CC BY
56
Анализ частоты встречаемости папилломавирусной инфекции в гиперпластических процессах эндометрия и аденокарциномах
Метельская М.А., Рогов Ю.И.
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
Metelskaya M.A., Rogov YI.
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Analysis occurrence rate of the papillomavirus infection in endometrial hyperplasia and adenocarcinoma
Резюме. Изучена распространенность папилломавирусной инфекции и ее патогенетическая роль в онкотрансформации. Проведен анализ экспрессии маркера HPV-коктейль в нормальном, гиперпластическом эндометрии и аденокарциномах Grade 1,2,3 от 68 пациенток. Частота выявляемости HPV-инфекции при неопластических процессах выше, причем наиболее высокий процент положительного результата отмечен в умереннодифференцированных аденокарциномах. По мере развития злокачественного процесса увеличивался и уровень экспрессии маркера HPV. Отмечены достоверно значимые различия в более высоком уровне экспрессии маркера пролиферативной активности при положительном окрашивании эпителия желез к HPV при некоторых нозологических процессах в эндометрии. Полученные данные позволяют говорить о значительном распространении различных типов вируса в эндометриальной ткани с учетом гетерогенности диагностического реагента.
Ключевые слова: гиперплазия эндометрия, биомолекулярные маркеры папилломавирусной инфекции, HPV-коктейль, иммуноморфологиче-ское исследование, уровень экспрессии HPV.
Summary. The authors of the article analyzed the prevalence of HPV infection and its pathogenic role in oncogenesis. Analyzed the expression of the marker HPV-cocktail in normal, hyperplastic endometrial adenocarcinomas and Grade 1, 2, 3 of the 68 patients. The frequency of detection of HPV infection in neoplastic processes above, with the highest percentage of positive results occurred in moderately differentiated adenocarcinoma. With the development of malignancy and increased the level of expression of the marker HPV. There was a significant difference in the relevant higher-level expression of the marker of proliferative activity with positive staining of epithelial glands to HPV at some nosological processes in the endometrium. These data have identified a significant spread of the virus in different types of endometrial tissue wtth the heterogeneity of the diagnostic reagent. Keywords: endometrial hyperplasia, biomolecular marker of human papillomavirus infection, HPV-cocktail, immunomorphological study, level of expression of HPV.
Вирус папилломы человека (HPV -human papillomavirus) ассоциируется с доброкачественными и злокачественными поражениями кожи, полости рта, языка, легких, внутриэпителиальны-ми протоковыми папилломами молочной железы. HPV - мелкие ДНК-вирусы, характерная особенность которых заключается в способности вызывать пролиферацию эпителия кожи и/или слизистых оболочек [1, 2]. Доказано существование 100 типов, отличающихся по строению ДНК. Вирусы папилломы человека, поражающие аногенитальную область, относятся к разряду возбудителей инфекций, передающихся половым путем, но в отличие от других микроорганизмов, вызывающих генитальные инфекции, папилломавирусы являются опухолерод-ными, способствующими образованию доброкачественных и злокачественных опухолей. Поэтому понятен не только биологический и медицинский интерес к папилломавирусам, но также важно приобретение знаний об этой группе вирусов
как социально значимых агентов, причастных к смертельным заболеваниям у лиц молодого возраста [2, 4].
Инфицирование некоторыми типами HPV так называемыми онкогенными HPV связано с основным фактором риска последующего развития рака шейки матки. Высокая степень риска возникновения цервикальной интраэпителиальной нео-плазии (CIN) относится к HPV типов 16, 18. HPV в женских половых путях связывают с поражением эпителия шейки матки. Инфекционный агент наиболее надежно обнаруживается с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), при наличии гистологических изменений в эпителиальных клетках, состоящих из многоядерности (multinucleation) и кой-елоцитоза [5, 7, 8]. Типичный пример гиперпластического процесса, вызванного этиотропным вирусом папиллом, - остроконечные (accuminata) кондиломы (связывают с 6, 11, 42-44, 54 типами вируса) и плоскоклеточный рак вульвы, влагалища и шейки матки. По мере изучения HPV
выяснилось, что риск злокачественного перерождения связан с несколькими типами вируса. Они обозначены как вирусы высокого риска онкогенного заболевания. Это типы HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68. Перечень типов HPV онкогенного риска расширяется за счет уточнения строения ДНК и появления новых типов промежуточного риска. Вирусами низкого риска остаются 5 типов HPV - 6, 11, 42, 43, 44. Отмечено, что тип 16 наиболее часто встречается в тканях плоскоклеточного рака шейки матки, а тип 18 - в ткани железистого рака - аденокарциномы [8, 11].
