CC BY
23
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.23868/202004019
нейроглия при контузионной травме спинного мозга крысы на фоне клеточно-опосредованной доставки комбинации генов VEGF165, GDNF И NCAM1 В СОЧЕтАНИИ с эпидуральной электрической стимуляцией
Ф.О. Фадеев, Ф.В. Баширов, А.А. Измайлов, М.Е. Соколов, В.А. Маркосян, Р.Р. Гарифулин, М.А. Давлеева, И.А. Пахалина, И.С. Минязева, Р.В. Шевченко, Ю.А. Челышев, Р.Р. Исламов
Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия Поступила: 07.02.2020
Принята к печати: 06.05.2020
neuroglia IN RAT spinal CORD contusion injury with Опубликована on-line: 27.06.2020
CELL-MEDIATED DELIVERY OF A COMBINATION OF vegf165, gdnf,
and ncami genes in combination with epidural electrical stimulation
F.O. Fadeev, F.V. Bashirov, A.A. Izmajlov, M.E. Sokolov, V.A. Markosyan, R.R. Garifulin, M.A. Davleeva, I.A. Pahalina, I.S. Minyazeva, R.V. Shevchenko, YU.A. CHelyshev, R.R. Islamov
Kazan State Medical University, Kazan, Russia
e-mail: gostev.andrei@mail.ru
Восстановление информационных связей в нейронных сетях, нарушенных при травме спинного мозга, во многом определяется посттравматическим ремоделированием. Известно, что информационный обмен между нейронами осуществляется путем электрической импульсации, обеспечивающей передачу возбуждения в синапсах, и предусматривает концепцию нейро-трофических взаимодействий, которая реализуются через ней-ротрофические факторы. Цель исследования: изучение влияния комбинации эпидуральной электростимуляции выше и ниже места нейротравмы с одновременной тренировкой на беговой дорожке после интратекального введения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, которые одновременно доставляли три терапевтических гена, кодирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF165), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (NCAM1), на пост-травматическую реорганизацию клеток нейроглии на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне Th8-Th9. Через 30 сут. после моделирования нейротравмы иммунофлуоресцентным методом было выявлено изменение количества клеток макро- и микроглии в каудаль-ном от эпицентра повреждения сегменте. Электростимуляция не оказывала влияния на количество GFAP+-клеток в сером веществе, но сочетанное воздействие генной и электротерапии сдерживало нарастание их количества. Были обнаружены различия в реакциях астроцитов в белом и сером веществе в ответ на электростимуляцию. В зонах серого вещества наиболее отчётливо проявлялся поддерживающий эффект комбинации генной и электротерапии на количество 0Нд2+-кпеток. В этой группе животных сдерживание нарастания количества 1Ьа1+-клеток микроглии в сером веществе может также интерпретироваться как позитивный фактор, способствующий нейрорегенерации.
Ключевые слова: травма спинного мозга, нейроглия, аденовирусный вектор, мононуклеарные клетки крови пуповины человека, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM), эпидуральная электрическая стимуляция.
Введение
Качество жизни пациентов с травмой спинного мозга (ТСМ) оценивается как крайне неудовлетворительное [1]. Для эффективной нейрореабилитации пациентов с острой или хронической ТСМ требуется комплексный подход, включающий различные фармакологические, биотехнологические и электрофизиологические методы терапии [2]. На сегодняшний день одним из эффективных способов реабилитации пациентов с ТСМ является электростимуляция, которая широко
Neural networks disturbed due to spinal cord injury are capable to restore that is largely determined by post-traumatic remodeling. It is known that information exchange between neurons is carried out by electrical impulse, which ensures the transmission of excitation in synapses, that is realized through neurotrophic factors according to the concept of neurotrophic interactions. Objective: to study the effect of a combination of epidural electrostimulation above and below the site of neurotrauma during training on the treadmill and intrathecal administration of human umbilical cord blood mononuclear cells, which simultaneously delivered three therapeutic genes encoding vascular endothelial growth factor (VEGF165), glial neurotrophic factor (GDNF) and neuronal cell adhesion molecule (NCAM1), to post-traumatic reorganization of neu-roglia cells in a model of dosed concussion injury of rat spinal cord at the Th8-Th9 level. 30 days after the simulation of neurotrauma by the immunofluorescence method, a change in the number of macro- and microglia cells in the segment caudal from the damage epicenter was revealed. Electrostimulation did not affect the number of GFAP+-cells in the gray matter, but the combined effect of gene and electrotherapy restrained the increase in their number. Differences were found in the reactions of astrocytes in white and gray matter in response to electrical stimulation. In the zones of gray matter, the supporting effect of the combination of gene and electrotherapy on the number of Olig2+-cells was most clearly manifested. In this group of animals, the inhibition of the increase in the number of Iba1+-microglia cells in the gray matter can also be interpreted as a positive factor contributing to neuroregeneration.
