CC BY
217
Генно-клеточная терапия бокового амиотрофического склероза мононуклеарными клетками пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующими гены нейронной молекулы адгезии L1cam и сосудистого эндотелиального фактора роста vegf
АА. Ризванов 1-2-3, Д.С. Гусева 1, И.И. Салафутдинов 2-3, Н.В. Кудряшова 2, АК. Шафигуллина1,
Ф.В. Баширов1, И.М. Газизов 1-4, М.С. Калигин 1, МА.Мухамедьяров 1, А.П. Киясов 1-4, PP. Исламов 1
1 Казанский государственный медицинский университет, Казань
2 Казанский [Приволжский) федеральный университет, Казань 3ГУЗ <Республиканская клиническая больница» М3 РТ, Казань
4 Банк стволовых клеток, Казань
Gene-cell therapy of amyotrophic lateral sclerosis with human umbilical cord blood mononuclear cells overexpressing neural adhesion molecule L.'lcam and vascular endothelial growth factor vegf genes
A.A. Rizvanov1гз, OS. Guseva 1,l.l. Salafutdinov33, N.V. Kudryashova 1, AK. Shafigullina 1, F.V. Bashirov 1,
I.M. Gazizov 1A, MS. Kaligin 1, M.A. Mukhamedyarov1, A.P, Kiyasovt4, R.R. Islamov1 1 Kazan State Medical University, Kazan
3 Kazan Federal University, Kazan
3 Republic Clinical Hospital, Kazan
4 Stem cell bank, Kazan
Трансплантацию генетически модифицированных клеток (стволовых, предшественниц, дифференцированных) активно исследуют как способ доставки ростовых факторов и молекул адгезии в поврежденную нервную ткань для поддержания жизнеспособности нейронов, обеспечения регенерации нервных отростков и восстановления утраченных межклеточных контактов. В настоящем исследовании для лечения бокового амиотрофического склероза на модели трансгенных мышей G93A мы сконструировали плазмидный вектор pBud-VEGF-L1 САМ, одновременно экспрессирующий молекулы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и нейронной молекулы адгезии L1 (L1CAM). Для доставки вектора в спинной мозг мышей использовали мононуклеар-ные клетки пуповинной крови человека. Трансплантация генетически модифицированных клеток, трансфицированных плазмидными векторами pBud-VEGF-L1 САМ, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L 1 САМ, выполнена путём инъекции (1х10Б клеток) в ретроорбитальное пространство мышей. Через две недели после трансплантации для идентификации и феноти-пирования генетически модифицированных мононуклеарных клеток проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов спинного мозга мышей с помощью антител к ядерному антигену человека (HNA) и одному из клеточных маркёров (эндотелиоцитов — CD34, астроцитов — S100, оли-годендроцитов — OSP, микроглии — 1Ьа1). При исследовании гистологических срезов спинного мозга мы обнаружили HNA ' CD34' -клетки как в белом, так и в сером веществе во всех экспериментальных группах. Маркёры макро- и микроглии в HNA ' -клетках не выявлены. Таким образом, сверхэкспрессия генов VEGF и/или L1CAM в монононукле-арных клетках пуповинной крови человека не влияет на их способность дифференцироваться в эндотелиоциты В СПИННОМ мозге трансгенных мышей G93A. Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови геном молекулы адгезии L1 cam подтверждена повышенной жизнеспособностью трансплантированных клеток, а геном сосудистого эндотелиального фактора роста vegf — поддержанием дифференцировки эндотелиоцитов и нейро-протекторным действием на повреждённые нейроны.
Transplantation of genetically modified cells (stem cells, progenitor, differentiated cells) is under intense investigation as a mean of delivery to the injured neural tissue of growth factors and adhesion molecules, which support survivability of neurons, provide regeneration of parts of the cells, stimulation of neuron projections and reestablish cell-cell contacts. In this study for treating amyotrophic lateral sclerosis we constructed plasmid vector pBud-VEGF-L1 CAM, which simultaneously express vascular endothelial growth factor (VEGF) and neural cell adhesion molecule 11 (L1CAM). We used human umbilical cord blood mononuclear cells (UCB-MC) as vectors for plasmid delivery to spinal cord of transgenic mice. Transplantation of UCB-MC, genetically modified with plasmids pBud-VEGF-L1CAM, pBud-VEGF-EGFP and pBud-EGFP-L1 CAM, was performed by retro orbital injection of 1х10Б cells per animal. Two weeks after transplantation we performed identification and phenotyping of genetically modified UCB-MC by dual immune staining of spinal cord slices using antibodies against human nuclear antigen (HNA) and antibodies against one of cellular markers (endoteliocytes — CD34, astrocytes — S100, oligodendrocytes — OSP, microglia — Iba1). Histological examination of spinal cord samples revealed HNA ' CD34 ' cells both in white and grey matter in all experimental groups. Markers of macro- and microglia were not detectable in HNA ' cells. Thus, overexpression of VEGF and L1CAM in UCB-MC did not affect their ability for differentiation into endoteliocytes in spinal cord of transgenic G93A mice. Genetic modification of UCB-MC with human cell adhesion molecule L1CAM is a promising approach for increasing viability of transplanted cells, while vascular endothelial growth factor VEGF promotes differentiation into endoteliocytes and provides neuroprotective effect on damaged neurons.
e-mail: [email protected]
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Ключевые слова: генно-клеточная терапия, боковой амиотрофический склероз, мононукпеарные клетки пуповинной крови человека, сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF, нейронная молекула адгезии L1.
