CC BY
15
рнк-секвенирование и пространственная транск при травме спинного
мозга (0Бз1
DOI: 10.17691/stm2023.15.6.08 УДК 616.832-001:575.1 Поступила 30.08.2023 г.
Ю.А. Челышев, д.м.н., профессор кафедры гистологии1;
И.Л. Ермолин, д.б.н., профессор кафедры гистологии с цитологией и эмбриологией2
1Казанский (Приволжский) федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, Республика Татарстан, 420008;
2Приволжский исследовательский медицинский университет, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005
Для понимания фундаментальных механизмов функционирования спинного мозга необходимо выявить полный набор кл ных типов и образуемых ими популяций, которые могут быть идентифицированы по уникальному сочетанию признаков. Технологии секвенирования РНК отдельной клетки и отдельного клеточного ядра служат эффективными инструментами для определения роли клеток разных типов в нормальных и патологических реакциях в спинном мозге. Пространственная транскриптомика сочетает эти технологии с методами получения и сохранения пространственной информации о клетках в ткани, что позволяет более точно локализовать область повреждения, детально охарактеризовать тканевые компартменты в конкретной анатомической области и анализировать патологическую картину на клеточном и молекулярном уровне.
Созданные на основе данных РНК-секвенирования отдельной клетки и отдельного клеточного ядра атласы развития технологий РНК-секвенирования и пространственной транскриптомики открывают большие возможности для формулирования новых перспективных концепций, касающихся механизмов реорганизации нейронных связей и восстановления сенсомоторных функций при травме спинного мозга. Полученные транскриптомы явились мощным ресурсом для выяснения новых функций клеток нервной ткани. С целью установления терапевтических мишеней выявляемое молекулярное разнообразие в нейронах разных типов позволяет отслеживать и сравнивать их уязвимость и регенераторный потенциал. Для выяснения причин селективной уязвимости клеток при травме спинного мозга важно располагать детальной информацией о специфике клеточных популяций у человека в сопоставлении с известными данными, полученными на экспериментальных моделях.
В предлагаемом обзоре обобщены достижения по идентификации и изучению характеристик клеток в травмированном спинном мозге на основе транскрипционного профилирования на уровне отдельной клетки или отдельного клеточного ядра.
Ключевые слова: травма спинного мозга; РНК-секвенирование; пространственная транскриптомика.
Как цитировать: Chelyshev Yu.A., Ermolin I.L. RNA sequencing and spatial transcriptomics in traumatic spinal cord injury (review). Sovremennye tehnologii v medicine 2023; 15(6): 75, https://doi.org/10.17691/stm2023.15.6.08
English
RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics in Traumatic Spinal Cord Injury (Review)
Yu.A. Chelyshev, MD, DSc, Professor, Department of Histology1;
I.L. Ermolin, DSc, Professor, Department of Histology with Cytology and Embryology2
1Kazan Federal University, 18 Kremlyovskaya St., Kazan, the Republic of Tatarstan, 420008, Russia; 2Privolzhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia
In order to understand the fundamental mechanisms of the spinal cord functioning, it is necessary to reveal a complete set of cell types and their populations, which can be identified by the unique combination of their features. The technologies of single-cell and single-nucleus RNA sequencing serve as effective tools for determining the role of various types of cells in normal and pathological reactions in the spinal
Для контактов: Ермолин Игорь Леонидович, e-mail: [email protected]
cord. Spatial transcriptomics combines these technologies with the methods of obtaining and saving spatial information about cells in the tissue, which allows one to localize more precisely the injured area, characterize in detail the tissue compartments in the specific anatomical region, and analyze the pathological picture at the cellular and molecular level.
Atlases of development of RNA-sequencing technologies and spatial transcriptomics created on the basis of the data from single-cell and single-nucleus RNA sequencing open great opportunities for new perspective concepts concerning the mechanisms of rearranging neural connections and restoration of sensorimotor functions in traumatic spine injury. The transcriptomes obtained were a powerful resource for detecting new functions of the nervous tissue cells. To establish therapeutic targets, the detected molecular diversity in neurons of various types enables tracing and comparing their susceptibility and regenerative potential. Determination of causes of selective cell susceptibility in spinal cord injury needs comprehensive information on the specificity of human cell populations in comparison with the known data obtained on the experimental models.
In the present review, we have summarized advances in identification and study of cell characteristics in a traumatized spinal cord based on transcription profiling at a single-cell or single-nucleus level.
Key words: spinal cord injury; RNA sequencing; spatial transcriptomics.
Введение
Процессирование сенсорной информации и локомоторные реакции в спинного мозге контролируются нейронными сетями, объединяющими клетки многих типов [1-3]. Для установления клеточных коррелятов поведенческих реакций важно иметь представление о конкретных типах клеток, образующих нейронную сеть. Решение этой задачи оказалось возможным в результате разработки и применения технологий секвенирования РНК (RNA-seq) отдельной (единичной) клетки (scRNA-seq) или отдельного ядра (snRNA-seq) — эффективного инструмента для понимания роли клеток разных типов в нормальных и патологических реакциях в нервной системе. Эти технологии позволяют представить распределение клеток конкретного типа, визуализируя экспрессию генов в контексте тканевой структуры (пространственная транскриптомика).
Исследование J.D. СаЬюу с соавт. [4] послужило концептуальным и технологическим прорывом в ней-ронауках как первая, основанная на транскриптомных профилях классификация популяций клеток ЦНС, созданная по результатам исследований с использованием технологии микрочипов. Полученные транскрип-томы явились мощным инструментом для понимания новых функций клеток нервной ткани. В дальнейшем эта классификация клеток ЦНС была уточнена и дополнена с помощью технологий scRNA-seq/snRNA-seq и пространственной транскриптомики.
Понимание фундаментальных механизмов функционирования спинного мозга требует выявления полного набора типов клеток и образуемых ими популяций, которые могут быть идентифицированы по уникальному сочетанию характеристик. Конкретный тип спинальных клеток характеризуется многими параметрами, такими как локализация, структура, цито-генез, электрофизиологические свойства, вовлеченность в формирование сетей, паттерны экспрессии генов и участие в поведенческих реакциях [5]. Для идентификации клеток конкретного типа необязательно допускать наличие в них полного набора характер-
ных признаков, но их сочетание лежит в основе клеточной идентичности.
При пробоподготовке материала для scRNA-seq ферментативное расщепление приводит к разрушению синаптических структур и гибели нейронов. snRNA-seq по сравнению с scRNA-seq может свести к минимуму образование псевдоклеточных структур, индуцированных ферментативным гидролизом и механическим повреждением. Кроме того, предполагается, что snRNA-seq позволяет собрать информацию об ин-тронах и межгенных областях и охарактеризовать более редкие типы клеток. Однако, хотя snRNA-seq позволяет получить более полную информацию о типах клеток, для характеристики некоторых типов клеток, например иммунных, более приемлемой оказалась технология scRNA-seq [6, 7].
Методика РНК-секвенирования включает следующие этапы: 1) диссоциация ткани и получение отдельных клеток; 2) амплификация нуклеиновых кислот; 3) высокопроизводительное секвенирование; 4) анализ данных. Детальная характеристика и подводные камни каждого этапа рассмотрены в работах [8-13].
Пространственная транскриптомика сочетает scRNA-seq с методами получения и сохранения пространственной информации в ткани. Этот подход позволяет точно локализовать область повреждения и рассматривать его патогенез на клеточном уровне [14]. По сравнению со стандартной технологией scRNA-seq разрешение и эффективность обнаружения генов в ходе пространственной транскриптомики пока недостаточны, но алгоритмы биоинформатики позволяют обеспечить желаемое приближение.
Методы пространственной транскриптомики применяют для создания карт (атласов) экспрессии генов в любых тканевых компартментах. Подобные гармонизированные атласы транскрипции клеточных типов и их пространственного распределения уже созданы для спинного мозга мышей [15-17]. В них для изучения клеток разных типов как in vivo, так и in vitro привлечена большая панель маркеров, представлены предполагаемые эмбриональные линии для каждого типа клеток, мобилизованы вычислительные ресурсы
для классификации клеток спинного мозга на основе транскриптомики, позволяющие исследователям легко взаимодействовать и анализировать данные о конкретных клетках спинного мозга [17]. Подобные атласы могут служить универсальной номенклатурой и клеточных типов, и набора молекулярных маркеров, которые вместе наиболее детально характеризуют тканевые компартменты в конкретной анатомической области.
Технологии scRNA-seq/snRNA-seq играют важную роль для установления стандартного набора типов клеток в спинном мозге и понимания молекулярных механизмов патологических сдвигов в этом органе. Такие технологии позволяют проводить скрининг дифференциально экспрессируемых генов в разные сроки после травмы спинного мозга (ТСМ). Так, при контузи-онной ТСМ на уровне Th8 у крысы количество генов, активность которых значительно изменилась, составило 944, 1362 и 1421 через 1, 4 и 7 сут после нанесения травмы соответственно [18]. При помощи scRNA-seq выявлены сотни молекулярно различных типов клеток в нервной системе мыши и человека, чья функция определяется дифференциальной активностью генов и топографией клеток конкретных типов [16, 19, 20]. Использование технологии секвенирования совместно с пространственной транскриптомикой позволяет понять молекулярные основы онтогенетических истоков клеточного разнообразия в ЦНС [21-23].