Папиломавирусная инфекция может быть клинически выраженной, протекать субклинически или быть латентной. При клинической и субклинической инфекции имеются резко или слабо выраженные изменения эпителиальных клеток. Это увеличенные в размерах вакуолизиро-ванные клетки со светлой цитоплазмой и перинуклеарным светлым ободком в виде нимба (nalo). Ядра клеток пикнотичны,
гиперхроматичны. Присутствуют двух- и многоядерные клетки. При микроскопии гистологических препаратов отчетливо видно утолщение эпителия, акантоз, ги-перхроматоз и папилломатоз [5, 9].
При опухолевой трансформации, например, при CIN (CIN-1, CIN-2, CIN-3) видно атипичное созревание клеток, кой-лоцитоз обнаруживается в верхней трети эпителия, нередко с очаговым его распространением. Имеет место полиморфизм ядер, увеличенное количество митозов и атипичные митозы. При латентной инфекции измененных клеток не видно, однако иммуногистохимическими и молекулярно-биологическими методами выявляется наличие антигенов HPV или их ДНК.
У лиц с нормальным иммунитетом наблюдается спонтанное излечение примерно в 2/3 случаев. Дефекты иммунитета влекут за собой повышенную выявля-емость заболевания и персистирующее течение. Ряд исследователей полагает, что 10-15% всех раков у человека связаны с папилломавирусами [3, 11, 12]. В этом контексте HPV-инфицирование почти отождествляется со злокачественными клетками (система Bethesda, включающая классификацию на основе атипичных койелоцитов (koilocytotic) CIN класса I (HPV I) в категорию плоскоклеточных интраэпителиальных поражений^БИ)) [13, 14]. Ряд исследований показал наличие HPV в аденокарциномах эндометрия [6-8] ткани, близкой к многослойному плоскому эпителию эктоцервикса морфогенентически. Если железистые опухоли эндометрия включают наличие плоскоклеточной метаплазии, то в ней проявляются морфологические признаки инфекции HPV [9, 10]. Поражения слизистых гениталий, некондиломатозные поражения ассоциированы с 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 51, 52, 55, 56, 57-59, 61, 64, 67-70 типами вируса, карцинома - с типами 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 66, 68.
В развитие опухолевого процесса большую роль играют структурные белки HPV -Е6 и Е7, имеющиеся в составе только HPV высокого онкогенного риска, их называют онкопротеинами. Эти белки разрушают сигнал, предупреждающий генетические повреждения и инактивируют клеточный надсмотр, который минимизирует генетическую нестабильность. Вследствие этого прекращается элиминация клеток с начальными вредными изменениями, связанными с развитием неоплазий.
Спорным моментом до настоящего времени считается способность вируса инициировать новообразования эндо-
метрия при его несомненном наличии в ткани [6, 9, 11-13]. До сих пор только известно, что HPV не имеет отношения к прогностическим параметрам и выживаемости [7], имеется мало информации в отношении активности вируса, присутствующего в гиперплазированном эндометрии [4, 8]. Не разработана оценочная количественная шкала наличия HPV в эндометрии (при помощи ПЦР) и его потенциальная роль в генезисе неопластических процессов. Учитывая, что HPV-инфекция предшествует развитию рака [14], в части исследований HPV был обнаружен реже в атипичной гиперплазии, чем в простых эндометриальных гиперплази-ях, которые не связывают с развитием рака. Это, видимо, означает, что ВПЧ не может инициировать онкогенные события в эндометрии через последовательность «атипичная гиперплазия - неоплазии» [4, 8]. Отдельно Czerwenka и др. сообщили, что не обнаружили четкой связи между HPV-инфекцией и эндометриоидными карциномами с плоскоклеточным компонентом и аденоакантомами [9]. Было высказано предположение, что возможной причиной плоскоклеточной метаплазии эндометрия является наличие вируса. Очаги плоскоклеточной дифференци-ровки в некоторых эндометриоидных карциномах были положительными на HPV. Образование в карциномах структур, называемых морулами, некоторые авторы связывают с репликацией HPV-вируса в легких [10-14], щитовидной железе [2] и толстой кишке [6, 8]. Считается, что наличие HPV-инфекции обусловливает плоскоклеточную дифференцировку в железистой ткани. Появление морул в эндометрии в настоящее время считается процессом, аналогичным таковому в слизистой бронхов в легких.
