CC BY
179
сравнительная иммуноморфологическая характеристика гиперпластических процессов эндометрия и аденокарцином
метельская м.А., Рогов Ю.И.
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
Metelskaya M.A., Rogov Yu.I.
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Comparative immunomorphological data of endometrial hyperplasia and endometrial adenocarcinomas
Резюме. В статье проанализированы существующие в морфологической практике методики дифференциальной диагностики гиперплазий эндометрия. Дана характеристика биомолекулярных маркеров Кі-67 и р53 и описана их роль в регуляции клеточного деления, апоптоза и механизме озло-качествления клетки. Авторы проанализированы результаты экспрессии Кі-67 и р53 в нормальном пролиферативном, гиперпластическом эндометрии и аденокарциномах Grade 1, 2, 3 от 27 пациенток. Уровень экспрессии маркера пролиферативной активности Кі-67 имел достоверно значимые различия в железистом компоненте эндометрия при гиперпластических процессах и аденокарциномах. В 24% случаев аденокарцином и при сложной неатипической гиперплазии высокий уровень пролиферативной активности сочетался с выраженной экспрессией Er-a. Значения экспрессии белка р53 были нулевыми или низкими в преобладающем количестве случаев при неопухолевых нозологиях и нормальной пролиферации. Экспрессию белка р53 можно считать самостоятельным диагностически значимым фактором в ряду атипическая гиперплазия ^ высокодифференцированная аденокарцинома. Не было отмечено достоверно значимых различий в уровнях экспрессии р53 в зависимости от возраста, наличия другой генитальной патологии, положительного окрашивания антигена HPV. Ключевые слова: гиперпластические процессы эндометрия, эндометриоидная аденокарцинома, био-молекулярные маркеры пролиферативной активности Кі-67, р53 - регулятор клеточного деления и апоптоза, анализ уровня экспрессии Кі-67, р53.
Summary. In this article analyzes the existing practice in the morphological methods of differential diagnosis of endometrial hyperplasia. The biomolecular markers Ki-67 and p53 was characterized, and described their role in the regulation of cell division, apoptosis and the mechanism of cell malignancy. The authors analyzed the results of the expression of Ki-67 and p53 in normal proliferative, hyperplastic endometrium and adenocarcinoma Grade 1, 2, 3 of 127 patients. The level of expression of markers of proliferative activity of Ki-67 expression was significantly significant differences in the glandular component of the endometrial hyperplastic processes and adenocarcinomas. In 24% cases of adenocarcinoma and complex hyperplasia high proliferative activity combined with a strong expression of the Er-a. The values of p53 protein expression were zero or low in the vast number of cases with non-neoplastic nosology and normal cell proliferation. Expression of p53 protein can be considered as a separate diagnosticaliy significant factor in a number of atypical hyperplasia ^ highly differentiated adenocarcinoma. There was no significantly significant difference in expression levels of p53, depending on age, presence of other genital pathology positive staining of the antigen HPV.
Keywords: endometrial hyperplasia, endometrial adenocarcinoma, biomolecular markers of proliferative activity of Ki-67, p53 - a regulator of cell division and apoptosis, analysis of the expression level of Ki-67, p53.
Медицинские и социальные аспекты проблемы рака эндометрия (РЭ) приобрели исключительное значение в настоящее время, вызывая интерес многих исследователей: гинекологов, онкологов, морфологов, эндокринологов. На сегодняшний день достигнут существенный прогресс в вопросах патогенеза, диагностики и лечения РЭ. В частности, аргументирована концепция о патогенетической неоднородности РЭ, существовании гормонозависимого и автономного типа [1, 16].
