Роль гена PTEN при гиперпластических процессах эндометрия на фоне метаболического синдрома Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Литература

1. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом// Под ред. И. И. Дедова, М. В. Шестаковой. Изд-е 4-е, доп. М., 2009. 103 с.

2. Клинико-экономический анализ / П. А. Воробьев [и др.]. М.: Ньюдиамед, 2004. 404 с.

3. Об утверждении отраслевого стандарта «Клинико-экономи-ческие исследования. Общие положения»: Приказ Минздрава России от 27.05.2002 № 163. URL: http://russia.bestpravo.ru/ fed2002/data06/tex20823.htm (19.03.2012).

4. Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с синдромом диабетической стопы: Приказ Минздравсоцразви-

тия России от 01.12.2005 № 735. URL: http://lawru.info/base78/ part5/d78ru5876.htm (19.03.2012).

5. Основные положения стандартизации в здравоохранении (утв. Приказом МЗ РФ и Федерального фонда ОМС от 19 января 1998 г. № 12/2). URL: http://www.sartfoms.ru/normativ/12_19_01_98.htm (19.03.2012).

6. International Consensus on the Diabetic Foot and Practical Guidelines on the Management and the Prevention of the Diabetic Foot. International Working Group on the Diabetic Foot, 2007. Available at: www.iwgdf.org (19.03.2012).

7. Lefebvre P. Amputations linked to diabetes. Hospital Management. net 2005. Available at: http://www.hospitalmanagement.net/fea-tures/feature627/ (19.03.2012). ■

Роль гена PTEN при гиперпластических процессах эндометрия на фоне метаболического синдрома

В. Е. Радзинский, Е. А. Панова, Г. Ф. Тотчиев, М. Б. Хамошина, Ю. В. Бондаренко

PTEN Expression in Endometrial Hyperplasia Associated with Metabolic Syndrome

V. E. Radzinsky, E. A. Panova, G. F. Totchiev, M. B. Khamoshina, Yu. V. Bondarenko

Проспективный анализ исследований последних лет показывает, что в основе злокачественного перерождения клеток лежат мутационные повреждения генов, контролирующих рост, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз (PTEN, Ье1-2, р53 и др.) [1, 7, 9]. PTEN является тумор-супрес-сорным геном, кодирующим липидную фосфатазу, функции которой заключаются в том, чтобы обеспечивать нормальное течение процессов клеточного апоптоза. Мутации в гене PTEN являются одними из самых ранних признаков трансформации гиперплазии эндометрия (ГЭ) в атипическую гиперплазию и рак. Дефект PTEN — это инактивация обеих аллелей, что приводит к остановке синтеза белка, полной потере функции клетки или ее фенотипа [8, 9, 11, 12]. В настоящее время активно ведутся поиск и исследования новых пусковых механизмов мутаций гена PTEN, в том числе и воздействия вирусов [10].

Одним из ключевых и пусковых механизмов нарушения процессов апоптоза является метаболический синдром (МС). МС характеризуется увеличением массы висцерального жира, снижением чувствительности периферических тканей к инсулину и гиперинсулинемией, которые вызывают развитие нарушений углеводного, липидного, пуринового обмена и артериальной гипертензии, представляя собой звенья единой цепи обменных расстройств [5]. Являясь источником эндогенного образования эстрона за счет ароматизации андростендиона и накопления эстрогена в жировой ткани, ожирение приводит к увеличению «эстрогенного пула» в организме и, таким образом, стимулирует развитие гиперпластических процессов в тканях-мишенях, особенно в эндометрии [13]. Анализ степени генетических изменений при гиперпластических процессах эндометрия (ГПЭ) на фоне МС у пациенток различных возрастных групп представляет большой научный интерес, поскольку позволит внести значимые коррективы в тактику ведения таких больных [2, 3].

Цель исследования: оценить уровень экспрессии гена PTEN при рецидивирующем течении ГПЭ на фоне МС.

Материал и методы

В исследование включены 40 пациенток в возрасте от 30 до 76 лет (средний возраст — 50 ± 3,11 года) с ГПЭ, выявленным по данным УЗИ органов малого таза аппаратом А1ока SSD-1400 (Япония) с использованием трансвагинального датчика (М-ЭХО в I фазу менструального цикла от 6 до 14 мм, во II фазу менструального цикла 15 мм и более и в постменопаузу более 5 мм с неоднородной эхографической структурой).