Keywords: spinal cord injury, neuroglia, adenoviral vector, human umbilical cord blood mononuclear cells, vascular endothelial growth factor (VEGF), glial-derived neurotrophic factor (GDNF), neuronal cell adhesion molecule (NCAM), epidural electrical stimulation.
используется при лечении травм периферического нерва и нервно-мышечных заболеваний. При ТСМ в эксперименте и клинических исследованиях активно разрабатывается метод эпидуральной электрической стимуляции для активирования спинальных генераторов шагания [3]. Даже при полной ТСМ на уровне грудных сегментов (ТИ7—ТИ9) электростимуляция ниже уровня травмы активирует двустороннюю ритмическую двигательную активность задних конечностей у животных [4, 5]. Возможность вызывать шагательные движения при
электростимуляции пояснично-кресцовых сегментов также показана у пациентов при полном повреждении спинного мозга [6]. Таким образом, электростимуляция, активируя спинальный генератор шагания, имеет большой клинический потенциал для ускорения нейрореаби-литации пациентов с ТСМ.
Другим перспективным подходом морфо-функцио-нального восстановления травмированного спинного мозга является генная терапия [7]. Терапевтические гены, кодирующие молекулы, которые поддерживают выживание нейронов, стимулируют рост аксонов, восстановление и ремоделирование нарушенных межнейронных связей, являются потенциальными терапевтическими средствами для индукции нейрореге-нерации. Применительно к ТСМ, наибольшее внимание привлекают и активно изучаются гены, кодирующие нейротрофические факторы, молекулы адгезии, противо-апоптозные молекулы и ангиогенные факторы. Однако в большинстве исследований в этом направлении при экспериментальной ТСМ в область повреждения доставляли один, реже два целевых гена [8, 9]. Одновременная доставка трех генов, которые кодируют синтез молекул, потенциально действующих на различные терапевтические мишени при ТСМ, ранее не была осуществлена. В связи с этим, нами была разработана технология одновременной доставки трех генов: сосудистого эндоте-лиального фактора роста (VEGF165), глиального нейро-трофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1 ) при помощи мононуклеар-ных клеток крови пуповины (МККП) человека [10-12].
Положительный эффект при такой клеточно-опос-редованной генной терапии может быть обусловлен как действием эндогенных биологически активных молекул, так и рекомбинантных молекул (VEGF, GDNF и NCAM), секретируемых МККП. В экспериментах in vitro установлено, что МККП способны продуцировть ангио-генные и нейротрофические факторы, в том числе VEGF и GDNF [13]. Таким образом, увеличение синтеза в МККП молекул VEGF и GDNF может с большей эффективностью стимулировать процессы нейрорегенерации. VEGF и GDNF являются нейропротекторами с хорошо изученными механизмами противоапоптозного действия [14]. Кроме того, VEGF играет важную роль в восстановлении микроциркуляции в зоне нейродегенерации [15], а GDNF модулирует функцию клеток микроглии [16]. Синтез ней-рональной молекулы клеточной адгезии (NCAM) в лейкоцитах может усилить миграцию и хоуминг генетически модифицированных клеток в нервную ткань реципиента, что обеспечит адресную доставку терапевтических генов в область травматического повреждения мозга [17].