Keywords: gene-cell therapy, amyotrophic lateral sclerosis, human umbilical cord blood mononuclear cells, vascular endothelial growth factor, neural adhesion molecule L1.
Введение
Генная терапия нейродегенеративных заболеваний, обусловленных наследственными или приобретёнными генными мутациями, a priori основана на патогенезе заболевания. Прямая генная терапия или генно-клеточная терапия (трансплантация генетически модифицированных клеток) нацелены на коррекцию функции мутированного гена с помощью соответствующего клонированного терапевтического гена. Другим важным направлением генной терапии в невропатологии является увеличение уровня экспрессии генов, кодирующих нейротрофические факторы, факторы роста и молекулы адгезии, поддерживающих выживание нервных клеток и стимулирующих нейрорегенерацию.
Боковой амиотрофический склероз принадлежит к группе нейродегенеративных заболеваний с прогрессирующей гибелью двигательных нейронов головного и спинного мозга. Этиология и патогенез гибели нейронов при наиболее частой (спорадической) форме заболевания не известны, но часть случаев семейной формы заболевания обусловлена доминантными мутациями гена sod1 (21q22.1^q22.2), кодирующего Cu/Zn—супероксиддисмутазу [1]. Значительный прогресс в понимании патогенеза и методов лечения заболевания был получен в экспериментах на трансгенных мышах G93A, экспрессирующих мутированный ген sod1 человека. У таких мышей развивается прогрессирующая дегенерация двигательных нейронов (как и при семейной форме бокового амиотрофического склероза у человека) [2—4]. Поддержание жизни нейронов, вовлеченных в патологический процесс, и восстановление утраченных межклеточных связей в нейронных сетях с помощью нейротрофических факторов, факторов роста и молекул адгезии могут существенно повысить качество и продолжительность жизни больных. В этой связи одним из перспективных методов лечения бокового амиотрофического склероза считается генная терапия или сочетание генной и клеточной терапии — трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих факторы для поддержания выживания нейронов.
В этом отношении сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) обоснованно считается одним из наиболее перспективных нейротрофических факторов. Линия мышей Vegf>/à, у которых в промоторе гена vegf отсутствует чувствительный элемент к фактору гипоксии (HIF-1—) [5—6], характеризуется прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, напоминающей таковую при боковом амиотрофическом склерозе. У трансгенных мышей G93A, экспрессирующих мутантный ген супероксиддисмутазы sod1 (при мутации гена развивается наследственная форма бокового амиотрофического склероза), показана ослабленная индуцированная гипоксией экспрессия гена vegf [7]. При скрещивании Vegf>/à и мышей G93A полученное потомство погибает в раннем возрасте в результате выраженной дегенерации мотонейронов [6]. In vitro VEGF способствует выживанию мотонейронов, экспрессирующих мутантный ген sod1 [8]. Однократная инъекция мышам G93A лентивирусного вектора, экспрессирующего ген vegf, позволяла отсрочить начало заболевания и увеличивала продолжительность жизни
мышей [9]. В клинической же практике применение лентивирусного вектора имеет ограничения, связанные с его выраженными иммуногенными и онкогенными свойствами [10]. Более безопасными для генной терапии считают плазмидные векторы.
Доставка в организм терапевтического гена с помощью плазмидного вектора осуществляется путем инъекции и/или путем трансплантации клеток, трансфицированных плазмидным вектором. Последний способ генно-клеточной терапии более эффективен, поскольку позволяет контролировать уровень экспрессии терапевтического гена в клетках. Трансфекция клеток двухкассетными плазмидными векторами позволяет одновременную экспрессию двух терапевтических генов.
Ранее нами была выдвинута гипотеза, что эффективность доставки терапевтического гена в нервную ткань можно увеличить путём трансфекции клеток двухкассетными плазмидными векторами, экспрессирующими терапевтический ген VEGF и нейронную молекулу адгезии Исат. Можно предположить, что одновременная сверхэкспрессия генов нейропротектор-ного фактора и нейронной молекулы адгезии в мононуклеарных клетках пуповинной крови позволит облегчить миграцию генетически модифицированных клеток через гематоэнцефалический барьер, повысить выживаемость клеток и увеличить продолжительность действия нейротрофического фактора на клетки-мишени. Таким образом, создание двухкассетного плазмидного вектора, экспрессирующего терапевтический ген и тканеспецифичную молекулу адгезии, представляет собой перспективное направление генной терапии. Модифицирование трансплантируемых клеток двухкассетными плазмидными векторами позволит получить более выраженный ней-ропротекторный эффект, однако неизвестно, как трансфицированные гены могут повлиять на фенотип мононуклеарных клеток.
