CC BY
49
УДК (612.112.94+612.421:618.2-097
Роль дендритных клеток в предотвращении иммунологического конфликта матери и плода
А.в. Матвеичев, в.Ю. талаев, М.А. Ломунова, М.в. талаева,
М.Э. Цатуров, о.Н. Бабайкина, И.Е. Заиченко, ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора»
Работа поддержана РФФИ, проект № 10-04-00304-а.
Матвеичев Алексей Валерьевич - e-mail: [email protected]
В соответствии с современными представлениями иммунная система распознает любой объект, несущий признаки генетической чужеродности, и устраняет его в ходе ответа. Однако, это ключевое положение иммунологии входит в кажущееся противоречие с фактом длительного и благополучного сохранения в организме матери плода, несущего 50 процентов генов отиа. Целью настоящей работы являлось исследование роли дендритных клеток в феномене сохранения плода. Используя модели фетоплацентарного микроокружения в экспериментах in vitro, мы изучили механизмы участия дендритных клеток в предотвращении отторжения плода.
Ключевые слова: дендритные клетки лимфоциты, беременность.
Consistent with modern conceptions, adaptive immune system recognize any object, bearing signs of genetic foreignness, and eliminate it during immune response. This key immunological feature is in seeming contradiction with the fact of carrying of a semiallogenic fetus, having 50% of paternal genes. The aim of this study was to investigate the role of dendritic cells in fetus maintenance phenomenon. Using in vitro models of feto-placental microenviroment, we investigate the mechanisms of dendritic cells participation in prevention of fetal rejection.
Key words: dendritic cells, lymphocytes, pregnancy.
Введение
Способность иммунной системы различать «свое» и «чужое» является весьма важной эволюционной особенностью высших животных и человека, позволяющей им эффективно противостоять высочайшей изменчивости болезнетворных микроорганизмов. Благодаря этому объекты с признаками генетической чужеродности распознаются и устраняются в ходе иммунного ответа. Однако, сохранение матерью во время беременности плода, несущего гены, унаследованные от отца, является уникальным иммунологическим феноменом, механизмы которого полностью не поняты до сих пор. Одним из таких защитных механизмов является сдвиг продукции цитокинов при беременности. В результате изменения продукции этих гормоноподобных регуляторов наиболее опасные для плода клеточные формы иммунных реакций подавляются без существенного ущерба для общего уровня защиты организма [1]. Формирование цитокинового сдвига связывают с клетками цитотрофобласта (ТР) и контактирующей с ними уникальной ассоциацией иммуноцитов беременной матки. Клетки цитотрофобласта представлены несколькими субтипами, продуцирующими гормоны и противовоспалительные цитокины, экспрессирующими неклассические молекулы Н1А (Н1А-Е, Н1А^, Н1А^) и другие протективные молекулы: CD200 [2], Р0Ь1 (В7-Н1), Р0Ь2 (В7^С) [3], FasL [4], белки-регуляторы комплемента. Контакт с материнскими лейкоцитами происходит при внедрении цитотрофобласта в децидуальную оболочку матки. В состав материнских лейкоцитов децидуальной оболочки наряду с NK клетками, Т-лимфоцитами и макрофагами входят дендритные клетки (ДК) [5, 6, 7, 8, 9]. ДК представляют собой гетерогенную популяцию антигенпрезентирующих клеток с уникальными способностями рекрутировать наивные Т-лимфоциты в первичный иммунный ответ и индуцировать их созревание в Т-клетки-эффекторы и клетки памяти. Субпопуляции ДК различаются между собой по поверхностному фенотипу и спектру продукции цитокинов, и именно эти различия определяют судьбу активированных ими Т-клеток и баланс между Т-хелперами первого типа (Тх1), стимулирующими воспаление и отторжение ткани, и Т-хелперами второго типа 2 (Тх2)
- стимуляторами продукции антител.
Функциональные исследования на животных показывают, что во время неосложненной беременности в матке преобладают ДК - продуценты противовоспалительного цитокина ИЛ-10, содержание же ДК, продуцирующих ИЛ-12 и стимулирующих Тх1, снижено [10, 11]. У человека отмечается присутствие в эндометрии и децидуальной оболочке незрелых миелоидных ДК, способных к созреванию в продуценты ИЛ-12 [12, 10], что противоречит предположению об участии ДК в цитокиновом сдвиге беременности. Однако есть единичные данные о слабости продукции ИЛ-12 децидуальными ДК в сравнении с ДК периферической крови [12].
Целью данной работы было исследование роли ДК в формировании цитокинового сдвига беременности в экс-
периментальных моделях фето-плацентарного микроокружения in vitro.