Цель исследования — установить влияние одновременной интратекальной доставки генов VEGF, GDNF и NCAM с помощью МККП при ТСМ у крыс в сочетании с электростимуляцией выше и ниже нейротравмы с одновременной тренировкой на беговой дорожке на ремоде-лирование спинного мозга на основе иммунофлуорес-центного анализа клеток макро- и микроглии.
Материал и методы
Получение генетически
модифицированных МККП человека
Аденовирусные векторы, несущие терапевтические гены VEGF, GDNF и NCAM, были наработаны на основе аденовируса человека серотипа 5 (Ad5) в Национальном исследовательском центре эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи
Министерства здравоохранения Российской Федерации [18]. Генно-клеточные конструкции были получены на основе МККП человека и аденовирусных векторов, содержащих гены человека (Ad5-VEGF, Ad5GDNF, Ad5-NCAM), по методике, описанной нами ранее [19]. Пуповинная кровь была предоставлена Банком стволовых клеток Казанского государственного медицинского университета. Из свежей пуповинной крови МККП выделяли в градиенте плотности фиколла (ПанЭко, Россия). Сразу после выделения клетки одновременно трансдуцировали тремя аденовирусными векторами в равном соотношении Ad5-VEGF (1/3), Ad5-GDNF (1/3), Ad5-NCAM (1/3), где показатель MOI (multiplicity of infection — множественность инфицирования) был равен 10. Через 12 ч. инкубирования генетически модифицированные клетки (МККП+Adb-VEGF-GDNF-NCAM) концентрировали в стерильном физиологическом растворе из расчета 2х106 клеток в 20 мкл. Уровень синтеза мРНК VEGF, GDNF и NCAM в генетически модифицированных МККП был подтвержден методом ПЦР в режиме реального времени [18].
Эксперимент in vivo
Эксперимент проводили на взрослых самках крыс линии Вистар (Пущино, Россия) массой 250-300 г (n=21). Крыс содержали по одной в клетке в стандартных лабораторных условиях с неограниченным доступом к воде и пище и 12 ч. режимом день-ночь. Все манипуляции выполняли в соответствии с приказом Минздравсоцразвития № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и с разрешения Локального этического комитета Казанского государственного медицинского университета (протокол № 2 от 20.02.2018). Хирургические вмешательства проводили в стерильных условиях под наркозом, который поддерживали путём внутрибрюшинного введения растворов Золетила 100 (Virbac Sante Animale, Франция) в концентрации 3 мг/кг и Ксила (Interchemie werken De Adelaar B.V, Нидерланды) в концентрации 4,8 мг/кг. Оперативные вмешательства проводили в следующей последовательности: 1 — имплантация электродов; 2 — контузионная травма спинного мозга, 3 — ксенотрансплантация крысам генетически модифицированных МККП человека; 4 — эпидуральная электростимуляция спинного мозга.
1. Имплантация электродов для электростимуляции спинного мозга. Этот этап включал установку на черепе крысы 12-канального имплантата (Omnetics Connector Corporation, США) и подшивание к твердой мозговой оболочке спинного мозга электродов (AS632, Cooner Wire Company, США). Для установки головного имплан-тата на дорсальной поверхности черепа выполняли трепанацию в 4 местах и вставляли винты для фиксации головного имплантата между ними: на сухую кость между винтами и вокруг них наносили слой фиксационного композита (Ketac Cem Easymix, США), головной имплантат устанавливали между вкрученными винтами и заливали композитом до середины его высоты. Стимулирующие электроды фиксировали на твердой мозговой оболочке синтетическим шовным материалом (9/0) на уровне позвонков С5 и L2 после ламинэктомии. Референсный электрод имплантировали подкожно в поясничной области. Электроды соединяли с головным имплантатом, который подключали к электрофизиологическому оборудованию для электростимуляции [5].