В настоящем исследовании для лечения бокового амиотрофического склероза у трансгенных мышей G93A нами был сконструирован плазмидный вектор pBud-VEGF-L1 САМ, одновременно экспрессирующий vegf и Исат. Для доставки плазмидного вектора в спинной мозг мышей были использованы мононук-леарные клетки пуповинной крови человека. Имму-нофлуоресцентным методом были изучены хоуминг, выживание и фенотипические характеристики трансплантированных клеток.
Материал и методы
Создание экспрессионных плазмидных векторов
Клонирование гена vegf (изоформа 165) человека и создание экспрессионного плазмидного вектора pBud-VEGF-EGFP описано в предыдущей работе [11]. Специфические праймеры для ПЦР-амплификации полной открытой рамки считывания гена Исат созданы на основе нуклеотидных последовательностей, полученных из базы данных GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) (табл. 1). Концы праймеров содержат адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции для Hindlll и Xbal, по которым проводили клонирование генов в экспрессионный плазмидный вектор pcDNA 3.1 + (Invitrogen). Клонирование
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 4, 2010
проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для ПЦР-амплификации использовали плазмиду pcDNA3-hL1 А-4А (Addgene, plasmid 13268) [12]. Ко-экспрессирующие векторы собраны на основе pBudCE4.1 (Invitrogen) путём субклонирования кДНК гена Исат (под контролем промотора CMV) по сайтам рестрикции Hind\\\ и ХЬа\ в полученные ранее плазмидные конструкции pBud-VEGF или pBud-EGFP, содержащие гены vegf или egfp соответственно (под контролем промотора EF-1—). Конечное подтверждение получения экспрессионных плазмид pBud-VEGF-L1 САМ и pBud-EGFP-L1 САМ провели методом ДНК-секвенирования с помощью стандартных вектор-специфичных и L1 САМ-специфичных праймеров на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Таблица 1, Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР-амплификации и секвенирования гена Исат человека
Название Нуклеотидная
праймера последовательность
hLI-F-Hindlll GGaagCttCGGGAAAGATGGTCGTGGC
hLI-R-Xbal CTtCtagATTCTAGGGCCACGGCAGGG
hLICAM-SIOR* CACTTGGGGGAGGGTTGC
hL1CAM-919R* AGCAGCTGCAGGGTCTTGTTG
hL1CAM-1334R* AGCCATGTACGTCTGATTGTCC
hL1CAM-179OR* GCTGTAGTTGCCCTGGTCGCTGTA
hL1CAM-2186R* CTTCACATCCACAGGGTTCTTC
hL1CAM-2S3OR* TCCACCGGCCGCCACTTGAC
hL1CAM-2939R* GGGGTCCCGAAGGTTGAA
hL1CAM-39O9R* GATCCGAGGCAGCAAGTTCTC
Примечание: * Праймеры для секвенирования кДНК гена Исат.
Выделение и трансфекция мононуклеарных клеток
пуповинной крови человека
Заготовку пуповинной крови человека проводили после получения информированного согласия у беременной и после тщательного дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток. Пуповинную кровь забирал специально обученный персонал роддома по инструкции Банка стволовых клеток Казанского государственного медицинского университета. Сразу после рождения ребёнка и отсечения пуповины кровь собирали в стандартную систему для взятия донорской крови (контейнеры пластиковые обыкновенные CPDA-1 250 GG, Terumo). Пуповинную кровь в изотермическом контейнере в течение 12ч после забора доставляли в Банк стволовых клеток, где из неё выделяли моно-нуклеарную фракцию с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла [13].
Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека после выделения ресуспензировали в среде RPMI 1640 (Sigma), смешивали с очищенной плазмидной ДНК и подвергали воздействию электрического импульса (300V, 1000/uF) на приборе Gene Puiser Xcell Total System (BioRad, США) в фирменных кюветах с зазором электродов 0,4 см. После воздействия электрического импульса клетки переносили в лунку культурального планшета и добавляли 400 мкл среды RPMI
1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (Sigma) в конечной концентрации 10%. Клетки восстанавливали в течение 10—12 ч в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% С02.
Анализ экспрессии мРНК генов vegf и L1 cam
Общую РНК из клеточных осадков выделяли с помощью набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche), согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора Omniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen). Для количественной оценки экспрессии генов-мишеней применяли ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan. Поиск комбинаций праймеров и проб для ПЦР-РВ проводили с помощью программного пакета PrimerExpress (Applied Biosystems, США) на основании нуклеотидных последовательностей генов-мишеней, полученных из базы данных GeneBank.