В предлагаемом обзоре мы не будем углубляться в технологический аспект проблемы, а рассмотрим основные достижения технологий scRNA-seq/snRNA-seq и пространственной транскриптомики при ТСМ.
Поиск литературы проводили в базе данных PubMed по ключевым словам «травма спинного мозга», «РНК-секвенирование», «пространственная транскрип-томика».
Спинальные нейроны
Спинальные нейроны характеризуются ярко выраженной гетерогенностью. Сформировано отчетливое представление о цитогенетических, структурных, цитохимических и функциональных характеристиках мотонейронов, интернейронов, проприоспинальных, холинергических, возбуждающих и тормозных нейронов [24-35]. Однако, как показали результаты недавних работ с scRNA-seq/snRNA-seq, все эти популяции по критерию дифференциальной экспрессии генов оказались еще более гетерогенными [15, 17, 36-38]. Информация о гетерогенности популяций спинальных нейронов имеет важное прикладное значение рот выявлении менее и более уязвимых для повреждения нейронов (disease resistance) с целью поиска мишеней при травматическом повреждении и нейродегенера-тивных заболеваниях, например при боковом амио-трофическом склерозе [14, 39-41].
Результаты исследования спинного мозга с привлечением технологии RNA-seq позволили установить
определяющую роль топографии нейронных сетей в организации спинного мозга млекопитающих. Так, при помощи scRNA-seq определены основные различия между дорсальными и вентральными нейронами по критериям образования кластеров и дифференциальной экспрессии генов, контролирующих нейро-пластичность [17]. Это наблюдение принципиально важно для понимания различий в регенераторном потенциале нейронов конкретных популяций в условиях патологии. Дорсальные кластеры различаются по четко разделенным конкретным типам нейронов, которые легко группируются в семейства. Эти нейроны расположены на большом расстоянии друг от друга и могут быть надежно различимы. Напротив, вентральные кластеры нейронов в большей мере приближены друг к другу, с близким или перекрывающимся распределением в ткани и перекрывающимися паттернами экспрессии генов. Эти различия в структурной и молекулярной организации дорсального и вентрального отделов серого вещества спинного мозга могут лежать в основе специфики функционирования нейронных сетей в этих отделах. Более высокая пластичность связей в дорсальном отделе может быть следствием таких реакций, как центральная сенситизация, прогрессивное увеличение возбудимости ноцицептивных нейронов, долговременная потенциация, депрессия, которые сопровождают хроническую нейропатическую боль. В вентральном же отделе связи структурно более стабильны, о чем, в частности, свидетельствует высокая экспрессия генов, кодирующих синтез компонентов перинейрональных сетей, стабилизирующих синаптические связи и ограничивающих пластичность нейронов [17].
Данные scRNA-seq имеют фундаментальное значение в клеточной биологии, так как позволяют переосмыслить границы фенотипа и классическое определение принадлежности клеток к конкретному типу как клеток с идентичным набором разрешенных к экспрессии генов вне зависимости от того, транскрибируются они или нет.
В исследовании J.A. Blum с соавт. [37] в материале спинного мозга половозрелых мышей, обогащенном ядрами эфферентных нейронов, профилировано 43 890 транскриптомов и дана детальная характеристика экспрессии генов с разрешением на уровне отдельной клетки. Эфферентные нейроны спинного мозга составляют всего 0,4% всех клеток в органе. Поэтому для профилирования транскриптомов в технологии snRNA-seq предварительно проведены активируемые флуоресценцией сортировка и обогащение ядер. Холинергические нейроны были представлены 20 кластерами. При этом идентифицировано 16 кластеров симпатических нейронов, которые различались локализацией и экспрессией генов нейромодулятор-ной сигнализации, в том числе несколько кластеров, локализующихся в крестцовом отделе спинного мозга. Здесь автономные нейроны разных подтипов экс-прессируют разные сочетания нейромодулирующих
пептидов, таких как соматостатин, нейротензин и про-энкефалин. Это исследование позволило выявить новые генетические маркеры, специфические для автономных и соматических мотонейронов, для а- и Y-мотонейронов, а также установить гетерогенность популяции Y-мотонейронов, разные подтипы которых экспрессируют различные транскрипционные программы [37].
Детально охарактеризованы различия в генных модулях в электрофизиологически и метаболически различных популяциях быстрых и медленных а-мотонейронов. Эти типы мотонейронов различаются по набору субъединиц калиевых каналов, которые контролируют потенциалы покоя и скорость возбуждения [24]. Выраженная транскрипционная гетерогенность соматических мотонейронов коррелирует с электрофизиологическими характеристиками и локализацией моторных пулов [37].
Гетерогенность популяций клеток в поясничном отделе сформированного после травмы спинного мозга мышей была детально охарактеризована при помощи snRNA-seq [15]. В этом исследовании секвенировано 17 354 ядра и обнаружено семь основных кластеров, которые представлены следующими типами клеток, идентифицированными по экспрессии маркеров: 52% — нейроны, 16% — олигодендроциты, 14% — смешанная популяция менингеальных и шванновских клеток, 9% — астроциты, 5% — сосудистые клетки, 1% — клетки-предшественницы олигодендроцитов и 1% — микроглия. Идентифицировано и молекулярно охарактеризовано 43 популяции нейронов, которые были неравномерно распределены по кластерам в различных отделах серого вещества. Так, 55% нейронов сосредоточены в 25 дорсальных кластерах, 34% — в 13 вентральных кластерах и 11% нейронов располагались в 5 кластерах — в дорсальных рогах и в промежуточной зоне. Дорсальный отдел серого вещества содержит популяции клеток, которые различаются в большей мере экспрессией генов, в то время как вентральный отдел демонстрирует перекрывающиеся паттерны экспрессии генов [15].
Мотонейроны латерального двигательного ядра присутствуют в шейном и поясничном отделах спинного мозга и контролируют сокращения мышц конечностей, в то время как мотонейроны медиального двигательного ядра распределены по всей ростро-ка-удальной оси органа и связаны с аксиальной мускулатурой. У позвоночных молекулярная идентичность мотонейронов упомянутых ядер в целом известна. Тем не менее идентичность подтипов в этих клеточных популяциях, иннервирующих отдельные группы мышц, оставалась неясной. Ответ на этот вопрос получен с использованием snRNA-seq [38]. Мотонейроны медиального двигательного ядра подразделены на три подтипа, которые различаются по паттерну экспрессии генов Satb2, Nr2f2 и Bcl11b и зависят от локализации нейронов по медиолатеральной оси и экспрессии молекул, контролирующих направленный рост аксонов.
При установлении терапевтических мишеней выявляемое молекулярное разнообразие позволяет отслеживать и сравнивать уязвимость и регенераторный потенциал нейронов разных подтипов в моделях повреждения ЦНС и нейродегенеративных заболеваний, например бокового амиотрофического склероза [40, 42]. Технологии scRNA-seq/snRNA-seq стали активно применяться для анализа молекулярных и клеточных механизмов патологических реакций и регенерации при ТСМ [11, 43-50].
Для выяснения причин селективной уязвимости клеток при патологии ЦНС важно располагать детальной информацией о специфике клеточных популяций у человека в сопоставлении с известными данными, полученными на экспериментальных моделях. При помощи snRNA-seq и пространственной транскриптомики в спинном мозге человека идентифицированы 29 кластеров глии и 35 кластеров нейронов [51], организованных главным образом по анатомическому принципу. Созданный на основе этих данных информационный ресурс актуален для клиники. Показано, что спинальные мотонейроны, которые дегенерируют при боковом амиотрофическом склерозе и прочих нейро-дегенеративных заболеваниях, по сравнению с другими спинальными нейронами экспрессируют гены, контролирующие размеры клетки и структуру цитоске-лета, что предполагает наличие специализированного молекулярного репертуара, лежащего в основе их селективной уязвимости.
Для иллюстрации клинической значимости данных о РНК-секвенировании клеток спинного мозга у мышей с моделями нейродегенеративных заболеваний следует упомянуть интересные результаты J. Sun с соавт. [52]. В этой работе при помощи scRNA-seq у мышей с моделью спинальной мышечной атрофии наиболее выраженные сдвиги выявлены не в нейральных клетках, как ожидалось, а в субпопуляции фибробластов сосудов [52]. Численность клеток в этой субпопуляции существенно уменьшается, что приводит к дефектам сосудов с последующим угнетением энергетического метаболизма и синтеза белка.
Поясничный отдел вне зависимости от уровня повреждения спинного мозга представляет особый интерес для анализа посттравматических реакций и рассматривается как актуальная терапевтическая мишень [53, 54]. В первую очередь это связано с присутствием в этом отделе сетей интернейронов, образующих центральный генератор паттерна и контролирующих двигательную функцию [55, 56]. При ТСМ в поясничном отделе наряду с реорганизацией нисходящих двигательных путей [57] происходит перестройка нервных связей [58, 59]. Участие образующих эти сети конкретных интернейронов, их принадлежность к определенным классам предшественников, молекулярная специфичность и возможности модулирования фенотипа в ответ на повреждение остаются неясными. При решении комплекса этих вопросов при ТСМ технологии scRNA-
seq/snRNA-seq зарекомендовали себя как наиболее информативные.