2. Травму спинного мозга моделировали через неделю после имплантации электродов по методике, описанной ранее [10]. Открытый участок спинного мозга
Рис. 1. Топографическая карта зон спинного мозга для гистологического исследования: А — сегменты спинного мозга, соответствующие эпицентру травмы и сегменты каудального от эпицентра травмы участка, процессированные для гистологического исследования; Б — зоны спинного мозга, выбранные для иммунофлуоресцентного анализа: передние рога (cornus anterior, CA) — VIII, IX пластины Рекседа; задние рога (cornus posterior, CP) — I—IV пластины Рекседа; область центрального канала (canalis centralis, CC) — X пластина Рекседа; задний кортикоспинальный тракт (tractus corticospinal, TC); вентральный канатик (funiculus anterior, FA)
таблица 1. Экспериментальные группы животных
Группа
Интратекальная инъекция
Контрольная (TCM, n=6)
ЭC (TCM + эпидуральная электростимуляция, n=4)
TT^C (TCM + генная терапия + эпидуральная электростимуляция,n=5)
Интактные животные (n=6)
2G мкл физиологического раствора
2G мкл физиологического раствора
2x1G6 МККП+Adö-VEGF-GDNF-NCAM в 2G мкл физиологического раствора
для нанесения травмы создавали путем удаления дужек (ламинэктомия) позвонков на уровне Th8-Th9. Умеренную контузию спинного мозга вызывали с помощью металлического стержня (вес 10 г, диаметр 2 мм), падающего с высоты 25 мм. Для нанесения однократного удара по спинному мозгу животное было зафиксировано в цоп-тимальной позе с вытянутым прямым позвоночником.
3. Ксенотрансплантацию генетически модифицированных МККП выполняли через 4 ч. после моделирования ТСМ. Животным после ламинэктомии на уровне L4-L5 позвонков интратекально вводили 2х106 MKKn+Ad5-VEGF-GDNF-NCAM в 20 мкл физиологического раствора (группа ГТ-ЭС, n=5) или 20 мкл физиологического раствора (контрольная группа, n=6; группа ЭС, n=4) (табл. 1).
4. Эпидуральная электрическая стимуляция. Через 3 сут. после моделирования ТСМ животным из ЭС и ГТ-ЭС экспериментальных групп начинали проводить процедуру электростимуляции однонаправленным током с частотой 40 Гц, интенсивностью 1,3-2,0 В и длительностью импульса 0,2 мс c помощью электростимулятора Digitimer DS5 (Digitimer Ltd., Великобритания). Параметры стимуляции задавали с помощью программного обеспечения LabChart (AD Instruments Inc., США). Процедуру выполняли одновременно на уровне позвонков C5 (для активации нейрорегенерации) и L2 (для активации генераторов шагания) по 30 мин. утром и вечером через день в течение 4 недель после моделирования ТСМ. В ходе электростимуляции крыс помещали на беговую дорожку (IITC Life Science Inc., США) с фиксированной скоростью движения ленты (10 см/сек). При этом тело подопытных животных было зафиксировано с помощью бандажной повязки под углом 45° так, чтобы только задние конечности соприкасались с поверхностью для выполнения шагообразных движений [18]. Паттерны стимуляции и тренировки на беговой дорожке были постоянными на протяжении всего эксперимента.
Иммунофлуоресцентный анализ
Через 3G сут. после моделирования TCM животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения 3 мг/кг Золетила 1GG (Virbac Sante Animale, Франция) и 4,B мг/кг Ксила (Interchemie werken De Adelaar B.V., Нидерланды) и далее внутрисердечно перфузировали 4% параформальдегидом (Sigma, CÍIA) на фосфатно-соле-вом буфере (pH=7,4). Участок спинного мозга в области травмы забирали вместе с позвонками и помещали в 4% параформальдегид. Для оценки изменений нейроглиальных маркеров в спинном мозге был выбран каудальный от эпицентра травмы участок (рис. 1). В целях криопротекции ткань насыщали 3G% раствором сахарозы на фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) и изготовливали свободноплавающие поперечные срезы (2G мкм) на криостате Microm HM 56G (Thermo Scientific, CIIA). Реакцию астроцитов оценивали с помощью антител к GFAP, олигодендроглиальных клеток — к Olig2 и микроглии — к Iba1 (табл. 2) в передних рогах (anterior horn, AH), задних рогах (dorsal horn, DH), в области центрального канала (canalis centralis, CC), заднем кортикоспинальном тракте (tractus corticospinalis, TC) и вентральных канатиках (funiculus ventralis, VF) (рис. 1). Цифровые изображения структур спинного мозга получали на микроскопе LSM 51G-Meta (Carl Zeiss; Oberkochen, Германия). Количество иммунопозитивных клеток (GFAP+, Olig2+ и Iba1+) подсчитывали на объединенных изображениях, полученных с 1G последовательных оптических срезов (разрешение 512x512 пикселей, исследуемая площадь G,G5 мм2), учитывая ко-локализацию иммунопозитивных структур и клеточных ядер, выявляемых при помощи DAPI (1G мкг/мл, Sigma, CIA).