Пробы для ПЦР-РВ содержали 5'-концевую флуоресцентную метку FAM и З'-концевой гаситель RTQ-1. Синтез праймеров и проб осуществляла фирма Синтол (г. Москва) (табл. 2). В качестве контроля количества наносимого образца применяли комбинации праймеров, специфичных к гену ß-актина человека. Для ПЦР-РВ по технологии TaqMan применяли «Реакционную смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ» (Синтол, Москва) в соответствии с инструкциями производителя.
Таблица 2. Праймеры и пробы для ПЦР в реальном времени
Ген Нуклеотидная последовательность
hL1CAM-TMprobe ACCTGCAGCCTGACACTGACTACGAGATC
hL1CAM-TM3211F CGCCACAGTATGTCAGCTACAAC
hL1CAM-TM3310R CGGAACATCCTCTCCTTAAACAA
hVEGF-TMprobe TCCCAGGCTGCACCCATGG
hVEGF-TM49F TACCTCCACCAT GCCAAGT G
hVEGF-TM110R TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT
ß-actin- TMprobe(human) CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAGGC
ß-actin- TM-F(human) GCGAGAAGATGACCCAGGATC
ß-actin- TM-R(human) CCAGTGGTACGGCCAGAGG
ПЦР-РВ проводили на приборе iQ5 Multicolor RealTime PCR Detection system (BioRad, США). Количественный анализ уровня экспрессии осуществляли с помощью стандартной прямой, построенной на основе серийного разведения кДНК клеток пуповинной крови, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-L1CAM. Реакции ПЦР-РВ выполняли в дубликатах. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе Excel 2002.
Трансгенные мыши G93A
Трансгенные мыши B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J, экспрессирующие мутантный ген человека — Cu/Zn-супероксиддисмутазу sod1 (Gly93—>Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), приобретены из питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А. Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН). В виварии Казанского государ-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 4, 2010
ственного медицинского университета половозрелых мышей G93A содержали в стандартных лабораторных условиях. В возрасте 24—28 нед. самцы и самки были разделены на три группы по 3^4 мыши для трансплантации генетически модифицированных мо-нонуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидными векторами (1) pBud-VEGF-LICAM, (2) pBud-VEGF-EGFP и (3) pBud-EGFP-L1CAM. Трансплантацию выполняли путём инъекции 1x108 генетически модифицированных клеток в ретроорбитальное пространство мышей G93A. Через
2 нед. после трансплантации животных наркотизировали, через большой круг кровообращения транскардиально перфузировали сначала холодным фосфатносолевым буфером (ФС) буфере (рН = 7,4), затем — холодным 4% раствором параформальдегида (рН = 7,4). Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, постфиксировали в растворе параформальдегида в течение 4 ч на ротационном столике. В целях криопротекции фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы на ФС буфере (pH = 7,4).
Иммунофлуоресцентное окрашивание
Для приготовления криостатных срезов сегменты спинного мозга помещали в заливочную среду TBS (Triangle Biomedical Science, Durham, NC) и замораживали в течение 2 минут в 2-метил-бутане (изопентан), предварительно охлаждённом до -30°С. Серийные продольные срезы толщиной 20 мкм монтировали на
предметные стёкла SuperFrostOPIus, подсушивали не менее одного часа при комнатной температуре и подвергали двойному иммунофлуоресцентному окрашиванию. С целью оптимизации связывания антител с антигенами срезы обрабатывали 0,01 М раствором цитрата натрия (pH 9,0) при 70°С на водяной бане в течение 30 мин [14]. После охлаждения срезов до комнатной температуры и промывки в ФС буфере, блокировали неспецифические места связывания в ФС буфере, содержащем 0,2% Тритон Х-100, 0,02% азид натрия и 5% сыворотку осла, в течение 1 ч при комнатной температуре. Для идентификации антигена (АГ) срезы инкубировали с первичными антителами (АТ) (табл. 3) в течение 3 сут. при 4°С, промывали в ФС буфере, и затем инкубировали со вторичными АТ осла, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa 594 или Dy Light 649 (разведение 1:200), в течение 2 ч при комнатной температуре. Для визуализации клеточных ядер срезы дополнительно окрашивали в течение 20 мин при комнатной температуре раствором бис-бензимида (краситель Hoechst 33258,
5 мкг/мл в ФС буфере, Sigma). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и изучали при помощи лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 200М).
Для систематизации результатов иммунофлуорес-центного окрашивания номера рисунков с визуализированными АГ в каждой экспериментальной группе мышей помещены в таблицу 4.