Появились отдельные исследования, посвященные скринингу РЭ в группах риска [3, 6, 9], которые, к сожалению, еще не нашли широкого распространения в практике, но рекомендованы экспертами ВОЗ для детального изучения и оценки их возможного влияния на заболеваемость и смертность. Патогенетический подход наиболее эффективен по отношению к раку органов репродуктивной системы у женщин [10, 12, 13]. Многие формы начального рака возникают на фоне гиперплазии с атипией и рака на месте, при которых не клинические, а морфологические критерии являются основой ранней диагностики. Часть злокачественных процессов возникает de novo, минуя фазу гиперплазии [4, 5, 8, 9]. Ориентация выявляемости на клинические симптомы делает технологию ранней диагностики малоуправляемой,
а выявление начальных форм рака в значительной мере случайной. В ряде морфологических школ разноречивы морфологические критерии дифференциальной диагностики атипической гиперплазии от вну-триэндометриального инвазивного рака, нет единого мнения о морфологических и биологических особенностях микроинвазивного РЭ [2, 3]. В структуре злокачественных опухолей у женщин РЭ занимает 3-е место, а темпы роста показателей заболеваемости РЭ значительно выше таковых при других злокачественных опухолях репродуктивной системы у женщин. Показатели смертности от РЭ невысоки, однако в мире за год из 100 000 больных РЭ умирает каждая 10-я [1, 10]. Современный этап изучения гиперпластических процессов эндометрия как риска развития злокачественного процесса характеризуется определением роли факторов роста в реализации аутокринных влияний на опухоль [7]. В основе развития гиперплазий лежат нарушения процессов пролиферации и апоптоза клеток, которые регулируются клеточными и внеклеточными компонентами на молекулярном уровне. Причем влияние гормонов на трансформацию в рак больше реализуется путем стимуляции клеточной пролиферации, чем действием на апоптоз. Факторы, способствующие повышению кле-
точной пролиферации в эндометрии, следует рассматривать как факторы риска развития патологических процессов в матке. Причины выраженной пролиферативной активности клеток эндометрия многообразны: дисгормональные нарушения (эстрогены сочетанно стимулируют пролиферативный потенциал клеток путем индуцирования факторов роста и их рецепторов, а также регулируют процессы ангиогенеза) [4, 15]; повреждения клеток различного генеза, вследствие которых формируются инфильтраты, состоящие из макрофагов, лейкоцитов, лимфоцитов и др., индуцируют как факторы, стимулирующие рост стромы, так и про-теолитические ферменты, разрушающие экстрацеллюлярный матрикс [7]; воспалительные вирусные заболевания, ингибирующие апоптоз, что позволяет вирусам закончить цикл репликации до гибели клетки и тем самым ускорить трансформацию поврежденных клеток [4, 5]; метаболические нарушения. При действии патологического стимула происходят адаптационные изменения в эндометрии (гиперпластический процесс) [1, 5], из-за генотипа изменения приобретают патологический характер. При этом важно понимать, что гиперпластические процессы эндометрия могут трансформироваться в злокачественные. При активной пролиферации внутритканевые
факторы посредством определенных механизмов нарушают генетический контроль над дифференци-ровкой клеток. Эти изменения лежат в основе атипической гиперплазии эндометрия и в определенных условиях могут явиться причиной формирования неопластических процессов в слизистой матки. В этом ракурсе особое значение приобретает проблема онкологической настороженности. Исследования последних лет свидетельствуют, что при РЭ существуют как морфологические, так и иммуноги-стохимические критерии, частью спектра которых является изучение пролиферативной активности клеток при гиперпластических процессах, атипической гиперплазии и аденокарциномах, а также гормонозависимость, которая сопутствует прогрессированию этих процессов. Из-за частой сочетанной патологии в миометрии, потери гормональной зависимости эндометрия заставляют по-новому взглянуть на вопросы этиологии и патогенеза данных заболеваний, а также закономерности их развития с целью оптимально достоверной морфологической диагностики и определения оптимальной тактики лечения [11, 14].