Статистический анализ
Все этапы обработки и анализа данных выполняли в среде для статистических вычислений R 3.4.4 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Aвстрия).
таблица 2. Первичные и вторичные антитела
Антитела Хозяин
GFAP Mouse
Iba1 Rabbit
0lig2 Rabbit
Anti-mouse IgG conjugated with Alexa 488 Donkey
Anti-rabbit IgG conjugated with Alexa 647 Donkey
Описательные статистики представлены в виде медианы (минимум, максимум). Для визуализации выборочных распределений использовали диаграммы размаха в сочетании с одномерными диаграммами рассеивания для представления отдельных наблюдений. Для анализа данных иммунофлуоресцентного исследования применяли тест Краскела-Уоллиса, в случае отклонения нулевой гипотезы (р<0,05) были проведены попарные сравнения с помощью теста Данна, различия считали статистически значимыми при р<0,05. Все опыты с животными, морфометрический и статистический анализы проводили «слепым» способом по отношению к экспериментальным группам.
Результаты и обсуждение
Нейроглия поддерживает гомеостаз и участвует в защитных реакциях, препятствуя развитию патологических сдвигов. Анализ количества ЭРАР+ (астроцитов), ОНд2+ (олигодендроцитов) и 1Ьа1+-клеток (микроглия) выявил различную реакцию клеток нейроглии в сером и белом веществе спинного мозга экспериментальных крыс через 30 сут. после моделирования ТСМ: в задних рогах (СР) у крыс контрольной и ЭС групп, при сравнении с интактными животными, увеличивалось количество ЭРАР+-клеток (рис. 2); в группе животных ГТ-ЭС в этой зоне количество астроцитов не увеличивалось и не отличалось от интактной группы. Аналогичная картина была отмечена в другой зоне серого вещества — в области центрального канала (СС). В передних рогах (СА) в группе ГТ-ЭС количество ЭРАР+-клеток было меньше, чем в контрольной и ЭС группах, но эти различия в зоне СА были менее выраженными, чем в зонах СС и СР. Полученные результаты дают основание полагать, что электростимуляция не оказывала влияния на количество ЭРАР+-клеток в сером веществе, но совместное воздействие генной и электротерапии сдерживало нарастание их количества.