Применение технологии snRNA-seq позволило получить при тяжелой контузионной ТСМ мыши принципиально новые данные о механизмах восстановления двигательной функции в ответ на эпиду-ральную электростимуляцию [48]. ТСМ в среднем грудном отделе вызывала полную дезинтеграцию волокон кортикоспинального тракта и выраженное уменьшение количества глутаматергических волокон ретикулоспинального тракта каудальнее области повреждения. В поясничном отделе из 82 093 ядер, подвергнутых транскриптомному анализу, 20 990 принадлежали нейронам, которые были распределены по 36 популяциям. Электростимуляция приводила к немедленной активации возбуждающих интернейронов, локализованных в промежуточных пластинках поясничного отдела, которые экспрессировали ген Vsx2 (Visual System Homeobox 2) и маркер нейронов каудального отдела спинного мозга Hoxa10 (Homeobox A10). C. Kathe и соавт. [48] в ходе изящных экспериментов удалось установить, что эти нейроны не участвуют в контроле шагания в интактном спинном мозге, но подключаются к восстановлению ходьбы после ТСМ. По мнению авторов, в клинике позитивный эффект эпидуральной электростимуляции на восстановление двигательной функции у 9 пациентов с ТСМ может быть связан с активацией именно этих интернейронов.
В поясничном отделе интактного спинного мозга мыши преобладает популяция нейронов (~21%). На модели тяжелой контузионной ТСМ мыши в грудном отделе при помощи snRNA-seq в поясничном отделе зарегистрировано отсутствие существенных изменений в соотношении количества популяций возбуждающих, тормозных и двигательных нейронов, которое составило соответственно 8:8:1 [49]. Однако при этом в данном отделе отмечены признаки усиления синапти-ческой пластичности и увеличения чувствительности к действию нейротрансмиттеров, а также активация генов, кодирующих синтез их рецепторов, синаптогенез и ремоделирование синапсов.
При ТСМ в грудном отделе нейроны поясничного отдела в целом остаются сохранными в отличие от нейронов в эпицентре повреждения [60, 61]. Однако уже через неделю после ТСМ нейроны поясничного отдела демонстрируют сдвиги в экспрессии генов, кодирующих молекулы клеточного стресса, включая окислительно-восстановительные реакции и укладки (сворачивания) белка, а также молекулы опосредованной нейромедиаторами передачи сигналов и функционирования ионных каналов. При этом ряд популяций возбуждающих нейронов в дорсальных рогах и тормозных нейронов в вентральных рогах характеризуются изменением в организации синапсов и экспрессии генов, связанных с пластичностью [49]. После ТСМ в большинстве нейронов поясничного отдела угнетаются физиологические каскады и активируют-
ся гены, связанные с нейротрансмиссией и реструктурированием синапсов. В противоположность этим реакциям в нейронах двух конкретных популяций, а именно в Shox2-экспрессирующих V2d, а также в нейронах спинно-мозжечкового тракта после повреждения начинают экспрессироваться гены, ассоциированные с регенерацией (regeneration associated genes). Полученные при помощи РНК-секвенирования данные дают основание полагать, что принадлежащие к различным популяциям нейроны поясничных сетей могут демонстрировать специфические стратегии восстановления [49].
При ТСМ трансплантация в спинной мозг нейраль-ных предшественников стимулирует регенерацию аксонов кортикоспинального тракта и восстановление двигательной функции [46, 62]. С целью выяснения молекулярных механизмов подобного действия проведен анализ регенераторного транскриптома (реверсия к эмбриональному состоянию) мотонейронов, локализованных в слое V двигательной коры, аксоны которых образуют кортикоспинальный тракт [46]. Только ТСМ, также как и травма в сочетании с трансплантацией нейральных предшественников, вызывают сходные ранние транскриптомные ответы в мотонейронах. Через 2 нед после ТСМ этот транскриптом угнетается, но при сочетании травмы с трансплантацией клеток он оказывается более устойчивым. Ген хантингтина (Htt) является центральным геном-концентратором (хабом) в регенераторном транскрипотоме, включающим ассоциированные с регенерацией гены и программы [6367]. Делеция Htt значительно ослабляет регенерацию, что указывает на ключевую роль этого гена в пластичности нейронов после травмы [46].
Астроглия
Гетерогенность популяции астроцитов общепризна-на [68-71]. Технология scRNA-seq существенно расширяет наши представления в этой области, позволяет получить новые данные о популяциях астроцитов в спинном мозге и их поведении при ТСМ [72]. Самым надежным маркером для идентификации астроцитов считается глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). Технология scRNA-seq позволила идентифицировать популяции GFAP-экспрессирующих клеток у интактных, ложно оперированных и травмированных мышей с компрессией спинного мозга в каудальном грудном отделе. В острой и хронической стадиях выявлены популяции астроцитов, которые различались по экспрессии генов, в том числе контролирующих пролиферативную активность. При этом были иден-тифицрованы астроциты, экспрессирующие только специфические для этого клеточного типа маркеры, а также астроциты, которые наряду со своими маркерами экспрессировали маркеры эпендимных клеток. Количество таких клеток со смешанной экспрессией значительно увеличивалось в острую фазу ТСМ, они были локализованы на отдалении от центрального
канала как у интактных, так и у травмированных мышей. Подобные астроцито-эпендимные клетки присутствовали как в белом, так и в сером веществе, но их количество в белом веществе преобладало [72]. В данном исследовании установлено (что оказалось неожиданным) увеличение в острой фазе количества таких клеток также и у ложно оперированных животных (только с ламинэктомией). Это наблюдение ставит вопрос об адекватности использования животных данной группы в качестве контрольных при ТСМ.
Молекулярный профиль, изменение длительности фаз клеточного цикла, сходная с радиальной глией морфология астроцито-эпендимных клеток с высокой экспрессией маркера стволовых клеток нестина [73] не только подтверждают данные о происхождении одной из популяций астроцитов из стволовой нейраль-ной клетки, локализованной в эпендимном слое спинного мозга, но и указывают на присутствие подобных клеток в интактном спинном мозге [72]. Несмотря на способность дифференцироваться в астроциты [74] и олигодендроциты, эпендимные стволовые клетки при ТСМ кажутся в большей мере предрасположенными к образованию астроцитов, которые составляют примерно половину от общего числа астроцитов глиаль-ного рубца [75].
Олигодендроглия
Зрелые олигодендроциты также проявляют гетерогенность транскрипции, функциональные последствия которой неясны. Их неоднородность может коррелировать с влиянием микроокружения или взаимодействием с нейронами разных типов. Показано [44], что отдельные популяции олигодендроцитов в ЦНС млекопитающих отличаются пространственным расположением. Олигодендроциты типа 2 преобладают в спинном мозге, в то время как олигодендроци-ты типов 5 и 6 с возрастом увеличивают свой вклад в общую популяцию олигодендроцитов во всех исследованных отделах ЦНС. Олигодендроциты типов 2 и 5/6 различаются по присутствию в двигательных и сенсорных трактах. Предшественники олигодендро-цитов в нейрогенезе кажутся неспецифицированны-ми для дифференцировки в клетки этих популяций. Реактивность олигодендроцитов типа 2 и 5/6 при хронической ТСМ различается. Олигодендроциты типа 2 уменьшают свой вклад в популяцию олигодендро-цитов в области повреждения и увеличивают его в областях дегенерации нервных волокон, особенно в хроническую фазу ТСМ [44]. Увеличение присутствия олигодендроцитов типов 5/6 в общей популяции в месте повреждения указывает на то, что в этой области активно действуют факторы, которые стимулируют резидентные предшественники олигодендроцитов к предпочтительной дифференцировке в олигодендроциты типов 5/6. В целом данные scRNA-seq в комплексе с иммунофлуоресцентным анализом показывают, что разные популяции олигодендроцитов различаются
по пространственным предпочтениям, по-разному реагируют на ТСМ и могут выполнять разные функции в ходе регенерации.
При острой ТСМ в грудном отделе при помощи scRNA-seq идентифицировано два кластера предшественников олигодендроцитов — A и B. Преобладают клетки с фенотипом A, которые экспрессируют канонические для предшественников олигодендроцитов гены, кодирующие синтез таких молекул, как хондро-итинсульфат протеогликан 4 (CSPG4, он же NG2-протеогликан), рецептор тромбоцитарного фактора роста a (PDGFRa) и тенасцин R. Предшественники олигодендроцитов B появляются в первые сутки после повреждения и активно экспрессируют тенасцин С [47]. Предполагается, что предшественники олигоден-дроцитов A участвуют в процессах цитогенеза и мие-линизации, а клетки популяции В активно пролифери-руют [47].