Маркер пролиферативной активности Ю-67 - белок, работающий как «молекулярный таймер», регули-
рующий клеточную пролиферацию. Обнаружена взаимосвязь между его высокой экспрессией, низкой гистологической дифференцировкой опухоли и плохим клиническим прогнозом не только при РЭ, но и при других карциномах, таких как рак яичника, легкого, мочевого пузыря [5, 8]. Применение моноклональных антител к Ю-67 было затруднено тем, что антиген, определяемый с их помощью, весьма нестойкий и разрушается при термической обработке тканей и фиксации в формалине [5, 16, 17]. Появление антител «второго поколения», наиболее перспективным из которых оказался М1В-1, позволило успешно использовать их для исследования депарафиниро-ванных блоков и рекомендовать для применения в практической морфологии [15]. Одну из ведущих ролей в онкоморфологической диагностике придают изменению функции белка р53 и его влиянию на прогноз рака различного генеза. р53 - продукт гена-супрессора, регулирующего прохождение нормального клеточного цикла; при необходимости репарации ДНК он функционирует как супрессор пролиферации клеток. Основная функция гена р53 - регуляция процессов деления клетки и контроль стабильности генома. р53 постоянно синтезируется в клетках, но является короткоживущим белком. Мутации гена р53 ведут к
сверхэкспрессии этого белка, который иммуногистохимическим путем выявляют с помощью анти-р53 антител [5, 6]. Мутации р53 играют роль в онкогенезе, их ассоциируют с агрессивностью заболевания и с устойчивостью к терапии, часто их обнаруживают в солидных опухолях человека. По данным литературы, при РЭ сверхэкспрессию р53 определяют в 10% случаев, при атипической железистой гиперплазии этот белок выявляют реже, и считается, что нарушение функции р53 является важным фактором в патогенезе рака [5, 11, 14]. Ряд исследований показал влияние р53 на миграционную способность клеток. В эпителиальных клетках р53 способен к подавлению экспрессии Е-кадгерина на поверхности клеток, что ведет к нарушению межклеточных контактов и повышению миграционной способности и инвазии раковых клеток. Регулируя активность гена VEGІ7 р53 может стимулировать рост и миграцию лимфатического эндотелия, индуцируя лимфангиогенез в опухоли и регионарных лимфоузлах, что способствует лимфогенному метастазированию [6, 14, 16].
цель исследования - анализ существующих в морфологической практике методик дифференциальной диагностики гиперплазий эндометрия; характеристика биомоле-кулярных маркеров Ю-67 и р53 и их роли в регуляции клеточного деле-
ния, апоптоза и механизме озлока-чествления клетки.
материалы и методы Нами был исследован гистологический архивный операционный и био-псийный материал (парафиновые блоки) от 127 пациенток в возрасте от 27 до 73 лет с использованием биомолекулярных маркеров Ki-67 (М1В-1), р53 (DO-7), а также возможность зависимости экспрессии этих маркеров от уровня Er-а (Dako, Дания). Кроме того, материал от 48 пациенток был окрашен с использованием маркера HPV (K1H8, Thermo scientific Pierce biotechnology). Диагностически в части материала от одной пациентки имело место сочетание нормального пролиферативного эндометрия и гиперпластического процесса, либо аденокарциномы. В связи с этим экспрессия маркеров рассчитывалась для каждого патологического процесса отдельно. Расчет проводился с использованием компьютерного анализатора изображений ImageJ, версия 3.41-3.43 (основанная на платформе Java программа для анализа и обработки изображений, разработанная в National Institutes of Health; разработчик Wayne Rasband (NIH) ОС Any (Java-based); лицензия Public Domain; сайт http://rsb.info.nih. gov/ij/; исходный код ImageJ находится в свободном доступе). Расчет интенсивности экспрессии проводился