Количество ЭРАР+-клеток в белом веществе, а именно в вентральном канатике (РА) и заднем кортикоспиналь-ном тракте (ТС), в группе ЭС было значительно меньше, чем в контрольной группе, что указывает на различия в реакциях астроцитов в белом и сером веществе в ответ на электростимуляцию. В белом веществе наименее выраженные сдвиги в количестве ЭРАР+-клеток, которые практически не отличались от данного показателя у интактных животных, были отмечены в группе ГТ-ЭС. Таким образом, посттравматическое увеличение количества ЭРАР+-клеток, участвующих в формировании глиального рубца и вырабатывающих молекулы-ингибиторы роста аксонов, наиболее активно сдерживается при использовании комбинации генной терапии и электростимуляции, что отчётливо прослежено в зонах серого вещества. Однако, следует отметить, что изменения количества астроцитов в области повреждения и в прилегающей к ней области не интерпретируется однозначно [20]. На ранних сроках после нанесения травмы активно экспрессирующие ЭРАР и стремительно пролиферирующие реактивные
Разведение Производитель
1:200 Santa Cruz, США
1:150 Abcam, Великобритания
1:100 Abcam, Великобритания 1:200 Invitrogen, США 1:200 Invitrogen, США
астроциты формируют глиальный барьер, отделяющий очаг повреждения от неповрежденной ткани. На поздних сроках, после формирования разграничительного барьера, по-видимому, следует учитывать негативную роль реактивной астроглии, связанную с продукцией про-тегликанов, и в первую очередь лектиканов, ингибирующих рост аксонов [21]. Кроме того, рассматривая последствия астроглиоза, целесообразно иметь в виду гетерогенность популяции астроцитов, которая возникает в условиях патологии, и в мозге появляются реактивные астроциты разных типов [22]. Астроциты типа А1 оказывают негативное влияние на процессы нейрорегенерации, а астро-циты типа А2, наоборот, продуцируют нейротрофические факторы, синаптогенные молекулы и другие стимуляторы восстановления нервных связей [20, 23]. В целом остается неясным распределение клеток астроглии разных фенотипов в области травматического повреждения спинного мозга как по срокам развития патологического процесса, так и топографически, т. е. на разном удалении от эпицентра повреждения. В нашем случае при анализе материала через 30 сут. после нанесения травмы представляется целесообразным учитывать известную способность реактивных астроцитов продуцировать молекулы внеклеточного матрикса и в первую очередь хондроитинсульфат протеогликаны, обладающие выраженным ингибирующим влиянием на протяженный рост аксонов, поэтому уменьшение количества ЭРАР+-клеток во всех исследованных зонах серого вещества и в вентральном канатике (РА) в условиях сочетания генной терапии и электростимуляции мы склонны рассматривать в контексте стимулирования нейрорегенерации.
Посттравматическая воспалительная реакция в спинном мозге сопровождается гибелью олигодендро-цитов и последующей демиелинизацией, приводящей к выраженному нарушению функции [24]. К 30 сут. количество ОПд2+-клеток существенно уменьшалось (приблизительно в одинаковой степени), как в сером, так и в белом веществе во всех подопытных группах (рис. 3). Поддерживающее влияние комбинации генной и электротерапии на количество ОПд2+-клеток наиболее отчётливо проявлялось в зонах серого вещества (СА и СР). В белом веществе (РА и ТС) у животных в группе ГТ-ЭС позитивное поддерживающее влияние на количество олигодендроцитов выявлено не было. Практически во всех исследованных зонах спинного мозга электростимуляция не оказывала влияния на количество ОПд2+-клеток. Однако следует отметить, что транскрипционный фактор ОПд2+ экспрессируют не только дифференцированные олигодендроциты, но и N62 клетки, которые рассматриваются в качестве предшественников ОПд2+-клеток, а также ЭРАР+-астроцитов особой популяции [25]. Следовательно, комбинированная терапия может влиять не только на сохранность олигодендроцитов, но и на образование новых олигодедрогилиальных клеток после нейротравмы, что будет способствовать ремиелинизации аксонов в процессе нейрорегенерации.