Обнаружением HPV в эндометрии человека, будь то при гиперпластических (ГПЭ) или опухолевых процессах, объясняют наличие цитопатического эффекта (multinucleation и koilocytotic, атипии) при наличии метапластических изменений. Тем не менее HPV типа 16 и 18, обнаруживаются методом ПЦР в эндометрии, не имеющем характерных клеточных изменений при HPV-инфекции в простом или псевдомногослойном эпителии [8, 12]. При наличии папилломавирусной инфекции у пациенток с ГПЭ имеется значительное снижение процессов апоптоза, повышение маркеров пролиферации, ан-гиогенеза, снижение количества рецепторов к прогестерону, по нарастающей от простой гиперплазии к раку эндометрия, которые являются этапами развития про-
лиферативных процессов по сравнению с аналогичными изменениями эндометрия у больных без HPV
Цель исследования - выявление частоты ассоциации HPV с пролифератив-ными и гиперпластическими процессами эндометрия с точки зрения кофакторов канцерогенеза; выяснение и сравнение патогенетической роли экспрессии биомолекулярных маркеров процессов апоптоза, пролиферации, рецепторов эстрогена, опухоль-супрессорных белков, регулирующих процессы клеточного деления и апоптоза в гиперпластических и неопластических процессах эндометрия при наличии и отсутствии HPV Материалы и методы Было проведено иммуногистохими-ческое исследование гистологического архивного операционного и биопсийно-го материала эндометрия с различными патологическими процессами от 68 пациенток в возрасте от 27 до 73 лет с применением биомолекулярного маркера моноклональных мышиных антител к HpV (clone K1H8), включающих коктейль HPV типов 6,11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56, 58 (производитель «Thermo Fisher Scientific», Франция). Параллельно сравнивались показатели экспрессии маркеров пролиферации Ki-67, Er-a, p53, гена супрессо-ра - PTEN (регулятора клеточного деления и апоптоза), PAX-2 (гена, активность которого подавляет опухолевую трансформацию) и выявления зависимости уровня экспрессии этих маркеров при наличии HPV антигена в ткани эндометрия. Анализ данных в зависимости от возраста, наличия сопутствующей генитальной патологии (миомы матки, эндометриоза, CIN шейки матки, опухолей яичников) не проводился.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ SPSS Stаtistics 17.0, дополнительные расчеты производились в Microsoft Excel. Для оценки достоверности различий между группами использовался непараметрический критерий Крускала-Уолес-са и t-тест, для количественных признаков также Хи-квадрат. Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения р < 0,05.
Результаты и обсуждение При иммуноморфологическом исследовании нормального пролиферативного эндометрия положительная экспрессия была отмечена в 53,3% случаев, в 87,5% была оценена как низкая или слабая. При анализе результатов окраски материала простой или железисто-кистозной
№12 • 2012
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |79
Сложная атипическая гиперплазия с микроочагами плоскоклеточной метаплазии. Позитивная ядерная реакция на наличие экспрессии HPV. Система визуализации EnVision, chromogene DAB, производитель Dako, ув. х 200
Участок плоскоклеточной метаплазии в аденокарциноме. Позитивная ядерная реакция на наличие экспрессии HPV. Система визуализации EnVision, chromogene DAB, производитель Dako, ув.х 200
Ж .W
i >
гиперплазии наличие HPV-инфекции было в 50% случаев. В 71,4% случаев уровень экспрессии антител был низким, в 14,3% - высоким (более 30% клеток). Для сложной неатипической гиперплазии положительная экспрессия HPV отмечена в 42,9% материала с этой патологией, в половине случаев уровень экспрессии был оценен как высокий и гистологически сочетался с микроочагами плоскоклеточной метаплазии эпителия желез эндометрия.
В атипической гиперплазии положительное окрашивание было в 61,5% материала (рис. 1), в 37,5% сочеталось с метапластическими изменениями эпителия.