как процентное количество позитивно окрашенных клеток. Подсчет ан-тигенпозитивных клеток производили в 10 полях зрения при увеличении окуляра 40, учитывали локализацию иммунореактантов и интенсивность их окрашивания, которая в свою очередь оценивалась полуколичествен-ным способом. [руппы срезов для исследования были сформированы следующим образом: гистологическая норма (пролиферация, секреция, атрофия), простая гиперплазия (включалась железисто-кистозная гиперплазия), сложная гиперплазия, атипическая (в соответствии с классификацией ВОЗ 1994, 2003 гг.), эндометриоидные аденокарциномы высокой, умеренной и низкой степени злокачественности. Во всех случаях оценивалась ядерная окраска в железистом компоненте эндометрия, обращалось внимание на степень ядерной окраски в строме. Расчет интенсивности экспрессии проводился как процентное количество позитивно окрашенных клеток. Пролиферацию оценивали по относительному числу окрашенных клеток со средней и интенсивной ядерной реакцией на Ю-67 с разделением результатов на три группы: низкий уровень пролиферации - до 10% Ю67-позитивных клеток, средний - от 10 до 30%, высокий - более 30% Ю-67-позитивных клеток. Таким же образом оценивали уро-
вень экспрессии р53. Результаты окрашивания сравнивали с уровнем экспрессии эстрогена, который определялся в пределах 0-300 (010 - отрицательный; 10-100 - слабо положительный; 100-300 - положительный). Индекс метки оценивался субъективно как слабая, умеренная или выраженная окраска (шкала HistoScore). Анамнестические данные на пациенток были минимальными и включали возраст, причину кюретажа либо гистерэктомии, наличие другой генитальной патологии, такой как миома матки, эндо-метриоз, кистомы яичников; CIN 2-3 или рак шейки матки, рак молочной железы (операционный материал). В 6 случаях аденокарцином эндометрия имела место другая злокачественная патология (рак шейки матки - 2 пациентки, рак толстой кишки - 1, рак щитовидной железы
- 1, аденокарцинома яичников - 1, рак молочной железы - 1). Мы не имели сведений о наличии у пациенток эндокринно-метаболических нарушений, в том числе ожирения, сахарного диабета и гипертонической болезни, которые считаются характерным клиническим фоном у большинства больных РЭ, патологии овуляторного процесса, инфекционных заболеваний.
Статистические методы обработки результатов исследования проводили с использованием пакета
прикладных программ STATISTICA 6.0, дополнительные расчеты производились в Microsoft Exel. Для оценки достоверности различий между группами использовался непараметрический критерий Манна-Уитни для количественных признаков и т-тест (однофакторный анализ). Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения р < 0,05.
Результаты и обсуждение При анализе пролиферативной активности материала эндометрия в зависимости от нозологии (однофакторный дисперсионный анализ) получены достоверно значимые различия уровней экспрессии при атипической гиперплазии и умереннодифференцированной аденокарциноме, сложной гиперплазии и высокодифференцированной аденокарциноме, высокодифференцированной и умереннодифференцированной аденокарциномах, простой и атипической гиперплазиях (рис. 1). Наиболее низкие значения ядерной экспрессии были отмечены при атипической гиперплазии (15,1 ± 7,7) и высокодифференцированной (17,6 ± 10,7) аденокарциноме. Гіпер-экспрессия была отмечена в умереннодифференцированной аденокарциноме в большинстве случаев (до 80% окрашенных ядер) (рис. 2). Уровни экспрессии Кі-67 (МІВ-1) в сравнении при пролиферации (22,6
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Median І I 25%-75% I Міп-Мах СиМеге
Рис. 1.
Распределение зависимости экспрессии Кі-67 при нормальном пролиферативном эндометрии, гиперплазиях и аденокарциномах
-е-
-е-
-е-
-е-
Рис. 2. Экспрессия Кі-67 при различных нозологических процессах эндометрия, окраска - диаминобензидин и гематоксилин Майера: а - средняя фаза пролиферации, ув. х400; б - сложная неатипическая гиперплазия, ув. х200; в - атипическая гиперплазия, ув. х400;
г - умеренно дифференцированная аденокарцинома, ув. х400
- тя'ЇК*
(-V
г
* ‘
■ г : . ■ - ь ' ".«Г
у: *>./ м
. ШЫЕйш®.
а
б
Рис. 3. Экспрессия белка р53 при высокодифференцированной аденокарциноме и простой гиперплазии, окраска - диаминобензидин, гематоксилин Майера:
а - высокодифференцированная аденокарцинома, ув. х400; б - простая гиперплазия, ув. х200
± 13,5), простой (28,5 ± 10,7), сложной гиперплазии (25,9 ± 9,2) не имели достоверно значимых различий.