Таблица 3, Антитела, применённые для иммунофлуоресцентного окрашивания
Антиген Антитела Разведение Производитель
CD34 (маркёр эндотелиальных клеток) Кролик, поликлональные 1:100 Abeam
HNA (Human nuclei antigene) ядерный АГ человека Мышь, моноклональные 1:20 Chemicon®
Ibal (маркёр микроглии) Кролик, поликлональные 1:600 Bioeare Medical
OSP (Oligodendrocyte Specific Protein) специфичный белок олигодендроцитов Кролик, поликлональные 1:2000 Abeam
S-100 (маркёр астроцитов, шванновских клеток) Кролик, поликлональные 1:2000 DakoCytomation
Таблица 4. Фенотипирование трансплантированных генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека
Плазмидный вектор Двойное иммунофлуоресцентное окращивание
CD34 + HNA Ibal + HNA OSP + HNA S-100 + HNA
pBud-VEGF-ИСАМ Рис. 2 Рис. 3 Рис. 4 Рис. S
pBud-VEGF-EGFP Рис. 6 Рис. 7 Рис. 8 Рис. 9
pBud-EGFP-ИСАМ Рис. 10 Рис. 11 Рис. 12 Рис. 13
Результаты исследования
Экспрессия egfp, vegf и L1 cam в трансфицированных мононуклеарных клетках пуповинной крови человека
Мононуклеарные клетки выделяли из свежей пуповинной крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Полученные клетки трансфицировали плазмидными векторами pBud-VEGF-L1 САМ, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L1CAM методом электропорации. Уровень мРНК в
мононуклеарных клетках пуповинной крови человека определяли через 24 часа после трансфекции плазмидой pBud-VEGF-L1 САМ с помощью ПЦР-РВ (рис. 1). Результаты анализа показали, что уровень мРНК генов vegf и Исат в трансфицированных клетках превысил уровень соответствующих мРНК в нетрансфи-цированных клетках в 197 и 5681 раз соответственно, что свидетельствует об эффективной экспрессии рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках in vitro.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 4, 2010
10 ООО
cont VEGF-hLICAM
Рис. 1. Экспрессия мРНК генов vegf и L1 cam в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-L 1 САМ. Относительный уровень экспрессии мРНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени со специфичными праймерами и пробами TaqMan. Уровень экспрессии мРНК в нетрансфицированных клетках [cont] был принят за 100%
Анализ иммунофлуоресцентного окрашивания генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека в спинном мозге мышей G93A
Для идентификации и фенотипирования генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека было проведено двой-
ное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов спинного мозга мышей с помощью АТ к ядерному АГ человека (HNA) и АТ к одному из клеточных маркёров (эндотелиальных клеток — CD34, астроцитов — S100, олигодендроцитов — 0SP и микроглии — Ibai). Исследование срезов спинного мозга выявило HNA-позитивные клетки как в белом, так и сером веществе спинного мозга во всех экспериментальных группах.
Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-L1 САМ, после 14 сут. трансплантации мышам G93A.
Согласно нашим предыдущим исследованиям [15], в спинном мозге данной подопытной группы мышей мы идентифицировали мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, экспрессирующие маркёр эндотелиальных клеток (НЫА+С034+-клетки) (рис. 2A-D, A’-D’). Важно отметить, что часть HNA+-клеток не экспрессировала молекулу CD34 (НЫА+С034~-клетки). Такие клетки в большинстве случаев находились в непосредственной близости от мышиных Сй34+-клеток (рис. 2Е-Н, Е’-Н’). Все выявленные НЫА+-клетки не реагировали с АТ к маркёру микроглии Ibai (HNA+lbal^-клетки) (рис. 3), с АТ к маркёру олигодендроцитов OSP (HNA+OSP^-клет-ки) (рис. 4) и с АТ к белку S-100, который является маркёром астроцитов в центральной нервной системе (HNA+S-100~-клетки) (рис. 5).
HNA Nuclei CD34 Merge
Рис. 2. С034-позитивные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-L 1 САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-Н — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA) и маркёра эндотелиальных клеток [CD34}. А, Е — ядерный АГ человека [красный]; В, F — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); C.G — маркёр эндотелиальных клеток CD34 [зелёный); D — объединение панелей A-С и Н — объединение панелей E-G, совмещённые с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-Н [вставки А’-Н’, соответственно) демонстрируют HNACD34'-клетку [A’-D’) и HNA CD34 -клетку [Е’-Н’) при большем увеличении. Измерительная линейка: А-Н, 25 мкм; A’-D’, 5 мкм, Е’-Н, Юмкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
HNA Nuclei Ibal Merge
Рис. 3. Iba 1-негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-L1 САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A, А-D —двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA) и маркёра клеток микроглии [Iba 1). А— ядерный АГ человека [красный];
В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); С — маркёр клеток микроглии Ibal [зелёный); D — объединение панелей A-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-D [вставки A’-D’, соответственно) демонстрируют HNA’lbaT -клетку в непосредственной близости от которой находится отросток Ibal-позитивной клетки микроглии мыши при большем увеличении. Измерительная линейка: A-D, 25 мкм; A’-D’, 5 мкм
HNA Nuclei OSP Merge
Рис. 4. OSP-негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-L 1 САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-D —двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA) и маркёра олигодендроцитов [OSP). А — ядерный АГ человека [красный); В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); С — специфический белок олигодендроцитов [зелёный); D — объединение панелей A-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-D [вставки A’-D’, соответственно) демонстрируют HNA OSP -клетку при большем увеличении. Измерительная линейка: A-D, 25 мкм; A’-D’, 5 мкм
HNA Nuclei S-IOO Merge
Рис. 5. S-100 негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-L1 САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-D —двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA) и маркёра астроцитов [S-10О). А — ядерный АГ человека [красный); В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); С — S-100 [зелёный); D — объединение панелей A-С. Обведённые области на панелях А-D [вставки A’-D’, соответственно) демонстрируют HNA'3-100 -клетку в контакте с отростками астроцитов мыши при большем увеличении. Измерительная линейка: A-D, 25 мкм; A’-D’, 5 мкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-EGFP, после 14 сут. трансплантации мышам G93A.
