., Payne J. L., Su R. J., Payne K. J. Regulator of myeloid differentiation and function: The secret life of Ikaros. World J Biol Chem 2011;2(6):119-25.
13. Schwickert T. A., Tagoh H., Gültekin S. et al. Stage-specific control of early B cell development by the transcription factor Ikaros. Nat Immunol 2014;15(3):283-93.
14. Georgopoulos K., Moore D. D., Derfler B. Ikaros, an early lymphoid-specific transcription factor and a putative mediator for T cell commitment. Science 1992;258(5083):808-12.
15. Georgopoulos K., Bigby M., Wang J. H. et al. The Ikaros gene is required for the development of all lymphoid lineages. Cell 1994;79(1):143-56.
16. Winandy S., Wu P., Georgopoulos K.
A dominant mutation in the Ikaros gene leads to rapid development of leukemia and lymphoma. Cell 1995;83(2):289-99.
17. Wang J. H., Nichogiannopoulou A., Wu L. et al. Selective defects in the development of the fetal and adult lymphoid
ЛИТЕРАТУРА
system in mice with an Ikaros null mutation. Immunity 1996;5(6):537-49.
18. Ярилин А. А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 752 с. [Yarilin A. A. Immunology. Moscow: GEOTAR-Media, 2010. 752 p. (In Russ.)].
19. Sellars M., Kastner P., Chan S. Ikaros in B cell development and function. World J Biol Chem 2011;2(6):132-39.
20. Yoshida T., Georgopoulos K. Ikaros fingers on lymphocyte differentiation. Int J Hematol 2014;100(3):220-9.
21. Osborne B. A. Transcriptional control of T cell development. Curr Opin Immunol 2000;12(3):301-6.
22. Rothenberg E. V., Taghon T. Molecular genetics of T cell development. Annu Rev Immunol 2005;23:601-49.
23. Winandy S. Ikaros to the rescue of TCR-a chain gene rearrangement. Eur J Immunol 2013;43(2):314-7.
24. Schmitt C., Tonnelle C., Dalloul A. et al. Aiolos and Ikaros: regulators of lymphocyte development, homeostasis and lymphoproliferation. Apoptosis 2002;7(3):277-84.
25. Avitahl N., Winandy S., Friedrich C. et al. Ikaros sets thresholds for T cell activation and regulates chromosome propagation. Immunity 1999;10(3):333-43.
26. Tinsley K. W., Hong C., Luckey M. A. et al. Ikaros is required to survive positive selection and to maintain clonal diversity during T-cell development in the thymus. Blood 2013;122(14):2358-68.
27. Yoshida T., Ng S. Y., Zuniga-Pflucker J. C., Georgopoulos K. Early hematopoietic lineage restrictions directed by Ikaros. Nat Immunol 2006;7(4):382-91.
28. Ng S. Y., Yoshida T., Zhang J., Georgopoulos K. Genome-wide lineage-specific transcriptional networks underscore Ikaros-dependent lymphoid priming in hematopoietic stem cells. Immunity 2009;30(4):493-507.
29. Nutt S. L., Kee B. L. The transcriptional regulation of B cell lineage commitment. Immunity 2007;26(6):715-25.
30. Smith E., Sigvardsson M. The roles of transcription factors in B lymphocyte commitment, development, and transformation. J Leukoc Biol 2004;75(6):973-81.
31. Ng S. Y., Yoshida T., Georgopoulos K. Ikaros and chromatin regulation in early hematopoiesis. Curr Opin Immunol 2007;19(2):116-22.
32. Kirstetter P., Thomas M., Dierich A. et al. Ikaros is critical for B cell differentiation and function. Eur J Immunol 2002;32(3):720-30.
33. Liberg D., Smale S. T., Merkenschlager M. Upstream of Ikaros. Trends Immunol 2003;24(11):567-70.
34. Jäger R., Gisslinger H., Passamonti F. et al. Deletions of the transcription factor
in
СЧ
Ikaros in myeloproliferative neoplasms. Leukemia 2010;24(7):1290-8.
35. Tefferi A. Novel mutations and their functional and clinical relevance in myeloproliferative neoplasms: JAK2, MPL, TET2, ASXL1, CBL, IDH and IKZF1. Leukemia 2010;24(60):1128-38.
36. Yagi T., Hibi S., Takanashi M. et al. High frequency of Ikaros isoform 6 expression in acute myelomonocytic and monocytic leukemias: implications for up-regulation
of the antiapoptotic protein Bcl-XL in leukemogenesis. Blood 2002;99(4):1350-5.
37. Meyer C., Zur Stadt U., Escherich G. et al. Refinement of IKZF1 recombination hotspots in pediatric BCP-ALL patients. Am J Blood Res 2013;3(2):165-73.
38. Klein F., Feldhahn N., Herzog S. et al. BCR-ABL1 induces aberrant splicing of IKAROS and lineage infidelity in pre-B lymphoblastic leukemia cells. Oncogene 2006;25(7):1118-24.
39. Mullighan C. G., Miller C. B., Radtke I. BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia is characterized by the deletion of Ikaros. Nature 2008;453(7191):110-4.
40. Yuan T., Zhao X. L., Zhang L. X. et al. Expression and clinical significance of IKZF1 gene IK6 isoform in adult acute lymphoblastic leukemia. J Exp Hematol 2013;21(3):539-43.
41. Burmeister T., Gesine B.,
Gröger D. Germline variants in IKZF1, ARID5B, and CEBPE as risk factors for adult-onset acute lymphoblastic leukemia: an analysis from the GMALL study group. Haematologica 2014;99(2):e23-5.