Эпендимная глия
Нейральные стволовые клетки в сформированном спинном мозге присутствуют в популяции эпендим-ных клеток. В спинном мозге человека не зарегистри -ровано их размножение [76, 77], хотя in vitro эпенди-моциты вступают в митоз [78-80]. Эпендимная глия явилась объектом экспериментальных исследований на уровне отдельной клетки [45, 81, 82]. В ряде работ получены данные о проявлении у эпендимо-цитов некоторых субпопуляций потенциала ней-ральных стволовых клеток [82, 83]. Эпендимоциты и нейральные стволовые клетки во взрослом организме происходят из общих эмбриональных предшественников [82, 84]. Детальный анализ гетерогенности популяции и возрастной динамики транскриптома эпендимоцитов в спинном мозге был предпринят в работе [50]. В общей популяции эпендимоцитов scRNA-seq позволил идентифицировать незрелые клетки как потенциальные стволовые клетки в спинном мозге. После ТСМ эти клетки повторно вступают в клеточный цикл, что сопровождается кратковременной реверсией их созревания.
Резидентные нейральные стволовые клетки вносят ограниченный вклад в замену клеток. При ТСМ у мыши эпендимные клетки в основном дают начало астроцитам глиального рубца [75, 82] и в меньшей степени — олигодендроцитам [85-87]. Выявлен скрытый потенциал резидентных нейральных стволовых клеток для замещения значительной части погибших олигодендроцитов в поврежденном спинном мозге мыши. Технология scRNA-seq демонстрирует пребывание нейральных стволовых клеток в пермиссивном состоянии, что позволяет реализовать обычно латентную программу экспрессии генов для олигодендроге-неза после повреждения.
В сформированном спинном мозге маркер олигодендроцитов — транскрипционный фактор Olig2 — не оказывает стимулирующего влияния на олигодендро-
генез и миелинизацию, но ранние предшественники в популяции эпендимоцитов сохраняют возможность ответа на действие этого транскрипционного фактора, что и наблюдается в условиях ТСМ. Эктопическая экспрессия Olig2 сопровождает обильный олигодендро-генез, производящийся из стволовых клеток, который следует за естественной дифференцировкой олиго-дендроцитов, способствует ремиелинизации аксонов и стимулирует восстановление проводимости нервных волокон [45]. Эти данные позволяют высказать обнадеживающее предположение о том, что рекрутирование резидентных стволовых клеток может служить альтернативой трансплантации клеток после повреждения ЦНС.
Микроглия
Микроглия представлена резидентными иммунными клетками в ЦНС, которые участвуют в иммунной защите, поддержании гомеостаза, фагоцитозе фрагментов погибших клеток, прунинге избыточных синапсов и коллатералей аксонов, стимулировании роста и ремиелинизации отростков нейрона [88-91]. В настоящее время для изучения разнообразия микроглии широко применяются технологии scRNAseq/snRNAseq [47, 92-95]. РНК-секвенирование выявило новые маркеры микроглии: S100A8, S100A9, HEXB, TMEM119, GPR34, P2RY12, Siglec-H, TREM2, OLFML3 [96].
Отдельная и непростая задача, которая была успешно и полно решена благодаря технологии РНК-секвенирования, — различение микроглии и макрофагов. Эти линии клеток характеризуются морфологической идентичностью и сходными фенотипическими маркерами in vivo, особенно в условиях патологии, включая ТСМ, когда активируются оба клеточных типа [95, 97-100].
Недавними исследованиями с помощью scRNA-seq установлено, что микроглия отличается от пограничных макрофагов экспрессией генов, кодирующих пуринергический рецептор P2yr, мембранный переносчик — член 5 семейства 2 (SLC2A5), трансмембранный белок Tmem119 и р-субъединицу р-гексозаминидазы (Hexb), тогда как пограничные макрофаги экспрессируют молекулу активации лимфоцитов Ms4a7 (член 7 подсемейства 4 доменов, охватывающих мембрану), рецептор маннозы (Mrc1) и др. [95]. Эти данные имеют важное значение для идентификации и изучения роли пограничных макрофагов в ЦНС, которые контролируют поступление лейкоцитов из крови и спинномозговой жидкости в паренхиму мозга, а также ограничивают обмен ЦНС и крови различными цитокинами и хемокинами [101].
При ТСМ микроглия специфически координирует взаимодействие клеток различных типов [102]. Фармакологическое истощение микроглии усугубляет повреждение спинного мозга и ухудшает восстановление функции. Наоборот, восстановление в микроглио-цитах внутриклеточных сигнальных каскадов, иденти-
фицированных по данным scRNA-seq, предотвращает вторичное повреждение и способствует регенерации. Анализ работы [102] показывает, что оптимальное восстановление после ТСМ может быть достигнуто за счет координации ключевых лиганд-рецепторных взаимодействий между микроглией, астроцитами и инфильтрирующими лейкоцитами.
Травма спинного мозга запускает нейровоспа-лительную реакцию, в которой преобладают моноциты/макрофаги и резидентные клетки микроглии. Технология scRNA-seq разделяет гомеостатическую и негомеостатическую микроглию в спинном мозге. При ТСМ негомеостатическая микроглия включает три популяции, а именно воспалительную, пролифериру-ющую и мигрирующую микроглию. Воспалительная микроглия характеризуется экспрессией генов, связанных с гибелью клетки, продукцией цитоки-нов и экспрессией гена пуринергического рецептора P2ry12, который слабо экспрессируется в двух других популяциях негомеостатической микроглии. Пролиферирующая микроглия экспрессирует гены, ассоциированные с регуляцией клеточного цикла, например Cdk1. Микроглиоциты самой немногочисленной популяции мигрирующих клеток экспрессируют гены, связанные с подвижностью клетки, а также характеризуются высокими уровнями экспрессии гена-рецептора мусорщиков макрофагов (Msr1) и гена ин-сулиноподобного фактора роста 1 (Igf1) [47].
При ТСМ пространственная транскриптомика выявляет в кластерах миелоидных клеток фенотипы моноцитов, макрофагов нескольких подтипов, а именно индуцирующих хемотаксис и провоспалительных, а также пограничные (border associated) макрофаги и дендритные клетки [47]. Причем упомянутые подтипы макрофагов не соответствуют широко известной классификации поляризационных фенотипов М1/М2. Индуцирующие хемотаксис и провоспалительные макрофаги демонстрировали паттерны взаимодействия, сходные с таковыми у астроцитов и фибробластов. Эти полученные с помощью scRNA-seq данные, касающиеся межклеточной сигнализации, вносят вклад в понимание молекулярных механизмов астроглиоза, фиброза и ангиогенеза при ТСМ.
Травма спинного мозга сопровождается многими реакциями клеток разных типов, которые специфичны во времени, по срокам и локализации. При ТСМ у мышей использование scRNA-seq в сочетании с традиционным анализом структуры, поведения и электрической активности позволило получить данные о временных и молекулярных сдвигах на уровне отдельной клетки. Описаны патологические изменения в клетках 12 основных типов, из них клетки трех типов мигрировали в спинной мозг в разное время после травмы [103]. В интактном спинном мозге обнаружены новые подтипы микроглии c характерными для каждого из них динамическими преобразованиями, которые специфичны для разных стадий патологического процесса. Активация микроглии происходит
двумя волнами. Наиболее выраженные изменения микроглии отмечены на 3-и и 14-е сутки после ТСМ. В подостром периоде ТСМ, когда нейровоспаление проявляется наиболее динамично, реакция микроглии сопровождается активацией семи генов-концентраторов (hub genes) Itgbl, Ptprc, Cd63, Lgals3, Vav1, Shc1 и Casp4 [104]. К 38-м суткам основные типы клеток все еще существенно отклонены от состояния в интакт-ном спинном мозге [103].
Если клетки большинства типов в травмированном спинном мозге, как правило, возвращаются в исходное состояние, то для микроглии рассматривается возможность постоянного перепрограммирования молекулярного профиля, приводящего к пролонгированному изменению иммунного статуса в травмированном спинном мозге. При ТСМ у мышей обнаружены микроглиоциты с повышенной экспрессией ассоциированных с регенерацией молекул. Подобные клетки характерны для спинного мозга новорожденных мышей, но с небольшими различиями в экспрессии генов по сравнению с их неонатальными аналогами [103].
Заключение
Выбор оптимального режима терапии при травме спинного мозга требует понимания роли ключевых генов и соответствующих им внутриклеточных регуля-торных путей. Однако отбор для этой цели единичных генов не позволяет раскрыть глубокие молекулярные механизмы патогенеза травмы спинного мозга. Конструктивное решение этой задачи начато с применением технологий scRNAseq/snRNAseq.
Результаты недавних исследований с использвани-ем scRNA-seq/snRNA-seq показывают, что все ранее известные популяции спинальных нейронов оказываются гетерогенными по критерию дифференциальной экспрессии генов. Эти сведения приобрели важное клиническое значение для идентификации наиболее уязвимых нейронов при травме спинного мозга. При помощи технологий РНК-секвенирования определены молекулярно-генетические корреляты функциональных различий и регенераторного потенциала нейронов, локализованных в дорсальных и вентральных пластинках, что может лежать в основе специфики функционирования нейронных сетей в этих отделах серого вещества. В поясничном отделе спинного мозга в ответ на отдаленную травму в грудном отделе выявлена активация интернейронов, которые в интактном спинном мозге не принимают участия в акте шагания, но активируются после травмы и последующей эпиду-ральной электростимуляции. Данные RNAseq позволяют предположить, что принадлежащие к различным популяциям нейроны, образующие двигательные сети в поясничном отделе, могут реализовать различные молекулярные программы регенерации.