В 7 случаях с секрецией уровни пролиферативной активности были достаточно вариабельными и в 2 с атрофией - минимальными. В низкодифференцированных аденокарциномах экспрессия варьировалась от минимального уровня (не более 7-8% окрашенных ядер)
до высокой пролиферативной активности (40% окрашенных ядер и более). Во всех случаях окраски материала индекс метки был оценен как умеренная и выраженная интенсивность окраски. Выраженность ядерной окраски в строме эндометрия не имела значимых различий в сравниваемых группах, однако субъективно отмечен наиболее низкий уровень экспрессии
Высокоди фференцированная
Рис. 4. Распределение зависимости р53 в атипической гиперплазии и
высокодифференци-
рованной
эндометриоидной
аденокарциноме
1 - пролиферация;
2 - жкг;
3 - сложная;
4 - атипическая;
5 - высокодифференцированная;
6 - умереннодифференцированная
□ Median І I 25%-75% I Min-Max
Рис. 5.
Распределение зависимости экспрессии р53 при гиперплазиях и аденокарциномах
при атипической гиперплазии и высокодифференцированной аденокарциноме. Значения пролиферативной активности не имели достоверных различий в зависимости от возраста пациенток, наличия лейомиомы и эндометриоза, дисплазии шейки матки, положительного окрашивания антигена HPV в железах эндометрия. В 24% случаях аденокарцином высокий уровень пролиферативной активности сочетался с выраженной экспрессией Er -а (железистый компонент и строма). В отношении неопухолевой патологии такая зависимость отмечена при сложной неатипической гиперплазии. Не отмечено зависимости уровней экспрессии Кі-67 в аденокарциномах в зависимости от вну-триэндометриального и инвазивного рака (^1/2 или Т1/2 миометрия).
Анализ экспрессии белка р53 (рис. 3), выявил достоверно значимые различия при пролиферации
^ высокодифференцированной аденокарциноме (р = 0,025), простой гиперплазии ^ умереннодифференцированной аденокарциноме (р = 0,050), атипической гиперплазии ^ высокодифференцированной и умереннодифференцированной аденокарциноме (р = 0,027 в обоих случаях с округлением, рис. 4), сложная неатипическая гиперплазия ^ высокодифференцированная аденокарцинома (р = 0,039) (рис. 5). Достоверно значимые различия в уровнях экспрессии белка р53 не были выявлены при пролиферации ^ простой гиперплазии, сложной гиперплазии, атипической гиперплазии. Уровень экспрессии при этих нозологиях был расценен как нулевой и низкий. Исключение составили показатели экспрессии при сложной гиперплазии в 15% случаев, которые были трактованы как умеренные.
Интенсивность окраски практически во всех исследованных срезах была расценена как слабая либо умеренная. В низкодифференцированных аденокарциномах уровень экспрессии не превышал 30%. В 28,6% случаев при секреции была отмечена экспрессия более 30%, у пациенток имел место рак шейки матки, CIN 2-3. В 16,7% случаев со средним уровнем экспрессии при простой гиперплазии гистерэктомия проведена по поводу кистомы яичника. Не было отмечено достоверно значимых различий в уровнях экспрессии р53 в зависимости от возраста, наличия другой генитальной патологии, положительного окрашивания антигена HPV, который был положителен в 93% случаев аденокарцином. Для рака тела матки уровень экспрессии не имел достоверных различий в зависимости от степени инвазии в миометрий. Во всех случаях атипической гиперплазии окрашивание ядер было оценено как нулевое или низкое. В 9,6% случаев в аденокарциномах высокий уровень экспрессии р53 сочетался с высоким уровнем экспрессии Er-a. В 22,7% случаев аденокарцином умеренно и низкодифференцированный высокий уровень экспрессии белка р53 вместе с высокими показателями уровня экспрессии Ki-67 отмечен на фоне отсутствия либо низкого уровня экспрессии Er-a.
Выводы
1. Уровень экспрессии маркера пролиферативной активности Ю-67 имеет достоверно значимые различия в железистом компоненте эндометрия при гиперпластических процессах и аденокарциномах. Для атипической гиперплазии отмечен наиболее низкий уровень пролиферативной активности. Уровень ядерной экспрессии этого маркера в стромальном компоненте не имеет достоверно значимых различий при нозологиях. В 24% случаев аденокарцином и при сложной неатипической гиперплазии высокий уровень пролиферативной активности сочетался с выраженной экспрессией Ег-а.