Материалы и методы
Клетки цитотрофобласта (ТР) выделяли из проб плаценты со сроком гестации 6-11 недель. Для этого фрагменты хориона плаценты измельчали и подвергали ферментативному разрушению трипсином с ЭДТА (Gibco, USA). Клетки трофо-бласта, имеющие низкую плавучую плотность, выделяли на градиенте плотности перкола (Sigma, USA). Чистоту клеток оценивали по наличию цитокератина-7 и отсутствию классических молекул главного комплекса гистосовместимости.
Созревание ДК индуцировали в культурах моноцитов венозной крови здоровых беременных женщин путем культивирования в присутствии рекомбинантных ИЛ-4 (Biosource, USA, 20 нг/мл) и ГМ-КСФ (Biosource, USA, 100 нг/мл). Цитокины добавлялись на 1-е и 4-е сутки культивирования. Созревание ДК проводили в присутствии ТР при соотношении с ними 4:1 или без ТР. На 6-е сутки проводили активацию ДК липополисахаридом (ЛПС) S. typhi (ГИСК им. Тарасевича, Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Перед добавлением ЛПС и через сутки после него надосадки из культур собирали для определения концентрации цитокинов методом ИФА. Функциональные свойства ДК оценивали в 96-часовой смешанной культуре лимфоцитов. Оценивалась пролиферация
- по включению меченного тритием тимидина, а так же продукция ИНФ-g и ИЛ-4 - с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа надосадков из смешанных культур (Вектор-бест, Новосибирск). Так же проводилось цитофлю-орометрическое исследование экспрессии на ДК молекул HLA-DR, CD14, CD80, CD83 и CD86.
Результаты и их обсуждение
В ходе созревания ДК демонстрировали характерные морфологические изменения: увеличение размеров, снижение адгезивности и формирование крупных клеточных кластеров. На поверхности клеток отмечалось большое количество тонких цитоплазматических отростков, что является характерным признаком ДК в культуре. ДК, сокультивируе-мые с ТР (ДК-ТР), в первые дни не отличались от контрольных ДК. Но к 5-6-м суткам в культурах ДК-ТР кластеры распадались и большинство клеток приобретало веретенообразную фибробластоподобную форму (рис. 1). Содержащиеся в культуре ТР не были непосредственным источником веретенообразных клеток, так как контрольные культуры ТР демонстрировали неизменную морфологию -содержали отдельные крупные округлые клетки с мелким ядром и большим количеством цитоплазматических включений. Существенные изменения морфологии ДК-ТР наводят на предположения об изменении адгезивности и миграционных свойств исследуемых клеток. По нашему мнению, рост адгезивности может предотвращать поступление зрелых ДК из децидуа в региональные лимфатические узлы и, таким образом, ограничивать иммунный ответ на принесенные ими антигены плода.
Полученные нами ДК имели характерный фенотип -высокую экспрессию HLA-DR и CD86 и отсутствие CD14. Более 50% клеток экспрессировали CD80, более 30% - экспрессировали CD83. Для моноцитов, использовавшихся в качестве контроля, были характерны средние уровни экспрессии HLA-DR и очень высокие - CD14. Экспрессия CD80, CD83 и CD86 была незначительна.
ДК, созревавшие в присутствии ТР, демонстрировали признаки фенотипической незрелости - порядка 14% ДК-ТР сохраняли экспрессию CD14. Кроме того, на них наблюдалось небольшое, но статистически достоверное снижение уровня экспрессии HLA-DR (рис. 2). Сокультивирование с трофобла-стом не влияло на экспрессию CD80, CD83 и CD86.
Не менее важным нам представлялось оценить влияние цитотрофобласта на продукцию дендритным клетками цито-кинов, так как именно цитокины во многом определяют дальнейшую судьбу Т-клеток, вступивших во взаимодействие с ДК и, в том числе, их дифференцировку в сторону Тх1 или Тх2 [13]. Секрецию ИЛ-1р, ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа надосадков из культур ДК, созревавших в присутствии или отсутствии ТР. Как незрелые, так и зрелые, ЛПС-стимулированные ДК продуцировали ИЛ-1р, ИЛ-6 и ИЛ-10 (рис. 3). ТР не оказывали влияния на продукцию дендритными клетками этих интерлейкинов.
Для анализа способности ДК и ДК-ТР стимулировать Т-клетки, мы использовали аллогенную смешанную культуру лимфоцитов (СКЛ). Было показано, что как ДК, так и ДК-ТР эффективно и дозозависимо стимулировали пролиферацию аллогенных лимфоцитов (рис. 4). Однако, ДК, созревшие в присутствии ТР, демонстрировали значительное ослабление способности стимулировать продукцию ИНФ-7 - мощного индуктора клеточных форм иммунного ответа, наиболее опасных для плода (рис. 5). Концентрация ИНФ-7 в надосадках из СКЛ, стимулированных ДК-ТР, была в 2.88±0.54 раза меньше, чем в надосадках из СКЛ, стимулированных ДК (р=0,000009 в парном т-тесте, п=42).