Как и в предыдущей подопытной группе (трансплантация клеток трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-L1 САМ) в спинном мозге мышей были обнаружены мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, экспрессирующие маркёр эндотелиальных клеток молекулу CD34 (рис. 6А-Н, А’^Н’). Рядом с НЫА+С034+-клетками часто присутствуют С034-негативные мононуклеарные клетки человека (НЫА+С034~-клетки) (рис. 6I-L, Г-Н’). При иммунофлуоресцентном окрашивании срезов спинного мозга мышей с АТ к маркёру клеток микроглии Ibal мы не зарегистрировали Ibal-позитивных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (HNA+lbal^-клетки). HNA+lbal^-клетки находились в тесном контакте с Ibal-позитивными микроглиаль-ными клетками мыши (рис. 7А-В, A’-D’) или были расположены обособленно от них (рис. 7Е-Н, Е‘-Н’).
Аналогичный результат мы получили, анализируя срезы мозга, окрашенные с АТ к маркёрам астроцитов. Мы не зарегистрировали ни OSP-, ни S-100-по-зитивных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека. Часть HNA+OSP^-клеток и HNA+S-10Ch-клеток располагалась вблизи олигодендроцитов и астроцитов мыши (рис. 8—9).
Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-EGFP-L1 САМ, после 14 сут. трансплантации мышам G93A.
В результате двойного иммунофлуоресцентного окрашивания в спинном мозге мышей были обнаружены мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, экспрессирующие маркёр эндотелиальных клеток — молекулу CD34 (рис. 10А-В, A’-D’). При этом, как и в двух предыдущих экспериментальных группах животных, в данной подопытной группе мышей среди НЫА+-клеток не выявлены клетки, экспрессирующие маркёры клеток макро- (OSP и S-100) или микроглии (ІЬа1) (рис. 11—13).
HNA Nuclei CD34 Merge
Рис. 6. 0034-позитивные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-EGFP, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A, A-L —двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA} и маркёра эндотелиальных клеток [CD34}. А, Е,1 — ядерный АГ человека [красный]; B.F.J — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); C.G.K — CD34 [зелёный].
D.H.L— объединение панелей A-С, E-G и I-К, совмещённые с фазовым контрастом, соответственно.
Обведённые области на панелях A-L [вставки A'-L', соответственно) демонстрируют НЫА'С034'-клетку [А'-Н'] и HNA CD34 -клетку [I'-L'j при большем увеличении. Измерительная линейка: А-Н, 25 мкм; А'-Н', 5 мкм, I'-L', 10 мкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
HNA Nuclei Ibal Merge
Рис. 7. Iba 1-негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-EGFP, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-Н —двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA) и маркёра клеток микроглии [Iba 1}.А,Е — ядерный антиген человека [красный]; B.F—ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); C,G — Ibal [зелёный); D — объединение панелей А-С иН — объединение панелей E-G, совмещённые с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-Н [вставки А'-Н, соответственно) демонстрируютHNA’lbaT -клетку при большем увеличении.
Измерительная линейка: А-Н, 25 мкм; А'-Н', 5 мкм
HNA Nuclei OSP Merge
Рис. 8. OSP-негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-EGFP, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-D —двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA) и маркёра олигодендроцитов [OSP). А — ядерный АГ человека [красный);
В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); С — специфический белок олигодендроцитов [зелёный).
D — объединение панелей A-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях A-D [вставки A’-D’, соответственно) демонстрируют HNA OSP -клетку при большем увеличении.
Измерительная линейка: A-D, 25 мкм; A’-D’, 5 мкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
HNA Nuclei S-IOO Merge
Рис. 9. Б-100 негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные ппазмидным вектором рВисі-\/ЕОР-ЕОРР, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши в93А. А-О — двойное иммунофпуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [НЫА] и маркёра астроцитов [3-100]. А — ядерный АГ человека [красный];
В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий]; С — 3-100 [зелёный]; О — объединение панелей А-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-О [вставки А'-О', соответственно] демонстрируют НЫА ‘3-100 -клетку, рядом с которой располагается астроцит [3-100+] мыши при большем увеличении. Измерительная линейка: А-О, 25 мкм; А'-О', 5 мкм.