Технологии scRNAseq/snRNAseq расширяют наши представления о гетерогенности спинальных астроци-тов при травме спинного мозга. Они различаются по
экспрессии генов, контролирующих пролиферативную активность. Как в белом, так и в сером веществе идентифицированы астроциты, которые экспрессируют маркеры эпендимных клеток. Количество подобных астроцитов значительно возрастает в острую фазу травмы спинного мозга.
Молекулярный профиль, изменение длительности фаз клеточного цикла, сходная с радиальной глией морфология астроцито-эпендимных клеток с высокой экспрессией маркера стволовых клеток нестина не только подтверждают данные о происхождении одной из популяций астроцитов из стволовой нейральной клетки, локализованной в эпендимном слое спинного мозга, но и указывают на присутствие подобных клеток в интактном спинном мозге.
Данные scRNA-seq в комплексе с иммунофлуо-ресцентным анализом показывают, что спинальные олигодендроциты разных популяций различаются топографически, по-разному реагируют на ТСМ и могут выполнять разные функции в ходе регенерации.
Технологии RNAseq позволили установить и детально проанализировать гетерогенность популяции и возрастной динамики транскриптома эпендимоци-тов в спинном мозге. Получены данные о проявлении у эпендимоцитов некоторых субпопуляций потенциала нейральных стволовых клеток и развертывании обычно латентной программы олигодендрогенеза при травме спинного мозга. Эти технологии позволили получить новые данные о сохранении ранними предшественниками в популяции эпендимоцитов возможности отвечать на действие стимулятора олигодендрогенеза транскрипционного фактора Olig2.
Технологии scRNAseq/snRNAseq выявили новые маркеры микроглии, по которым более надежно различаются активированные микроглия и макрофаги; дали возможность получить новые данные об участии микроглии в специфических механизмах координации взаимодействия между спинальными клетками различных типов при травме спинного мозга. Технология scRNA-seq позволила разделить микроглию на гомео-статическую и негомеостатическую, а в последней — выделить субпопуляции воспалительной, пролифери-рующей и мигрирующей микроглии.
При травме спинного мозга пространственная транскриптомика описывает в кластерах миелоидных клеток фенотипы моноцитов, индуцирующих хемотаксис; провоспалительных и пограничных макрофагов; а также дендритных клеток. Полученные данные позволяют рассматривать возможность постоянного перепрограммирования молекулярного профиля микро-глии, приводящего к пролонгированному изменению иммунного статуса в травмированном спинном мозге.
Развитие технологий РНК-секвенирования и пространственной транскриптомики открывает большие возможности для формулирования новых перспективных концепций, касающихся механизмов реорганизации нейронных связей и восстановления сенсомотор-ных функций при травме спинного мозга.
Вклад авторов: Ю.А. Челышев, И.Л. Ермолин — анализ публикаций и написание текста обзора.
Источники финансирования. Работа выполнена за счет средств гранта Российского научного фонда 23-25-00002.
Конфликт интересов. У авторов отсутствует конфликт интересов.
Литература/References
1. Côté M.P., Murray L.M., Knikou M. Spinal control of locomotion: individual neurons, their circuits and functions. Front Physiol 2018; 9: 784, https://doi.org/10.3389/fphys. 2018.00784.
2. Ramirez-Jarquin U.N., Tapia R. Excitatory and inhibitory neuronal circuits in the spinal cord and their role in the control of motor neuron function and degeneration. ACS Chem Neurosci 2018; 9(2): 211-216, https://doi.org/10.1021/ acschemneuro.7b00503.
3. Osseward P.J. II, Amin N.D., Moore J.D., Temple B.A., Barriga B.K., Bachmann L.C., Beltran F. Jr., Gullo M., Clark R.C., Driscoll S.P., Pfaff S.L., Hayashi M. Conserved genetic signatures parcellate cardinal spinal neuron classes into local and projection subsets. Science 2021; 372(6540): 385-393, https://doi.org/10.1126/science.abe0690.
4. Cahoy J.D., Emery B., Kaushal A., Foo L.C., Zamanian J.L., Christopherson K.S., Xing Y., Lubischer J.L., Krieg P.A., Krupenko S.A., Thompson W.J., Barres B.A. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci 2008; 28(1): 264-278, https://doi.org/10.1523/jneurosci.4178-07.2008.
5. Dobrott C.I., Sathyamurthy A., Levine A.J. Decoding cell type diversity within the spinal cord. Curr Opin Physiol 2019; 8: 1-6, https://doi.org/10.1016/j.cophys.2018.11.006.
6. Wu H., Kirita Y., Donnelly E.L., Humphreys B.D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol 2019; 30(1): 23-32, https://doi. org/10.1681/asn.2018090912.
7. Ding J., Adiconis X., Simmons S.K., Kowalczyk M.S., Hession C.C., Marjanovic N.D., Hughes T.K., Wadsworth M.H., Burks T., Nguyen L.T., Kwon J.Y.H., Barak B., Ge W., Kedaigle A.J., Carroll S., Li S., Hacohen N., Rozenblatt-Rosen O., Shalek A.K., Villani A.C., Regev A., Levin J.Z. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nat Biotechnol 2020; 38(6): 737-746, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0465-8.
8. Hwang B., Lee J.H., Bang D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med 2018; 50(8): 1-14, https://doi.org/10.1038/s12276-018-0071-8.
9. Chen G., Ning B., Shi T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet 2019; 10: 317, https://doi.org/10.3389/ fgene.2019.00317.
10. Slovin S., Carissimo A., Panariello F., Grimaldi A., Bouché V., Gambardella G., Cacchiarelli D. Single-cell RNA sequencing analysis: a step-by-step overview. Methods Mol Biol 2021; 2284: 343-365, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1307-8_19.
11. Cao Y., Zhu S., Yu B., Yao C. Single-cell RNA
sequencing for traumatic spinal cord injury. FASEB J 2022; 36(12): e22656, https://doi.org/10.1096/fj.202200943r.
12. Jovic D., Liang X., Zeng H., Lin L., Xu F., Luo Y. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med 2022; 12(3): e694, https://doi. org/10.1002/ctm2.694.
13. Liu Y., Liang S., Wang B., Zhao J., Zi X., Yan S., Dou T., Jia J., Wang K., Ge C. Advances in single-cell sequencing technology and its application in poultry science. Genes (Basel) 2022; 13(12): 2211, https://doi.org/10.3390/genes13122211.
14. Skinnider M.A., Gautier M., Yue A., Teo Y., Kathe C., Hutson T.H., Laskaratos A., de Coucy A., Regazzi N., Aureli V., James N.D., Schneider B., Sofroniew M.V., Barraud Q., Bloch J., Anderson M.A., Squair J.W., Courtine G. The Tabulae Paralytica: multimodal single-cell and spatial atlases of spinal cord injury. bioRxiv 2023, https://doi. org/10.1101/2023.06.23.544348.
15. Sathyamurthy A., Johnson K.R., Matson K.J.E., Dobrott C.I., Li L., Ryba A.R., Bergman T.B., Kelly M.C., Kelley M.W., Levine A.J. Massively parallel single nucleus transcriptional profiling defines spinal cord neurons and their activity during behavior. Cell Rep 2018; 22(8): 2216-2225, https://doi.org/10.1016Zj.celrep.2018.02.003.
16. Zeisel A., Hochgerner H., Lönnerberg P., Johnsson A., Memic F., van der Zwan J., Häring M., Braun E., Borm L.E., La Manno G., Codeluppi S., Furlan A., Lee K., Skene N., Harris K.D., Hjerling-Leffler J., Arenas E., Ernfors P., Marklund U., Linnarsson S. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell 2018; 174(4): 999-1014.e22, https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.06.021.
17. Russ D.E., Cross R.B.P., Li L., Koch S.C., Matson K.J.E., Yadav A., Alkaslasi M.R., Lee D.I., Le Pichon C.E., Menon V., Levine A.J. A harmonized atlas of mouse spinal cord cell types and their spatial organization. Nat Commun 2021; 12(1): 5722, https://doi.org/10.1038/s41467-021-25125-1.
18. Li Y., Chen Y., Li X., Wu J., Pan J.Y., Cai R.X., Yang R.Y., Wang X.D. RNA sequencing screening of differentially expressed genes after spinal cord injury. Neural Regen Res 2019; 14(9): 1583-1593, https://doi.org/10.4103/1673-5374.255994.
19. Zeisel A., Muñoz-Manchado A.B., Codeluppi S., Lönnerberg P., La Manno G., Juréus A., Marques S., Munguba H., He L., Betsholtz C., Rolny C., Castelo-Branco G., Hjerling-Leffler J., Linnarsson S. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science 2015; 347(6226): 1138-1142, https://doi. org/10.1126/science.aaa1934.
20. Masuda T., Sankowski R., Staszewski O., Böttcher C., Amann L., Sagar S., Scheiwe C., Nessler S., Kunz P., van Loo G., Coenen V.A., Reinacher P.C., Michel A., Sure U., Gold R., Grün D., Priller J., Stadelmann C., Prinz M. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature 2019; 566(7744): 388-392, https://doi.org/10.1038/s41586-019-0924-x.