Чтобы определить, не является ли снижение продукции ИНФ-7 следствием действия ТР на отвечающие лимфоциты, мы использовали одновременное добавление к отвечающим лимфоцитам дендритных клеток и цитотрофобласта, росших раздельно. При этом наблюдалось лишь слабое снижение продукции ИНФ-7, достоверно менее выраженное, чем при использовании ДК-ТР (р=0,002). Эти результаты
С014РЕ оц ои о 0,31 % А г 1 ,а;'" 10 : юэ] а. 5 ,0" О 101' 0,12% г- 3,17% ь
10 ] 0,31 % 8,01% 0,97%
10 ' 11 """"і ' ,||Ш 1«? к} ід 1(? к? н 1-А-ЭЯ АТС їй 1(3 1(5 1<? к? НЬА-ЭЯ ОТС
1001
90-
80-
70
60
50
40
30
20
10
0
і
Г*~1
1
5,38% В 16,65%
13,зЯ ' 64,66%
Н1_А-ОЯ НТС
і
гЬ
■
ДК ДК-ТР ДК ДК-ТР ДК ДК-ТР ДК ДК-ТР ДКДК-Т(
Н1_Д-0К 0014 0080 0083 0086
РИС. 2.
Экспрессия маркеров созревания исследуемыми клетками. Экспрессия И1А-йЙ (ось X) и CD14 (ось У) и на моноцитах (А), зрелых ДК (Б) и зрелых ДК-ТР (В). ДК и ДК-ТР росли 6 суток с ИЛ-4 и ГМ-КСФ и 1 сутки с ЛПС. Средний процент клеток, содержащих исследуемые маркеры в культурах ДК и ДК-ТР (Г). й - статистически достоверное отличие ДК от ДК-ТР (р<0,05 в парном т-тесте).
Г
РИС. 1.
Морфология культур ДК, росших без трофобласта (А) и с трофо-бластом (Б). Клетки культивировали в течение 6 суток с ИЛ-4 и ГМ-КСФ и 1 суток с ЛПС. Увеличение х200, модуляционный фазовый контраст Хоффмана.
ил-6
350
300
250
200
150
100
50
0
пг/мл
ИЛ-1бета
До внесения ЛПС После внесения ЛПС ■ДК аДК-ТР-ТР
16000п пг/мл 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
До внесения ЛГШЬсле внесения ЛПС ВДК оДК-ТРіТР
180н пг/мл 160140 120 100 80 60 40 20 0
ИЛ-10
До внесения ЛПС После внесения ЛПС □ДК □ ДК-ТР .ТР
РИС. 3.
Продукция цитокинов культурами ДК, ДК-ТР и контрольными культурами цитотрофобласта. Цитокины обозначены над графиками.
доказывают, что снижение продукции ИНФ-7 в культурах ДК-ТР было следствием не супрессивного действия ТР на отвечающие лимфоциты, а результатом изменения свойств ДК под действием ТР (рис. 5).
Аллогенные лимфоциты, стимулированные с помощью как ДК, так и ДК-ТР, не продуцировали ИЛ-4. Однако, весьма слабая, но воспроизводимая продукция данного цитоки-на была зафиксирована в контрольных культурах, куда был добавлен ТР без ДК (средняя концентрация ИЛ-4 2,80±0,49 пг/мл), и в случае одновременного добавления к лимфоцитам ДК и ТР, росших до того отдельно (средняя концентрация 6,20 ± 1,08 пг/мл).
Заключение
Таким образом, нами установлено существенное влияние клеток цитотрофобласта плаценты первого триместра беременности на морфологические и функциональные свойства дендритных клеток. ДК, росшим в присутствии ТР, свойственны признаки фенотипической незрелости и высокая адгезивность. Они так же утрачивают способность стимулировать продукцию лимфоцитами ИНФ-g, ключевого цито-кина Тх1, потенциально опасного для плода. ТР не влияет на способность ДК стимулировать пролиферацию лимфоцитов, продукцию ими ИЛ-4, и не изменяет продукции дендритными клетками ИЛ-1р, ИЛ-6 и ИЛ-10. Полученные нами данные свидетельствуют о вовлечении ДК человека в предотвращение иммунологического конфликта матери и плода при беременности. Механизмами такого предотвращения могут являться поддержание незрелости ДК в децидуальной оболочке, задержка их миграции и изменение баланса цитокинов в сторону гуморального ответа за счет снижения продукции ИНФ-g. ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Chaouat G., Tranchot Diallo J., Volumenie J.L., et al. Immune suppression and Th1/Th2 balance in pregnancy revisited: a (very) personal tribute to Tom Wegmann. Am. J. Reprod. Immunol. 1997. № 37. Р. 427-434.