HNA Nuclei CD34 Merge
Рис. 10. С034-позитивные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные ппазмидным вектором рВис1-ЕОЕР-И САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши в93А. А-О —двойное иммунофпуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [НЫА] и маркёра эндотелиальных клеток [0034]. А — ядерный АГ человека [красный]; В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий]; С — 0034 [зелёный].
О — объединение панелей А-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-О [вставки А'-О', соответственно] демонстрируют НЫА’С034’-клетку при большем увеличении.
Измерительная линейка: А-О, 25 мкм; А'-О', 5 мкм
HNA Nuclei Ibal Merge
г«- ! Ч 1 4 Г” 1 • І і * і t J -і* Fk r ІЛ í i' К Iі - '
J < ' LA, j в7 С'Л* .Af • ШщШщ
А в # с - L í 1
Рис. 11. Iba1-негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные ппазмидным вектором pBud-EGFP-L1 САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-О — двойное иммунофпуоресцентное окрашивание с АТ против ядерного АГ человека [HNA] и маркёра клеток микроглии [1Ьа1]. А — ядерный АГ человека [красный];
В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий]; С — маркёр клеток микроглии 1Ьа1 [зелёный]; О — объединение панелей А-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях А-О [вставки А'-О', соответственно] демонстрируют HNA Ibal -клетки, между которыми располагается 1Ьа1-позитивная клетка микроглии мыши при большем увеличении. Измерительная линейка: А-О, 25 мкм; А'-О', 5 мкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
HNA Nuclei OSP Merge
Рис. 12. OSP-негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные ппазмидным вектором pBud-EGFP-L1 САМ, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-D —двойное иммунофпуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA} и маркёра олигодендроцитов [OSP}. А — ядерный АГ человека [красный];
В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); С — специфический белок олигодендроцитов [зелёный].
D — объединение панелей А-С, совмещённое с фазовым контрастом. Обведённые области на панелях A-D [вставки A'-D', соответственно) демонстрируют HNA OSP -клетку, окружённую отростками олигодендроцитов мыши при большем увеличении. Измерительная линейка: A-D, 25 мкм; A'-D', 10 мкм
HNA Nuclei S-IOO Merge
Рис. 13. S-100 негативные мононуклеарные клетки, трансфицированные ппазмидным вектором pBud-EGFP-L1CAM, в сером веществе спинного мозга трансгенной мыши G93A. А-D —двойное иммунофпуоресцентное окрашивание с АТ к ядерному АГ человека [HNA] и маркёра астроцитов [S-100], А — ядерный АГ человека [красный]; В — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором [синий); С — S-100 [зелёный]; D — объединение панелей А-С. Обведённые области на панелях А-D [вставки A'-D', соответственно) демонстрируют HNA S-100 -клетку, к которой подходит отросток астроцита [S-100+} мыши при большем увеличении. Измерительная линейка: A-D, 25 мкм; A'-D', 5 мкм
Обсуждение
Ранее нами была выдвинута гипотеза, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови человека, трансфицированные плаз-мидным вектором, одновременно экспрессирующим клонированные нейронную молекулу адгезии И САМ и сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕВР, значительно усилят терапевтический эффект стволовых клеток пуповинной крови у трансгенных мышей ВЭЗА с фенотипом бокового амиотрофического склероза [16-17]. Такая генетическая модификация стволовых клеток пуповинной крови может быть полезна в трёх аспектах. Во-первых, для повышения жизнеспособности трансплантированных клеток в тканях реципиента. Во-вторых, для доставки специфических ростовых и трофических факторов в область поражённых нейронов. В-третьих, для направленной дифференцировки трансплантированных клеток в разные паренхиматозные клетки ЦНС (астроциты, макрофаги, эндотелиальные клетки). Важно заметить, что мононуклеарные клетки пуповинной крови способны проникать через гематоэнцефалический
барьер, а сигнальные молекулы, секретируемые погибающими нервными клетками, могут усиливать хоуминг мононуклеаров в ЦНС.
В наших предыдущих исследованиях мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные плазмидными векторами рсОЫА-ИУЕВР и рсОЫА-тИ САМ, после трансплантации мышам ВЭЗА были обнаружены в сосудах спинного мозга. Трансплантированные клетки экспрессировали ядерный АГ человека и маркёр эндотелиальных клеток С034. Другими словами, мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующие \ZEGF человека и нейронную молекулу адгезии И мыши, в спинном мозге мышей ВЭЗА дифференцировались в эндотелиальные клетки [15].