21. Bomkamp C., Tripathy S.J., Bengtsson Gonzales C., Hjerling-Leffler J., Craig A.M., Pavlidis P. Transcriptomic correlates of electrophysiological and morphological diversity within and across excitatory and inhibitory neuron classes. PLoS Comput Biol 2019; 15(6): e1007113, https://doi.org/ 10.1371/journal.pcbi.1007113.
22. Sagner A., Briscoe J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development 2019; 146(22): dev182154, https://doi.org/10.1242/dev.182154.
23. Ratz M., von Berlin L., Larsson L., Martin M.,
Westholm J.O., La Manno G., Lundeberg J., Frisen J. Clonal relations in the mouse brain revealed by single-cell and spatial transcriptomics. Nat Neurosci 2022; 25(3): 285-294, https:// doi.org/10.1038/s41593-022-01011-x.
24. Stifani N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci 2014; 8: 293, https://doi.org/10.3389/fncel.2014.00293.
25. Morisaki Y., Niikura M., Watanabe M., Onishi K., Tanabe S., Moriwaki Y., Okuda T., Ohara S., Murayama S., Takao M., Uchida S., Yamanaka K., Misawa H. Selective expression of Osteopontin in ALS-resistant motor neurons is a critical determinant of late phase neurodegeneration mediated by matrix metalloproteinase-9. Sci Rep 2016; 6: 27354, https:// doi.org/10.1038/srep27354.
26. Bqczyk M., Manuel M., Roselli F., Zytnicki D. Diversity of mammalian motoneurons and motor units. Adv Neurobiol 2022; 28: 131-150, https://doi.org/10.1007/978-3-031-07167-6_6.
27. Miles G.B., Hartley R., Todd A.J., Brownstone R.M. Spinal cholinergic interneurons regulate the excitability of motoneurons during locomotion. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(7): 2448-2453, https://doi.org/10.1073/ pnas.0611134104.
28. Bikoff J.B., Gabitto M.I., Rivard A.F., Drobac E., Machado T.A., Miri A., Brenner-Morton S., Famojure E., Diaz C., Alvarez F.J., Mentis G.Z., Jessell T.M. Spinal inhibitory interneuron diversity delineates variant motor microcircuits. Cell 2016; 165(1): 207-219, https://doi.org/10.1016/j. cell.2016.01.027.
29. Bikoff J.B. Interneuron diversity and function in the spinal motor system. Curr Opin Physiol 2019; 8: 36-43, https:// doi.org/10.1016/j.cophys.2018.12.013.
30. Chen S., Yang G., Zhu Y., Liu Z., Wang W., Wei J., Li K., Wu J., Chen Z., Li Y., Mu S., OuYang L., Lei W. A comparative study of three interneuron types in the rat spinal cord. PLoS One 2016; 11(9): e0162969, https://doi.org/10.1371/journal. pone.0162969.
31. Bertuzzi M., Ampatzis K. Spinal cholinergic interneurons differentially control motoneuron excitability and alter the locomotor network operational range. Sci Rep 2018; 8(1): 1988, https://doi.org/10.1038/s41598-018-20493-z.
32. Sweeney L.B., Bikoff J.B., Gabitto M.I., Brenner-Morton S., Baek M., Yang J.H., Tabak E.G., Dasen J.S., Kintner C.R., Jessell T.M. Origin and segmental diversity of spinal inhibitory interneurons. Neuron 2018; 97(2): 341-355.e3, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.12.029.
33. Deska-Gauthier D., Zhang Y. The functional diversity of spinal interneurons and locomotor control. Curr Opin Physiol 2019; 8: 99-108, https://doi.org/10.1016/j.cophys. 2019.01.005.
34. Laliberte A.M., Goltash S., Lalonde N.R., Bui T.V. Propriospinal neurons: essential elements of locomotor control in the intact and possibly the injured spinal cord. Front Cell Neurosci 2019; 13: 512, https://doi.org/10.3389/ fncel.2019.00512.
35. Nascimento F., Broadhead M.J., Tetringa E., Tsape E., Zagoraiou L., Miles G.B. Synaptic mechanisms underlying modulation of locomotor-related motoneuron output by premotor cholinergic interneurons. Elife 2020; 9: e54170, https://doi.org/10.7554/elife.54170.
36. Alkaslasi M.R., Piccus Z.E., Hareendran S., Silberberg H., Chen L., Zhang Y., Petros T.J., Le Pichon C.E. Single nucleus RNA-sequencing defines unexpected diversity of cholinergic neuron types in the adult mouse spinal cord. Nat
Commun 2021; 12(1): 2471, https://doi.org/10.1038/s41467-021-22691-2.
37. Blum J.A., Klemm S., Shadrach J.L., Guttenplan K.A., Nakayama L., Kathiria A., Hoang P.T., Gautier O., Kaltschmidt J.A., Greenleaf W.J., Gitler A.D. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nat Neurosci 2021; 24(4): 572-583, https://doi.org/10.1038/ s41593-020-00795-0.
38. Liau E.S., Jin S., Chen Y.C., Liu W.S., Calon M., Nedelec S., Nie Q., Chen J.A. Single-cell transcriptomic analysis reveals diversity within mammalian spinal motor neurons. Nat Commun 2023; 14(1): 46, https://doi.org/10.1038/ s41467-022-35574-x.
39. Kaplan A., Spiller K.J., Towne C., Kanning K.C., Choe G.T., Geber A., Akay T., Aebischer P., Henderson C.E. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron 2014; 81(2): 333-348, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2013.12.009.
40. Nijssen J., Comley L.H., Hedlund E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol 2017; 133(6): 863-885, https://doi.org/ 10.1007/s00401-017-1708-8.
41. Schweingruber C., Hedlund E. The cell autonomous and non-cell autonomous aspects of neuronal vulnerability and resilience in amyotrophic lateral sclerosis. Biology (Basel) 2022; 11(8): 1191, https://doi.org/10.3390/biology11081191.
42. Taylor J.P., Brown R.H. Jr., Cleveland D.W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature 2016; 539(7628): 197206, https://doi.org/10.1038/nature20413.
43. Shi L.L., Zhang N., Xie X.M., Chen Y.J., Wang R., Shen L., Zhou J.S., Hu J.G., Lu H.Z. Transcriptome profile of rat genes in injured spinal cord at different stages by RNA-sequencing. BMC Genomics 2017; 18(1): 173, https://doi. org/10.1186/s12864-017-3532-x.
44. Floriddia E.M., Lourengo T., Zhang S., van Bruggen D., Hilscher M.M., Kukanja P., Gongalves Dos Santos J.P., Altinkok M., Yokota C., Llorens-Bobadilla E., Mulinyawe S.B., Graos M., Sun L.O., Frisen J., Nilsson M., Castelo-Branco G. Distinct oligodendrocyte populations have spatial preference and different responses to spinal cord injury. Nat Commun 2020; 11(1): 5860, https://doi.org/10.1038/s41467-020-19453-x.
45. Llorens-Bobadilla E., Chell J.M., Le Merre P., Wu Y., Zamboni M., Bergenstrahle J., Stenudd M., Sopova E., Lundeberg J., Shupliakov O., Carlen M., Frisen J. A latent lineage potential in resident neural stem cells enables spinal cord repair. Science 2020; 370(6512): eabb8795, https://doi. org/10.1126/science.abb8795.
46. Poplawski G.H.D., Kawaguchi R., Van Niekerk E., Lu P., Mehta N., Canete P., Lie R., Dragatsis I., Meves J.M., Zheng B., Coppola G., Tuszynski M.H. Injured adult neurons regress to an embryonic transcriptional growth state. Nature 2020; 581(7806): 77-82, https://doi.org/10.1038/s41586-020-2200-5.
47. Milich L.M., Choi J.S., Ryan C., Cerqueira S.R., Benavides S., Yahn S.L., Tsoulfas P., Lee J.K. Single-cell analysis of the cellular heterogeneity and interactions in the injured mouse spinal cord. J Exp Med 2021; 218(8): e20210040, https://doi.org/10.1084/jem.20210040.
48. Kathe C., Skinnider M.A., Hutson T.H., Regazzi N., Gautier M., Demesmaeker R., Komi S., Ceto S., James N.D., Cho N., Baud L., Galan K., Matson K.J.E., Rowald A., Kim K.,
Wang R., Minassian K., Prior J.O., Asboth L., Barraud Q., Lacour S.P., Levine A.J., Wagner F., Bloch J., Squair J.W., Courtine G. The neurons that restore walking after paralysis. Nature 2022; 611(7936): 540-547, https://doi.org/10.1038/ s41586-022-05385-7.
49. Matson K.J.E., Russ D.E., Kathe C., Hua I., Maric D., Ding Y., Krynitsky J., Pursley R., Sathyamurthy A., Squair J.W., Levi B.P., Courtine G., Levine A.J. Single cell atlas of spinal cord injury in mice reveals a pro-regenerative signature in spinocerebellar neurons. Nat Commun 2022; 13(1): 5628, https://doi.org/10.1038/s41467-022-33184-1.
50. Rodrigo Albors A., Singer G.A., Llorens-Bobadilla E., Frisén J., May A.P., Ponting C.P., Storey K.G. An ependymal cell census identifies heterogeneous and ongoing cell maturation in the adult mouse spinal cord that changes dynamically on injury. Dev Cell 2023; 58(3): 239-255.e10, https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.01.003.