2. Clark D.A., Keil A., Chen Z., et al. Placental trophoblast from successful human pregnancies expresses the tolerance signaling molecule, CD200 (OX-2). Am. J. Reprod. Immunol. 2003. № 50. Р. 187-195.
3. Petroff M.G., Chen L., Phillips T.A., et al. B7 family molecules are favorably positioned at the human maternal-fetal interface. Biol. Reprod. 2003. № 68. Р. 1496-1504.
4. Mor G., Gutierrez L.S., Eliza M., Kahyaoglu F., Arici A. Fas-fas ligand system-induced apoptosis in human placenta and gestational trophoblastic disease. Am. J. Reprod. Immunol. 1998. № 40. Р. 89-94.
5. Kammerer U., Kruse A., Barrientos G., Arck P.C., Blois S.M. Role of dendritic cells in the regulation of maternal immune responses to the fetus during mammalian gestation. Immunol. Invest. 2008. № 37. Р. 499-533.
6. Blois S.M., Kammerer U., Alba Soto C. et al. Dendritic cells: key to fetal tolerance? Biol. Reprod. 2007. № 77. Р. 590-98.
7. Ivanova E., Kyurkchiev D., Altankova I., et al. CD83+ monocyte-derived dendritic cells are present in human decidua and progesterone induces their differentiation in vitro. Am. J. Reprod. Immunol. 2005. № 53. Р. 199-205.
8. Laskarin G., Redzovi A., Rubesa Z., et al. Decidual natural killer cell tuning by autologous dendritic cells. Am. J. Reprod. Immunol. 2008. № 59. Р. 433-445.
9. Ban Y.L., Kong B.H., Qu X., Yang Q.F., Ma Y.Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clin. Exp. Immunol. 2008. № 151. Р. 399-406.
10. Blois S.M., Alba Soto C.D., Tometten M., Klapp B.F., Margni R.A., Arck P.C. Lineage, maturity, and phenotype of uterine murine dendritic cells throughout gestation indicate a protective role in maintaining pregnancy. Biol. Reprod. 2004. № 70. Р. 1018-1023.
11. Blois SM, Tometten M, Kandil J et al. Intracellular adhesion molecule-1/LFA-1 cross talk is a proximate mediator capable of disrupting immune integration and tolerance mechanism at the feto-maternal interface in murine pregnancies. J. Immunol. 2005. № 174. Р. 1820-1829.
12. Miyazaki S., Tsuda H., Sakai M., et al. Predominance of Th2-promoting dendritic cells in early human pregnancy decidua. J. Leukoc. Biol. 2003; 74: 514-522.
13. Iwasaki A., Kelsall B.L. Freshly isolated Peyer's patch, but not spleen, dendritic cells produce interleukin 10 and induce the differentiation of T helper type 2 cells. J. Exp. Med. 1999. № 190. Р. 229-239.
14. Geijtenbeek T.B.H., van Vliet S.J., Koppel E.A., et al. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J. Exp. Med. 2003. № 197. Р. 7-17.
SGGG 6GGG 4GGG 2GGG G
К Мон TP ДК ДК-ТР ДК+ТР
РИС. 4.
Влияние клеток цитотрофобласта на способность ДК стимулировать пролиферацию аллогенных лимфоцитов. Соотношение ДК к лимфоцитам 1:10. Обозначения культур: К - нестимулированные лимфоциты, Мон - моноциты, росшие 7 суток без стимуляции, ТР - лимфоциты с клетками цитотрофобласта, ДК - с дендритными клетками, ДК-ТР - с дендритными клетками, созревавшими в присутствии трофобласта. ДК + ТР - контрольный вариант смешанной культуры лимфоцитов, в которую добавлены ДК, росшие без трофобласта, и клетки трофобласта, росшие без ДК.
2GG-1SG-16G-14G-12G-1GG-SG -6G 4G -2G G
К Мон ТР ДК ДК-ТР ДК+ТР
РИС. 5.
Влияние клеток цитотрофобласта на способность ДК стимулировать продукцию ИНФ-g аллогенными лимфоцитами. Средние значения, соотношение ДК к лимфоцитам 1:10. Обозначения культур аналогичны рисунку 4. й - статистически достоверное отличие ДК от ДК-ТР (p<0,05 в парном т-тесте), й - статистически достоверное отличие ДК-ТР от ДК + ТР (p<0,05 в парном т-тесте).