В настоящем исследовании для генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека были применены двухкассетные плазмид-ные векторы рВий-УЕВР-И САМ, рВис)-УЕВР-ЕВРР и рВий-ЕВРР-ИСАМ. Для идентификации и фенотипи-рования клеток было применён метод двойного им-мунофлуоресцентного окрашивания с АТ к ядерному
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
АГ человека и маркёров эндотелиальных клеток (С034), астроцитов (ЭЮО), олигодендроцитов СОБР) и клеток микроглии (1Ьа1). Через две недели после трансплантации во всех сериях эксперимента в спинном мозге мышей БЭЗА были обнаружены генетически модифицированные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека. Трансплантированные клетки экспрессировали маркёр эндотелиальных клеток — молекулу С034, но не экспрессировали маркёры клеток макро- и микроглии ЦНС. Из полученных в данном исследовании результатов следует, что диф-ференцировка мононуклеарных клеток пуповинной крови человека в эндотелиальные клетки происходит независимо от сверхэкспрессии клетками сосудистого эндотелиального фактора роста УЕВГ и нейронной молекулы адгезии ПСАМ. При этом ранее нами было установлено, что естественные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека (без генетической модификации) также способны к дифференцировке в эндотелиальные клетки, что подтверждает известный факт присутствия в пуповинной крови предшественников эндотелиальных клеток [16-17]. Таким образом, сверхэкспрессия УЕВГ и/или ПСАМ в монононукле-арных клетках пуповинной крови человека не влияет
на их дифференцировку в эндотелиальные клетки в спинном мозге мышей G93A. Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека геном нейронной молекулы адгезии L1 подтверждается повышенной жизнеспособностью трансплантированных клеток [15], а геном сосудистого эндотелиального фактора роста i/egf— поддержанием дифференцировки эндотелиальных клеток и его нейропротекторным действием на повреждённые нейроны.
Работа частично профинансирована грантами: РФФИ № 08-04-01680 и №10-04-01423, ФЦП ГК № 02.740.11.0302, Фонда содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере ГК № 7858р/10398, Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-64631.2010.7. Работа A.A. Ризванова финансировалась реинтеграционным грантом НАТО NR.RIG.983007. Работа частично выполнена на оборудовании Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) Казанского (Приволжского) федерального университета. Авторы выражают благодарность проф. Р.И. Жданову (КФУ) за помощь в подготовке экспериментов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Valentine J.S., Hart P.J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. PNAS USA 2003; 100C7): 3617—22.
2. Rosen D.R., Siddique Т., Patterson D. et al. Mutations in Cu/Zn Superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993; 362 [64151: 59—62.
3. Price D.L., Wong P.C., Borchelt D.R. et al. Amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer disease. Lessons from model systems. Rev. Neurol. 1997; 153(8-91: 484-95.
4. Gurney M.E., Pu H., Chiu A.Y. et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu.Zn superoxide dismutase mutation. Science 1994; 264(51661: 1772-5.
5. Oosthuyse B., Moons L., Storkebaum E. et al. Deletion of the hypoxia-response element in the vascular endothelial growth factor promoter causes motor neuron degeneration. Nat. Genet. 2001; 28C2]: 131-8.
6. Lambrechts D., Storkebaum E., Morimoto M. et al. VEGF is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis in mice and humans and protects motoneurons against ischemic death. Nat. Genet. 2003; 34t4]: 383-94.
7. Murakami Т., Ilieva H., Shiote M. et al. Hypoxic induction of vascular endothelial growth factor is selectively impaired in mice carrying the mutant SOD1 gene. Brain Res. 2003; 989C2): 231—7.
8. Li B., Xu W., Luo C. et al. VEGF-induced activation of the PI3-K/ Akt pathway reduces mutant SOD1-mediated motor neuron cell death. Brain Res. Mol. Brain Res. 2003; 111 [1-21: 155—64.
9. Azzouz M., Ralph G.S., Storkebaum E. et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature 2004; 429(69901: 413-7.
10. Siwko S.K., Bu W., Gutierrez C. et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia 2008; 10(7): 653—62, 1 p following 662.
11. Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Ялвач М.З. и др. Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибробластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2010; 5[23: 62—7.
12. Cheng L., Itoh К., Lemmon V. L1 -mediated branching is regulated by two ezrin-radixin-moesin [ERMl-binding sites, the RSLE region and a novel juxtamembrane ERM-binding region. J. Neurosci. 2005; 25(2): 395-403.
13. Fuss I.J., Kanof M.E., Smith P.D. et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr. Protoc. Immunol. 2009; Chapter 7:Unit 7.1.
14. Jiao Y., Sun Z., Lee T. et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J. Neurosci. Methods. 1999; 93C2]: 149—62.
15. Rizvanov A.A., Kiyasov A.P., Gaziziov I.M. et al. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and Lt1 ]CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis-a novel approach in stem cell therapy. Neurochem. Int. 2008; 53(6-8): 389—94.
16. Исламов P.P., Ризванов A.A., Гусева Д.С. и др. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2007; 2[3): 21—37.
17. Исламов P.P., Ризванов А.А., Киясов А.П. Боковой амиотрофический склероз: стратегия генно-клеточной терапии. Неврологический вестник 2008; 40(4): 91—101.
Поступила 25.09.2010
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 4, 2010
А