МС диагностировали на основании наличия основного критерия МС — абдоминального типа ожирения (окружность талии > 80 см) и двух и более дополнительных критериев: артериальная гипертония (АД > 130/85 мм рт. ст.), тригли-цериды > 1,7 ммоль/л, ХС ЛПВП < 1,0 ммоль/л, ХС ЛПНП > 3,0 ммоль/л, гипергликемия натощак (глюкоза в плазме крови натощак > 6,1 ммоль/л), нарушение толерантности к глюкозе (глюкоза в плазме крови через 2 часа после нагрузки в пределах > 7,8 и < 11,1 ммоль/л) [2]. Ожирение диагностировали с помощью индекса массы тела (ИМТ) Брея: норма — 19,0-24,9; избыточная масса — 25,0-29,9; ожирение I степени -30,0-34,9, II степени — 35,0-39,0, III степени — 40,0 и более [2].

У 16 пациенток (40,0%) с отсутствием жалоб на менометрор-рагии при рецидивирующем течении ГПЭ и у 3 пациенток (7,5%) постменопаузального возраста с кровянистыми выделениями из половых путей забор эндометрия производили эндометриальным зондом Епс1огат (RI.MOS, Италия), остальным (52,5%) выполняли гистероскопическое исследование с диагностическим выскабливанием слизистой цервикального канала и стенок полости матки. Биоптаты были фиксированы в 4% растворе формальдегида по стандартной методике. Из них после соответствующей обработки и заливки в парафин (парафиновые блоки) получали срезы, которые подвергали окраске гематоксилин-эозином. После предварительного исследования полученных препаратов приступали к их морфологическому изучению с помощью световой микроскопии по общепринятой методике.

На базе научной лаборатории патоморфологии Российского онкологического научного центра РАМН им. Н. Н. Блохина (зав. — д. м. н., проф. А. И. Карселадзе) для всех образцов эндометрия применяли иммуногистохимический метод выявления экспрессии PTEN. На первом этапе из блоков подготавливали срезы толщиной 4-5 мм и помещали на водяную баню комнатной температуры с последующим переносом на маркированные стекла SuperFrost Plus (Menzel, Германия). После депарафинизации и регидратации образцов эндометрия с использованием ксилена и этанола восстанавливали антигенную активность выдерживанием в 1000 мл цитратного буфера pH 6,4 в условиях микроволновой печи при постоянной температуре 93 °С. Охлаждали образцы на водяной бане 15 минут и помещали в буфер 1 х PBS (Phosphate-buffered-saline) на 5 минут. После устранения эндогенных пероксидов (выдерживанием в 25 мл 30% H2O2 и 225 мл метанола) стекла покрывали протеиновым блоком (нанесением реактива DAKO 6H2.1 X0909 1 мл, титрованного до 1 : 300).

На втором этапе проводили первичную инкубацию с крысиными антителами (добавление 250 UL антител + контроль с 250 UL 1 х PBS pH 7,4). После отмывки от первичных антител 6-кратным помещением в 50 мл 1 х PBS pH 7,4 начинали третий важный этап — добавление на каждое стекло 250 UL разведенных биотинилированных IgG вторичных антител (Vector Laboratories (США) cat. PK-6102): 1 капля концентрата IgG на 10 мл 1 х PBS pH 7,4. Основной задачей использования биотинилированных вторичных антител является усиление «сигнала» иммуногистохимической реакции, что достигается благодаря способности вторичных антител к большему захвату ABC-реагента. На стекла наносили Vectastain ABC-реагент (2 капли реагента А в 5 мл 1 х PBS pH 7,4 + 2 капли реагента В), в котором реагент А — авидин, реагент В — биотин; благодаря последнему формируется связующий «мост» между вторичными антителами и АВС-комплексом. Проводили отмывку стекол в течение 5 минут в буфере 1 х PBS и просушивание открытым способом.

Завершающим этапом являлось добавление 250 UL DAB Substrate Chromogen, что приводит к визуальной окраске срезов благодаря ферментации. Качественную оценку экспрессии PTEN проводили под микроскопом Axio Lab E (Carl Zeiss, Германия) при разрешении от 5х/0,12 до 40х/0,25.

Экспрессию PTEN оценивали как PTEN+++ (3+) — «высокая», PTEN++ (2+) — «умеренная», PTEN+ (1+) — «низкая» и PTEN- (0) — отсутствие экспрессии (рис. 1, 2).

Результаты

По итогам исследования у 80% пациенток был диагностирован МС, в том числе у 32 пациенток (80,0%) выявлена дислипидемия за счет повышения уровня триглицеридов до 2,7 ± 0,36 ммоль/л, общего холестерина — до 6,3 ± 0,43 ммоль/л (62,5%) и ЛПНП — до 3,4 ± 0,24 ммоль/л (42,5%). У 20 (50,0%) обнаружено повышение уровня сывороточной глюкозы до 6,2 ± 0,63 ммоль/л натощак, у 67,5% выявлена артериальная гипертония. Избыточную массу тела диагностировали у 27,7% пациенток, ожирение I степени — у 25%, II степени — у 15%, III степени — у 7,5%.