В 50% материала уровень экспрессии расценен был как низкий (10% и менее окрашенных клеток), в 37,5% - как высокий. Для материала высокодифференци-рованной аденокарциномы (ВД) положительная экспрессия наличия HPV имела место в 66,7% результатов. Уровень экспрессии был расценен как высокий в
|Ш V- • ■ /»•
Ж> v.. №
37,4%, в таком же количестве случаев экспрессия была расценена как низкая, в половине положительных случаев в материале имели место метаплазии эпителия. Экспрессия маркера в умеренно-дифференцированных (УмД) (рис. 2) и низкодифференцированных карциномах (группы объединены) отмечена в 71,4% случаев этой нозологии и в 30% сочеталась с плоскоклеточной метаплазией эпителия с формированием морул (рис. 3). Высокий уровень экспрессии антител к антигену HPV был отмечен в 40% материала.
Анализ экспрессии антител к HPV выявил достоверно значимые различия в ряду сравнения при пролиферации ^ умереннодифференцированной аденокарциноме (р = 0,005) (рис. 4), простой гиперплазии ^ умереннодифферен-цированной аденокарциноме (р = 0,02), высокодифференцированной карциноме ^ умереннодифференцированной аде-нокарциноме (р = 0,03) (рис. 5).
Достоверно значимые различия в
уровнях
Рисунок 3
Частота встречаемости положительной и выраженной экспрессии к HPV-инфекции при различных патологических процессах в эндометрии
экспрессии Ki-67 и наличие только положительной имму-ногистохимической реакцией в тканях для HPV были выявлены при простой (желези-сто-кистозной) гиперплазии (Хи-квадрат Пирсона 0,014), атипической гиперплазии (Хи-квадрат Пирсона 0,043), т.е. при наличии в ткани эндометрия положительного окрашивания на HPV следует ожидать достоверно значимые более высокие уровни экспрессии маркера пролиферации Ki-67. При сравнении уровня экспрессии данного маркера при других нозологиях в эндоме-
трии достоверных различий в зависимости от положительной окраски на HPV получено не было. Не было получено статистически значимой разницы между количественной экспрессией Ki-67 и количественной оценкой уровня HPV При анализе уровня экспрессии Er-a в зависимости от положительного или отрицательного HPV-окрашивания без учета нозологии были получены достоверно значимые значения увеличения экспрессии Er-a (критерий Крускала-Уоллеса р = 0,025). Однако с учетом того, что мы не имели клинических данных о проводимом лечении, анамнестических данных об эндокринно-метаболических нарушениях, статистический показатель можно считать дискутабельным.
Анализ уровней экспрессии гена p53, гена супрессора - PTEN, PAX-2 («подавителя опухоли») при положительном или отрицательном результате окрашивания маркера HPV не дал статистически значимых результатов при сравнении материала с нормальной пролиферацией эндометрия, простой, сложной, атипической гиперплазии, а также в дифференцированных аденокарциномах (во всех анализируемых группах р > 0,05). То есть различные уровни экспрессии белка р53, PTEN и PAX-2 при разных нозологических формах в эндометрии не зависели от наличия HPV-антигена в ткани в данном исследовании. Иммуно-морфологически определялось только наличие антигена, но не репликационная активность вируса и активность течения вирусного процесса.
Таким образом, полученные данные позволяют говорит о значительном распространении различных типов вируса в эндометриальной ткани с учетом гетерогенности диагностического реагента. Взаимосвязь между экспрессией указанных биомолекулярных маркеров и морфологическими формами пролифе-ративных процессов эндометрия при наличии HPV нами определена только для маркера пролиферативной активности. Гистологический материал с плоскоклеточными метапластическими изменениями при иммуноморфологической диагностике имел положительную экспрессию маркера HPV При алгоритме обследования больных при гиперплазиях можно использовать в практике иммуногисто-химический метод для HPV как более дешевый и доступный, с целью полной комплексной диагностики и возможной прогностической роли в патогенезе гиперпластических процессов. Изучение данного научного подхода перспективно
Рисунок 4
Распределение зависимости экспрессии HPV при нормальном пролиферативном эндометрии и умереннодифференцирован-ной аденокарциноме
Рисунок 5
Распределение зависимости экспрессии HPV при простой гиперплазии, высокодифферен-цированной и умереннодифференцированной аденокарциноме
п Median О 25%-75% Т Min-Max
в отношении ранней диагностики и профилактики раннего рака эндометрия.