51. Yadav A., Matson K.J.E., Li L., Hua I., Petrescu J., Kang K., Alkaslasi M.R., Lee D.I., Hasan S., Galuta A., Dedek A., Ameri S., Parnell J., Alshardan M.M., Qumqumji F.A., Alhamad S.M., Wang A.P., Poulen G., Lonjon N., Vachiery-Lahaye F., Gaur P., Nalls M.A., Qi Y.A., Maric D., Ward M.E., Hildebrand M.E., Mery P.F., Bourinet E., Bauchet L., Tsai E.C., Phatnani H., Le Pichon C.E., Menon V., Levine A.J. A cellular taxonomy of the adult human spinal cord. Neuron 2023; 111(3): 328-344.e7, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.01.007.
52. Sun J., Qiu J., Yang Q., Ju Q., Qu R., Wang X., Wu L., Xing L. Single-cell RNA sequencing reveals dysregulation of spinal cord cell types in a severe spinal muscular atrophy mouse model. PLoS Genet 2022; 18(9): e1010392, https://doi. org/10.1371/journal.pgen.1010392.
53. Chelyshev Y. More attention on segments remote from the primary spinal cord lesion site. Front Biosci (Landmark Ed) 2022; 27(8): 235, https://doi.org/10.31083/j.fbl2708235.
54. Челышев Ю.А., Шаймарданова Г.Ф., Мухамед-шина Я.О., Нигметзянова М.В. Глиальные барьеры при травме спинного мозга как мишень генно-клеточной терапии. Неврологический вестник 2013; 45(1): 87-93.
Chelyshev Y.A., Shaymardanova G.F., Muhamedshina Y.O., Nigmetzyanova M.V. Glial barriers at spinal cord injury as a target of gene-cell therapy. Nevrologiceskij vestnik 2013; 45(1): 87-93.
55. Northcutt A.J., Schulz D.J. Molecular mechanisms of homeostatic plasticity in central pattern generator networks. Dev Neurobiol 2020; 80(1-2): 58-69, https://doi.org/10.1002/ dneu.22727.
56. Grillner S., Kozlov A. The CPGs for limbed locomotion-facts and fiction. Int J Mol Sci 2021; 22(11): 5882, https://doi. org/10.3390/ijms22115882.
57. Fink K.L., Cafferty W.B. Reorganization of intact descending motor circuits to replace lost connections after injury. Neurotherapeutics 2016; 13(2): 370-381, https://doi. org/10.1007/s13311-016-0422-x.
58. Wang Y., Wu W., Wu X., Sun Y., Zhang Y.P., Deng L.X., Walker M.J., Qu W., Chen C., Liu N.K., Han Q., Dai H., Shields L.B., Shields C.B., Sengelaub D.R., Jones K.J., Smith G.M., Xu X.M. Remodeling of lumbar motor circuitry remote to a thoracic spinal cord injury promotes locomotor recovery. Elife 2018; 7: e39016, https://doi.org/10.7554/elife. 39016.
59. Anderson M.A., Squair J.W., Gautier M., Hutson T.H., Kathe C., Barraud Q., Bloch J., Courtine G. Natural and targeted circuit reorganization after spinal cord injury. Nat
Neurosci 2022; 25(12): 1584-1596, https://doi.org/10.1038/ s41593-022-01196-1.
60. McBride R.L., Feringa E.R. Ventral horn motoneurons 10, 20 and 52 weeks after T-9 spinal cord transection. Brain Res Bull 1992; 28(1): 57-60, https://doi.org/10.1016/0361-9230(92)90230-u.
61. Yokota K., Kubota K., Kobayakawa K., Saito T., Hara M., Kijima K., Maeda T., Katoh H., Ohkawa Y., Nakashima Y., Okada S. Pathological changes of distal motor neurons after complete spinal cord injury. Mol Brain 2019; 12(1): 4, https:// doi.org/10.1186/s13041-018-0422-3.
62. Poplawski G.H., Tuszynski M.H. Regeneration of corticospinal axons into neural progenitor cell grafts after spinal cord injury. Neurosci Insights 2020; 15: 2633105520974000, https://doi.org/10.1177/2633105520974000.
63. Jing X., Wang T., Huang S., Glorioso J.C., Albers K.M. The transcription factor Sox11 promotes nerve regeneration through activation of the regeneration-associated gene Sprr1a. Exp Neurol 2012; 233(1): 221-232, https://doi.org/10.1016/j. expneurol.2011.10.005.
64. Fagoe N.D., Attwell C.L., Kouwenhoven D., Verhaagen J., Mason M.R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet 2015; 24(23): 6788-6800, https://doi.org/10.1093/hmg/ddv383.
65. Nguyen M.Q., Le Pichon C.E., Ryba N. Stereotyped transcriptomic transformation of somatosensory neurons in response to injury. Elife 2019; 8: e49679, https://doi. org/10.7554/eLife.49679.
66. Renthal W., Tochitsky I., Yang L., Cheng Y.C., Li E., Kawaguchi R., Geschwind D.H., Woolf C.J. Transcriptional reprogramming of distinct peripheral sensory neuron subtypes after axonal injury. Neuron 2020; 108(1): 128-144.e9, https:// doi.org/10.1016/j.neuron.2020.07.026.
67. Akram R., Anwar H., Javed M.S., Rasul A., Imran A., Malik S.A., Raza C., Khan I.U., Sajid F., Iman T., Sun T., Han H.S., Hussain G. Axonal regeneration: underlying molecular mechanisms and potential therapeutic targets. Biomedicines 2022; 10(12): 3186, https://doi.org/10.3390/ biomedicines10123186.
68. Westergard T., Rothstein J.D. Astrocyte diversity: current insights and future directions. Neurochem Res 2020; 45(6): 1298-1305, https://doi.org/10.1007/s11064-020-02959-7.
69. Escartin C., Galea E., Lakatos A., O'Callaghan J.P., Petzold G.C., Serrano-Pozo A., Steinhäuser C., Volterra A., Carmignoto G., Agarwal A., Allen N.J., Araque A., Barbeito L., Barzilai A., Bergles D.E., Bonvento G., Butt A.M., Chen W.T., Cohen-Salmon M., Cunningham C., Deneen B., De Strooper B., Díaz-Castro B., Farina C., Freeman M., Gallo V., Goldman J.E., Goldman S.A., Götz M., Gutiérrez A., Haydon P.G., Heiland D.H., Hol E.M., Holt M.G., lino M., Kastanenka K.V., Kettenmann H., Khakh B.S., Koizumi S., Lee C.J., Liddelow S.A., MacVicar B.A., Magistretti P., Messing A., Mishra A., Molofsky A.V., Murai K.K., Norris C.M., Okada S., Oliet S.H.R., Oliveira J.F., Panatier A., Parpura V., Pekna M., Pekny M., Pellerin L., Perea G., Pérez-Nievas B.G., Pfrieger F.W., Poskanzer K.E., Quintana F.J., Ransohoff R.M., Riquelme-Perez M., Robel S., Rose C.R., Rothstein J.D., Rouach N., Rowitch D.H., Semyanov A., Sirko S., Sontheimer H., Swanson R.A., Vitorica J., Wanner I.B., Wood L.B., Wu J., Zheng B., Zimmer E.R., Zorec R., Sofroniew M.V., Verkhratsky A. Reactive astrocyte
nomenclature, definitions, and future directions. Nat Neurosci 2021; 24(3): 312-325, https://doi.org/10.1038/s41593-020-00783-4.
70. Endo F., Kasai A., Soto J.S., Yu X., Qu Z., Hashimoto H., Gradinaru V., Kawaguchi R., Khakh B.S. Molecular basis of astrocyte diversity and morphology across the CNS in health and disease. Science 2022; 378(6619): eadc9020, https://doi. org/10.1126/science.adc9020.
71. Prabhakar P., Pielot R., Landgraf P., Wissing J., Bayrhammer A., van Ham M., Gundelfinger E.D., Jänsch L., Dieterich D.C., Müller A. Monitoring regional astrocyte diversity by cell type-specific proteomic labeling in vivo. Glia 2023; 71(3): 682-703, https://doi.org/10.1002/glia.24304.
72. Wei H., Wu X., Withrow J., Cuevas-Diaz Duran R., Singh S., Chaboub L.S., Rakshit J., Mejia J., Rolfe A., Herrera J.J., Horner P.J., Wu J.Q. Glial progenitor heterogeneity and key regulators revealed by single-cell RNA sequencing provide insight to regeneration in spinal cord injury. Cell Rep 2023; 42(5): 112486, https://doi.org/10.1016/j. celrep.2023.112486.
73. Bernal A., Arranz L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cell Mol Life Sci 2018; 75(12): 2177-2195, https://doi.org/10.1007/s00018-018-2794-z.
74. Adams K.L., Gallo V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci 2018; 21(1): 9-15, https://doi. org/10.1038/s41593-017-0033-9.
75. Nicaise A.M., D'Angelo A., lonescu R.B., Krzak G., Willis C.M., Pluchino S. The role of neural stem cells in regulating glial scar formation and repair. Cell Tissue Res 2022; 387(3): 399-414, https://doi.org/10.1007/s00441-021-03554-0.