По данным гистологического исследования эндометрия пациентки были стратифицированы на три группы. В первой группе (n = 13) эндометрий соответствовал фазам менструального цикла, во второй группе (n = 21) наблюдались ГЭ с преобладанием железистого или кистозного компонента,

Рис. 1. «Высокая» экспрессия гена PTEN в нормальном эндометрии при иммуногистохимическом исследовании. Фото Е. А. Пановой, Ю. В. Бондаренко

Рис. 2. «Умеренная» экспрессия гена PTEN при гиперплазии эндометрия с преобладанием кистозного компонента. Фото Е. А. Пановой, Ю. В. Бондаренко

наличие железисто-фиброзного полипа и/или кистозная дегенерация эндометрия без признаков атипии, в третьей группе (п = 6) — атипическая гиперплазия и аденокарцино-ма эндометрия.

По результатам исследования выявлена взаимосвязь рецидивов ГПЭ с наличием МС и снижением экспрессии PTEN. Проведенный анализ показал, что первую группу сформировали пациентки позднего репродуктивного (53%) и пери-менопаузального (47%) возраста без МС, имевшие до двух эпизодов раздельного диагностического выскабливания в анамнезе по поводу ГПЭ. У всех женщин была выявлена «высокая» экспрессия PTEN. Во второй группе оказались пациентки перименопаузального возраста (52%) с более чем двумя эпизодами рецидива ГПЭ в анамнезе на фоне МС, которые имели «умеренную» экспрессию PTEN. В третьей группе у пациенток постменопаузального возраста (66%) с МС и более чем тремя эпизодами рецидива ГПЭ диагностированы атипическая гиперплазия с «низкой» экспрессией PTEN и аденокар-цинома эндометрия (34%) с отсутствием экспрессии PTEN.

№ 1 (69) — 2012 год

DOVJnyJOjp&j

88

Заключение

Определение экспрессии тумор-супрессорного гена PTEN иммуногистохимическим методом является перспективным анализом для раннего выявления предраковых процессов эндометрия: резкое снижение или исчезновение экспрессии PTEN происходит в 50-70% случаев атипических изменений эндометрия и предшествует появлению рака эндометрия [4, 6, 8]. Степень угнетения экспрессии PTEN имеет прямую корреляцию с наличием ГЭ, частотой рецидивов и атипической трансформацией эндометрия. «Высокая» экспрессия PTEN характерна для пациенток без

МС с рецидивами ГПЭ в анамнезе не более 2 раз, «умеренная» — с рецидивами ГПЭ более 2-3 раз и при наличии МС, «низкая» и отсутствие экспрессии PTEN выявляются у женщин с атипией эндометрия, рецидивами ГПЭ более 2-3 раз и при наличии МС.

Полученные данные позволяют выделить контингент высокого риска по атипии эндометрия (наличие МС, «умеренная», «низкая» экспрессия РТЕкоторому потребуются тщательное динамическое наблюдение с коррекцией метаболических нарушений и приоритетное оперативное лечение в случае рецидивирующего течения ГПЭ.

Резюме

Цель исследования — оценка уровня экспрессии гена PTEN при рецидивирующем течении гиперпластических процессов эндометрия (ГПЭ)

на фоне метаболического синдрома (МС).

Дизайн — открытое рандомизированное исследование.

Материал. Обследованы 40 пациенток 30-76 лет (средний возраст — 50 ± 3,11 года) с ГПЭ, выявленными в ходе УЗИ органов малого таза.

Результаты. По результатам антропометрического и биохимического исследования у 80% пациенток диагностирован МС. По данным гистологического исследования эндометрия пациентки были разделены на три группы: в I группе (n = 13) эндометрий соответствовал фазам менструального цикла; во II группе (n = 21) наблюдались гиперплазия эндометрия с преобладанием железистого или кистозного компонента, железисто-фиброзный полип и/или кистозная дегенерация эндометрия без признаков атипии; в III группе (n = 6) — атипическая гиперплазия и аденокарцинома эндометрия. По результатам иммуногистохимической оценки экспрессии гена PTEN «высокая» экспрессия обнаружена в нормальном эндометрии у пациенток I и II групп с рецидивами ГПЭ в анамнезе до 2 раз без МС, а «умеренная», «низкая» и отсутствие экспрессии гена PTEN — в патологически измененном эндометрии II и III групп с рецидивами ГПЭ более 2-3 раз и при наличии МС (р < 0,05).