Выводы:
1. Положительное иммуногистохи-мическое окрашивание наличия HPV в эндометрии, наиболее часто отмечено при комплексной гиперплазии с атипией и аденокарциномах эндометрия. Частота выявляемости HPV-инфекции при неопластических процессах выше, причем наиболее высокий процент положительного результата отмечен в умереннодиф-ференцированных аденокарциномах. По мере развития злокачественного процесса увеличивался и уровень экспрессии маркера HPV. Подобные изменения могут свидетельствовать о развитии местного и общего иммунодефицита при аденокар-циномах.
2. Для простой гиперплазии без ати-пии и атипической гиперплазии отмечены достоверно значимые различия в более высоком уровне экспрессии маркера
пролиферативной активности при положительном окрашивании эпителия желез к HPV. Экспрессия маркеров к рецепторам эстрогена, белку р53, гену PTEN и PAX-2 при гиперпластических и неопластических процессах эндометрия не имела статистически значимой разницы от наличия папилломавирусной инфекции.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Алексеева М.И., Фанченко Н.Д., Новиков Е.А., Маргиани Ф.Р. // Акушерство и гинекология. -1995. - № 5. - С. 35-37.
2. Баткаев Э.А., Кицак В. Я., Корсунская И.М., Ли-пова Е.В. Вирусные заболевания кожи и слизистых: учеб. пособие. - М., 2001. - 180 с.
3. Бохман Я.В. Руководство по гинекологической онкологии. - Л., 1989. - 305 с.
4. Лысенко О.Н. // Рос. вестн. акушера-гинеколога. - 2003. - Т. 3, № 2. - С. 16-20.
5. Пестрикова Т.Ю., Безрукова Н.И., Ивашков Е.А., Муранова В.Н. // Дальневосточ. мед. журн. - 2001. -№ 2. - С. 50-53.
6. Anderson MC, Robby S.J., Russell P. et al.
Endometritis, metaplasia, polyp and miscellaneous changes // Pathology of the female reproductive tract / S.J. Robby, M.C. Anderson, P. Russell (eds.). - London, 2002. - P. 285-303.
7. Buckley C.H. Normal endometrium and nonproliferative conditions of the endometrium // Haines and Taylor obstetrical and gynaecological pathology / H. Fox, M. Wells (eds.). - 5th ed. - London, 2003. -P. 391-441.
8. Chinen K, Kamiyama K, Kinjo T. et al. // J. Clin. Pathol. - 2004. - Vol. 57. - P. 918-926.
9. Czerwenka K, Lu Y., Heuss .et al. // Gynecol. Oncol. - 1996. - Vol. 61. - P. 210-214.
10. Jiang L, Malpica A, Deavers MT. et al. // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2010. - Vol. 29, N 2. - P. 146-156.
11. O'Leary J.J., Landers R.J., Crowley M. et al. // Hum. Pathol. - 1998. - Vol. 29, N 4. - P. 383-389.
12. Prat J. Female reproductive system // Anderson's pathology / I. Damjanov, J. Linder (eds.). - 10th ed. - St. Louis, 1996. - P. 2231-2309.
13. Silverberg S.G., Mutter G.L., Kubik-Huch P.A., Tavassoli FA. Endometrial Tumours, and related Lesions // WHO Classifications of Tumours, Pathology & Genetics. Tumours of the Breast and Female Genital Organs. - IARC Press, 1994. - P. 221-232.
14. Walboomers J.M.M., Jacobs M.V., Manos M.M. et al. // J. Pathol. - 1999. - Vol. 198. - P. 12-19.
Поступила 09.10.2012 г.
17 лет мы вместе с вами во имя здоровья людей
Медицинские новости
Спасибо всем читателям, оформившим подписку на I полугодие 2013 г.
Для тех, кто не успел, -
индексы журнала в каталоге РУП «Белпочта» (подписка осуществляется с любого ближайшего месяца): 74954 - для индивидуальных подписчиков; 749542 - для организаций Осуществляется также подписка на электронную версию журнала.
Вся полезная информация в разделе «Подписка» - на сайте www.mednovosti.by
А