76. Alfaro-Cervello C., Cebrian-Silla A., Soriano-Navarro M., Garcia-Tarraga P., Matias-Guiu J., Gomez-Pinedo U., Molina Aguilar P., Alvarez-Buylla A., Luquin M.R., Garcia-Verdugo J.M. The adult macaque spinal cord central canal zone contains proliferative cells and closely resembles the human. J Comp Neurol 2014; 522(8): 1800-1817, https://doi. org/10.1002/cne.23501.
77. Paniagua-Torija B., Norenberg M., Arevalo-Martin A., Carballosa-Gautam M.M., Campos-Martin Y., Molina-Holgado E., Garcia-Ovejero D. Cells in the adult human spinal cord ependymal region do not proliferate after injury. J Pathol 2018; 246(4): 415-421, https://doi.org/10.1002/path.5151.
78. Dromard C., Guillon H., Rigau V., Ripoll C., Sabourin J.C., Perrin F.E., Scamps F., Bozza S., Sabatier P., Lonjon N., Duffau H., Vachiery-Lahaye F., Prieto M., Tran Van Ba C., Deleyrolle L., Boularan A., Langley K., Gaviria M., Privat A., Hugnot J.P., Bauchet L. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res 2008; 86(9): 1916-1926, https://doi.org/10.1002/jnr.21646.
79. Mothe A.J., Zahir T., Santaguida C., Cook D., Tator C.H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One 2011; 6(11): e27079, https://doi. org/10.1371/journal.pone.0027079.
80. Hugnot J.P. Isolate and culture neural stem cells from the mouse adult spinal cord. Methods Mol Biol 2013; 1059: 5363, https://doi.org/10.1007/978-1-62703-574-3_5.
81. Frederico B., Martins I., Chapela D., Gasparrini F., Chakravarty P., Ackels T., Piot C., Almeida B., Carvalho J., Ciccarelli A., Peddie C.J., Rogers N., Briscoe J., Guillemot F.,
Schaefer A.T., Saúde L., Reis e Sousa C. DNGR-1-tracing marks an ependymal cell subset with damage-responsive neural stem cell potential. Dev Cell 2022; 57(16): 1957-1975.e9, https://doi.Org/10.1016/j.devcel.2022.07.012.
82. Stenudd M., Sabelström H., Llorens-Bobadilla E., Zamboni M., Blom H., Brismar H., Zhang S., Basak O., Clevers H., Göritz C., Barnabé-Heider F., Frisén J. Identification of a discrete subpopulation of spinal cord ependymal cells with neural stem cell properties. Cell Rep 2022; 38(9): 110440, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110440.
83. Fiorelli R., Cebrian-Silla A., Garcia-Verdugo J.M., Raineteau O. The adult spinal cord harbors a population of GFAP-positive progenitors with limited self-renewal potential. Glia 2013; 61(12): 2100-2113, https://doi.org/10.1002/ glia.22579.
84. Redmond S.A., Figueres-Oñate M., Obernier K., Nascimento M.A., Parraguez J.I., López-Mascaraque L., Fuentealba L.C., Alvarez-Buylla A. Development of ependymal and postnatal neural stem cells and their origin from a common embryonic progenitor. Cell Rep 2019; 27(2): 429-441.e3, https://doi.org/10.1016/jcelrep.2019.01.088.
85. Meletis K., Barnabé-Heider F., Carlén M., Evergren E., Tomilin N., Shupliakov O., Frisén J. Spinal cord injury reveals multilineage differentiation of ependymal cells. PLoS Biol 2008; 6(7): e182, https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060182.
86. Rolls A., Shechter R., Schwartz M. The bright side of the glial scar in CNS repair. Nat Rev Neurosci 2009; 10(3): 235-241, https://doi.org/10.1038/nrn2591.
87. Barnabé-Heider F., Göritz C., Sabelström H., Takebayashi H., Pfrieger F.W., Meletis K., Frisén J. Origin of new glial cells in intact and injured adult spinal cord. Cell Stem Cell 2010; 7(4): 470-482, https://doi.org/10.1016/j.stem. 2010.07.014.
88. Marinelli S., Basilico B., Marrone M.C., Ragozzino D. Microglia-neuron crosstalk: signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol 2019; 94: 138-151, https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2019.05.017.
89. Borst K., Dumas A.A., Prinz M. Microglia: immune and non-immune functions. Immunity 2021; 54(10): 2194-2208, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.09.014.
90. Ball J.B., Green-Fulgham S.M., Watkins L.R. Mechanisms of microglia-mediated synapse turnover and synaptogenesis. Prog Neurobiol 2022; 218: 102336, https:// doi.org/10.1016/j.pneurobio.2022.102336.
91. McNamara N.B., Munro D.A.D., Bestard-Cuche N., Uyeda A., Bogie J.F.J., Hoffmann A., Holloway R.K., Molina-Gonzalez I., Askew K.E., Mitchell S., Mungall W., Dodds M., Dittmayer C., Moss J., Rose J., Szymkowiak S., Amann L., McColl B.W., Prinz M., Spires-Jones T.L., Stenzel W., Horsburgh K., Hendriks J.J.A., Pridans C., Muramatsu R., Williams A., Priller J., Miron V.E. Microglia regulate central nervous system myelin growth and integrity. Nature 2023; 613(7942): 120-129, https://doi.org/10.1038/ s41586-022-05534-y.
92. Li Q., Cheng Z., Zhou L., Darmanis S., Neff N.F., Okamoto J., Gulati G., Bennett M.L., Sun L.O., Clarke L.E., Marschallinger J., Yu G., Quake S.R., Wyss-Coray T., Barres B.A. Developmental heterogeneity of microglia and brain myeloid cells revealed by deep single-cell RNA sequencing. Neuron 2019; 101(2): 207-223.e10, https://doi. org/10.1016/j.neuron.2018.12.006.
93. Hakim R., Zachariadis V., Sankavaram S.R., Han J., Harris R.A., Brundin L., Enge M., Svensson M. Spinal cord
injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci 2021; 41(40): 8441-8459, https://doi. org/10.1523/jneurosci.0860-21.2021.
94. Healy L.M., Zia S., Plemel J.R. Towards a definition of microglia heterogeneity. Commun Biol 2022; 5(1): 1114, https:// doi.org/10.1038/s42003-022-04081-6.
95. Xu L., Wang J., Ding Y., Wang L., Zhu Y.J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Front Neurol 2022; 12: 796704, https://doi.org/10.3389/ fneur.2021.796704.
96. Hickman S., Izzy S., Sen P., Morsett L., El Khoury J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci 2018; 21(10): 1359-1369, https://doi.org/10.1038/s41593-018-0242-x.
97. Zhou X., He X., Ren Y. Function of microglia and macrophages in secondary damage after spinal cord injury. Neural Regen Res 2014; 9(20): 1787-1795, https://doi. org/10.4103/1673-5374.143423.
98. Kroner A., Rosas Almanza J. Role of microglia in spinal cord injury. Neurosci Lett 2019; 709: 134370, https://doi. org/10.1016/j.neulet.2019.134370.
99. Ding Y., Zhang D., Wang S., Zhang X., Yang J. Hematogenous macrophages: a new therapeutic target for spinal cord injury. Front Cell Dev Biol 2021; 9: 767888, https:// doi.org/10.3389/fcell.2021.767888.
100. Kisucka A., Bimbova K., Bacova M., Galik J.,
Lukacova N. Activation of neuroprotective microglia and astrocytes at the lesion site and in the adjacent segments is crucial for spontaneous locomotor recovery after spinal cord injury. Cells 2021; 10(8): 1943, https://doi.org/10.3390/ cells10081943.
101. Kierdorf K., Masuda T., Jordäo M.J.C., Prinz M. Macrophages at CNS interfaces: ontogeny and function in health and disease. Nat Rev Neurosci 2019; 20(9): 547-562, https://doi.org/10.1038/s41583-019-0201-x.
102. Brennan F.H., Li Y., Wang C., Ma A., Guo Q., Li Y., Pukos N., Campbell W.A., Witcher K.G., Guan Z., Kigerl K.A., Hall J.C.E., Godbout J.P., Fischer A.J., McTigue D.M., He Z., Ma Q., Popovich P.G. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun 2022; 13(1): 4096, https://doi.org/10.1038/s41467-022-31797-0.
103. Li C., Wu Z., Zhou L., Shao J., Hu X., Xu W., Ren Y., Zhu X., Ge W., Zhang K., Liu J., Huang R., Yu J., Luo D., Yang X., Zhu W., Zhu R., Zheng C., Sun Y.E., Cheng L. Temporal and spatial cellular and molecular pathological alterations with single-cell resolution in the adult spinal cord after injury. Signal Transduct Target Ther 2022; 7(1): 65, https://doi.org/10.1038/s41392-022-00885-4.
104. Yan L., Fu J., Dong X., Chen B., Hong H., Cui Z. Identification of hub genes in the subacute spinal cord injury in rats. BMC Neurosci 2022; 23(1): 51, https://doi.org/10.1186/ s12868-022-00737-5.