Заключение. Определение экспрессии гена PTEN иммуногистохимическим методом является перспективным анализом для раннего выявления предраковых заболеваний и рака эндометрия.

Ключевые слова: уровень экспрессии гена PTEN, гиперпластические процессы эндометрия (ГПЭ), метаболический синдром (МС).

Summary

Study Objective: To assess PTEN expression in recurrent endometrial hyperplasia (EH) associated with metabolic syndrome (MS). Study Design: This was an open-label, randomized study.

Materials: We examined 40 patients aged 30 to 76 (mean age 50 ± 3.11 years) with EH detected by pelvic ultrasound.

Results: Based on anthropometric and biochemical measurements, we diagnosed MS in 80% of patients. Based on their endometrial histology data, the patients were assigned to one of three groups: In Group I (n = 13), the state of the endometrium corresponded to the phase of the menstrual cycle; in Group II (n = 21), the women had predominantly glandular or cystic hyperplasia of the endometrium, glandular-fibrous polyps and/or cystic degeneration of the endometrium without atypia, and in Group III (n = 6), the women had atypical endometrial hyperplasia and adenocarcinoma. Immunohistochemistry used to examine PTEN expression showed its high expression in normal endometrium in Groups I and II patients who did not have MS, but had a history of one or two relapses of EH. Moderate, low or no PTEN expression was seen in Groups II and III patients with abnormal endometrium who had MS and a history of more than 2-3 relapses of EH (р < 0.05).

Conclusion: The evaluation of PTEN expression by immunohistochemistry is a promising assay for early detection of precancerous lesions of the endometrium and endometrial cancer.

Keywords: PTEN expression, endometrial hyperplasia (EH), metabolic syndrome (MS).

Литература

1. Гаспарян А.М. Прогнозирование гиперпластических заболеваний у женщин постменопаузального возраста: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2007. 21 с.

2. Оптимизация лечебной тактики у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия/ А. О. Духин [и др.]// Мат-лы Х Всерос. науч. форума «Мать и дитя». М., 2009. С. 303.

3. Оценка состояния здоровья женщин с метаболическим синдромом в постменопаузальном периоде / Р. Л. Гуменюк [и др.] // Актуальные вопросы неотложной медицинской помощи гинекологическим больным: Матер. конф. ГВКГ им. Н. Н. Бурденко. 2004. С. 17-19.

4. Рекомендации экспертов ВНОК по диагностике и лечению метаболического синдрома: Второй пересмотр. ВНОК, М., 2009. с. 54.

5. Чернышова А. Л. Прогноз и особенности клинического течения рака эндометрия на фоне метаболического синдрома: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2009. 23 с.

6. Altered PTEN expression as a diagnostic marker for the earliest endometrial precancer/ G. L. Mutter [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. 2008. Vol. 92. № 11. P. 924-930.

7. Doll A. Novel molecular profiles of endometrium cancer — new light throuth old windows / A. Doll, M. Abal, M. Rigau // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008. Vol. 108. № 3-5. P. 221-229.

8. Immunohistochemical expression of PTEN and $-catenin for endometrial intraepithelial neoplasia in Japanese women / Y. Norimatsu [et al.] // Ann. Diagn. Pathol. 2007. Vol. 11. № 2. P. 103-108.

9. Immunohistochemical expression of PTEN in normal, hyperplastic and malignant endometrium and its correlation with hormone receptors, bcl-2, bax and apoptotic index/ N. Kapucuoglu [et al.] // Pathol. Res. Pract. 2007. Vol. 203. № 3. P. 153-162.

10. Joshi A. Adenovirus mediated homozygous endometrial epithelial Pten deletion results in aggressive endometrial carcinoma / A. Joshi, L. H. Ellenson // Exp. Cell Res. 2011. Vol. 317. № 11. P. 1580-1589.

11. Lacey J. V. Endometrial hyperplasia and the risk of progression to carcinoma/ J. V. Lacey, V. M. Chia // Maturitas. 2009. Vol. 63. № 1. P. 39-44.

12. Lack of PTEN expression in endometrial intraepithelial neoplasia is correlated with cancer progression / J. P. A. Baak [et al.] // Hum. Pathol. 2008. Vol. 36. № 5. P. 555-561.

13. McCampbellA. S. Over expression of the insulin-like growth factor I receptor and activation of the AKT pathway in hyperplastic endome-trium / Clin. Cancer. Res. 2008. Vol. 12. № 21. P. 6373-6378. ■