2. Значения экспрессии белка р53 были нулевыми или низкими в преобладающем количестве случаев при неопухолевых нозологиях и нормальной пролиферации. Экспрессию белка р53 можно считать самостоятельным диагностически значимым фактором в ряду атипическая гиперплазия ^ высокодифференцированная аденокарцинома. В 22,7% случаев умеренно- и низкодифференцированные аденокарциномы имели иммуногистохимический профиль с высокими значениями р53, Ю-67 и редко выявляемыми рецепторами эстрогенов (Ег-а).
3. Степень экспрессии р53, Ю-67 не имела зависимости от возраста,
наличия другой гинекологической патологии, выявленного иммуногистохимически антигена HPV, глубины инвазии в миометрий при аденокарциномах (для Кі-67).
Таким образом, с учетом гетерогенности морфологического строения пролиферативного, диспластического эндометрия и аденокарцином мы изучили экспрессию наиболее характерных биомолекулярных маркеров при различных нозологиях. К сожалению, мы имели минимум анамнестических данных и допускаем, что и они были неполными и не могли расширить спектр исследований. При гиперпластических процессах и РЭ существуют как морфологические, так и иммуногисто-химические критерии, позволяющие четкое дифференцирование диагноза. Это диктует необходимость дальнейшего изучения этой проблемы и разработки протокола диагностики, включающего необходимые дополнительные объективные диагностические и прогностические критерии иммунобиологических особенностей ткани эндометрия у больных с гиперпластическими процессами и РЭ.
ЛИТЕРАТУРА
1. АшрафянЛ.А., Киселев В.И. Опухоли репродуктивных органов (этиология и патогенез). -М.: Димитрейд График Групп, 2007. - 216 с.
2. Воробьева Л.И. Диагностика и лечение доброкачественных и злокачественных опухолей матки // Матеріали III наук.-практ. конф. «Злоякісні пухлини матки та трофобласту, діагностика та лікування», Київ, 25-26 листоп. -Київ, 1999. - С. 5-8.
3. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Уточняющая диагностика при раках некоторых локализаций с использованием иммуногисто-химических маркеров: Практ. пособие. - М., 2006. - 20 с.
4. Киселев В.И, Ляшеко АА Молекулярные механизмы регуляции гиперпластических процессов. - М.: Димитрейд График Групп, 2005. - 348 с.
5. КоломиецЛ.А., Чернышова А.Л, КрицкаяН.Г, Бочкарева Н.В. Клинико-морфо-биохимические аспекты гиперпластических процессов и рака эндометрия. - Томск: НТЛ, 2003. - 116 с.
6. Немцова М.В., Землякова В.В, Кузнецова ЕВ. и др. // Архив патологии. - 2007. - Т. 69, № 2. - С. 3-6.
7. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. - М.: Медицина, 1995. - 223 с.
8. Биохимические основы патологических процессов / Под ред. Е.С. Северина. - М.: Медицина, 2000. - 304 с.
9. Татарчук Т.Ф, Бурлака Е.В. // Здоровье женщины. - 2003. - № 4 (16). - С. 107-114.
10. Чиссов В.И, Старинский В.В, РеменникЛ.В. // Рос. онкол. журн. - 1998. - № 3. - C. 88-92.
11. Bokhman J.V. // Gynecol Oncol. - 1983. - Vol. 15. - P. 10-17.
12. Cancer control: Strategies and priorities / Ed. J. Stjernsward. - Geneva: WHO, 1985.
13. Cancer facts and figures. - New York: American cancer society, 1983.
14. Maggino T, Pirrone T // Europ. J. Gynaecol. Oncol. - 1993. - Vol. XIV, N 2. - P. 1199-1206.
15. Ryan A.J, Susil В, Jobling TW. et al. // Cell Tissue Res. - 2005. - Vol. 322. -P. 53-61.
16. Silverberg S.G., Kurman R.J, Nogales .et al. Epithelial tumors and related lesions of endometrium // 17. Tumors of the breast and female genital organs / FA. Tavassoli, M.R. Stratton (eds.). - Lyon: IARC Press, 2003. - P. 221-232.
18. Sivridis E, Giatromanolaki A. // Clin. Pathol. -2004. - Vol. 57, N 8. - P. 840-844.