42. Mullighan C. G. The molecular genetic makeup of acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2012;2012:389-96. doi: 10.1182/ asheducation-2012.1.389.
43. Mullighan C. G., Goorha S., Radtke I. et al. Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia. Nature 2007;446(7137):758-64.
44. Kawamata N., Ogawa S., Zimmermann M. et al. Molecular allelokaryotyping of pediatric acute lymphoblastic leukemias by high-resolution single nucleotide polymorphism oligonucleotide genomic microarray. Blood 2008;111(2):776-84.
45. Paulsson K., Cazier J. B., Macdougall F. Microdeletions
are a general feature of adult and adolescent acute lymphoblastic leukemia: Unexpected similarities with pediatric disease. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(18):6708-13.
46. Martinelli G., Iacobucci I., Storlazzi C. T. et al. IKZF1(Ikaros) deletions in BCR-ABL1-positive acute lymphoblastic leukemia are associated with short diseasefree survival and high rate of cumulative incidence
Ж
Ш
CJ
in сч
Ж ш
и
of relapse: a GIMEMA AL WP report. J Clin Oncol 2009;27(31):5202-7.
47. Mullighan C. G., Su X., Zhang J. et al. Deletion of IKZF1 and prognosis in acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 2009;360(5):470-80.
48. Den Boer M. L., van Slegtenhorst M., de Menezes R. X. et al. A subtype of childhood acute lymphoblastic leukaemia with poor treatment outcome: a genome-wide classification study. Lancet Oncol 2009;10(2):125-34.
49. Okamoto R., Ogawa S., Nowak D. et al. Genomic profiling of adult acute lymphoblastic leukemia by single nucleotide polymorphism oligonucleotide microarray and comparison to pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2010;95(9):1481-8.
50. Iacobucci I., Iraci N., Messina M. et al. IKAROS deletions dictate a unique gene expression signature in patients with adult B-cell acute lymphoblastic leukemia. PLoS One 2012;7(7):e40934.
51. Caye A., Beldjord K., Mass-Malo K. et al. Breakpoint-specific multiplex polymerase chain reaction allows the detection
of IKZF1 intragenic deletions and minimal residual disease monitoring in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2013;98(4): 597-601.
52. Tokunaga K., Yamaguchi S., Iwanaga E. et al. High frequency of IKZF1 genetic alterations in adult patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Eur J Haematol 2013;91(3):201-8.
53. de Rooij J., Beuling E., Zwaan C. M. et al. IKZF1 deletions in pediatric acute myeloid leukemia. 56th ASH Annual Meeting &
Exposition. URL: https://ash.confex.com/as h/2014/webprogram/Paper71902. html.
54. Kastner P., Chan S. Role of Ikaros in T-cell acute lymphoblastic leukemia. World J Biol Chem 2011;2(6):108-14.
55. Iacobucci I., Storlazzi C. T., Cilloni D. Identification and molecular characterization of recurrent genomic deletions on 7p12 in the IKZF1 gene in
a large cohort of BCR-ABLl-positive acute lymphoblastic leukemia patients: on behalf of Gruppo Italiano Malattie Ematologiche dell»Adulto Acute Leukemia Working Party(GIMEMA AL WP). Blood 2009;114(10):2159-67.
56. Roberts K. G., Morin R. D., Zhang J. et al. Genetic alterations activating kinase and cytokine receptor signaling in highrisk acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell 2012;22(2):153-66.
57. Boehm V., Lebenatus A., Bartels M. et al. Subclonal IKZF1 deletions indicate
a multiclonal evolution in BCR-ABLl-positive B-cell precursor ALL. Blood 2013;122(21):1327.
58. Kuiper R. P., Waanders E.,
van der Velden V. H. et al. IKZF1 deletions predict relapse in uniformly treated pediatric precursor B-ALL. Leukemia 2010;24(7):1258-64.
59. Liu P., Lin Z., Qian S. et al. Expression of dominant-negative Ikaros isoforms and associated genetic alterations in Chinese adult patients with leukemia Ann Hematol 2012;91(7):1039-49.
60. Mi J. Q., Wang X., Yao Y. et al. Newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia in China(II): prognosis related to genetic abnormalities in a series of 1091 cases. Leukemia 2012;26(7):1507-16.
61. Palmi C., Valsecchi M. G., Longinotti G. et al. What is the relevance of Ikaros gene deletions as a prognostic marker in pediatric philadelphia-negative B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia? Haematologica 2013;98(8):1226-31.
62. Waanders E., van der Velden V. H., van der Schoot C. E. et al. Integrated use
of minimal residual disease classification and IKZF1 alteration status accurately predicts 79 % of relapses in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2011;25(2):254-8.
63. Krentz S., Hof J., Mendioroz A. et al. Prognostic value of genetic alterations
in children with first bone marrow relapse of childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2013;27(2):295-304.
64. Martinelli G., Iacobucci I., Papayannidis C., Soverini S. New targets for Ph+ leukaemia therapy. Best Pract Res Clin Haematol 2009;22(3):445-54.
65. Iacobucci I., Lonetti A., Messa F. et al. Expression of spliced oncogenic Ikaros isoforms in Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: implications
for a new mechanism of resistance. Blood 2008;112(9):3847-55.
66. Zhou F., Xu Y., Qiu Y. et al. Ik6 expression provides a new strategy for the therapy of acute lymphoblastic leukemia. Oncol Rep 2014;31(3):1373-9.
67. Vitanza N. A., Zaky W., Blum R. et al. Ikaros deletions in BCR-ABL-negative childhood acute lymphoblastic leukemia are associated with a distinct gene expression signature but do not result in intrinsic chemoresistance. Pediatr Blood Cancer 2014; 61(10):1779-85.