Интактные животные
Физиологический раствор
о
- • -V о ,
4 5о_мт
I-
о
Т
С О :а£
I
I
ф-Интактные животные И - Физиологический раствор
ф-эс
Е^Э - ГТ-ЭС
-Максимум -Верхний квартиль
-Нижний квартиль " Минимум
Рис. 2. Астроциты в каудальном от эпицентра повреждения сегменте спинного мозга через 30 сут. после нанесения травмы: верхняя панель — иммунофлуоресцентная реакция с антителами к ЭРАР (зеленый), ядра клеток докрашены йАР! (синий); нижняя панель — сравнение количества ЭРАР+-клеток в разных группах, подсчитанных в зонах СА, СР, СС, РА, ТС. Масштабный отрезок — 50 мт. *различия между экспериментальными группами, р<0,05
Рис. 3. Олигодендроциты в каудальном от эпицентра повреждения сегменте спинного мозга через 30 сут. после нанесения травмы: верхняя панель — иммунофлуоресцентная реакция с антителами к 0Нд2 (красный), ядра клеток докрашены ОДР! (синий); нижняя панель — сравнение количества 0Нд2+-клеток в разных группах, подсчитанных в указанных зонах. Масштабный отрезок — 50 мт. *различия между экспериментальными группами, р<0,05
Рис. 4. Микроглия в каудальном от эпицентра повреждения сегменте спинного мозга через 30 сут. после нанесения травмы: верхняя панель — иммунофлуоресцентная реакция с антителами к !Ьа1 (зеленый), ядра клеток докрашены ОДР! (синий); нижняя панель — сравнение количества !Ьа1+-клеток в разных группах, подсчитанных в указанных зонах. Масштабный отрезок — 50 мт. *различия между экспериментальными группами, р<0,05
Реактивная микроглия, как и астроциты, представлена двумя популяциями клеток — М1 и М2 с эффектами противоположной направленности. Провоспалительные М1 клетки продуцируют ТЫР-а, индуцибильную син-тазу оксида азота (И\108) и интерлейкины !1_-1р, 11_-18, которые оказывают токсическое влияние на нейроны. Клетки микроглии противовоспалительного типа М2 секретируют нейротрофические факторы (ВОЫР, МЭР), способствующие нейрорегененерации [26]. В нашем исследовании количество клеток микроглии,
выявляемых при помощи маркера !Ьа1, в сером веществе в зонах СС и СР в условиях комбинированной терапии было статистически значимо меньше, чем в контрольной и ЭС группах и не отличалось от показателей интактной группы (рис. 4). В сером веществе в зоне СА этот эффект обнаружен не был. В белом веществе в зонах РА и ТС у животных из группы ГТ-ЭС количество !Ьа1+-клеток также не отличалось от этого показателя у животных интактной группы. Электростимуляция препятствовала повышению числа микроглиальных
клеток только в одной из трёх исследованных зон серого вещества, в СА, и не оказывала существенного влияния на данный показатель в белом веществе. Полученные результаты свидетельствует о том, что генная терапия в комбинации с электростимуляцией сдерживает увеличение количества 1Ьа1+-клеток в сером и белом веществе спинного мозга ниже эпицентра травмы. Анализ данных об изменении числа астроцитов и клеток микроглии в спинном мозге животных в группе ГТ-ЭС позволяет предположить о сдерживающем эффекте сочетанной терапии на формирование глиального рубца.
Таким образом, в представленной работе впервые было продемонстрировано положительное влияние комбинированной электро- и генной терапии на опосредованное глиальными клетками улучшение
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Potter K., Saifuddin A. Pictorial review: MRI of chronic spinal cord injury. Br. J. Radiol. 2003; 76(905): 347-52.
2. Hamid S., Hayek R. Role of electrical stimulation for rehabilitation and regeneration after spinal cord injury: an overview. Eur. Spine J. 2008; 17(9): 1256-69.
3. Capogrosso M., Wagner F., Gandar J. et al. Configuration of electrical spinal cord stimulation through real-time processing of gait kinematics. Nat. Protoc. 2018; 13(9): 2031-61.
4. Gerasimenko Y.P., Avelev V.D., Nikitin O.A. et al. Initiation of locomotor activity in spinal cats by epidural stimulation of the spinal cord. Neurosci. Behav. Physiol. 2003; 33(3): 247-54.
5. Lavrov I., Dy C., Fong A. et al. Epidural stimulation induced modulation of spinal locomotor networks in adult spinal rats. J. Neurosci. 2008; 28(23): 6022-9.
6. Gill M.L., Grahn P.J., Calvert J.S. et al. Neuromodulation of lumbosacral spinal networks enables independent stepping after complete paraplegia. Nature Medicine 2018; 24(11): 1677-82.
7. Lim S.T., Airavaara M., Harvey B.K. Viral vectors for neurotrophic factor delivery: a gene therapy approach for neurodegenerative diseases of the CNS. Pharmacol. Res. 2010; 61(1): 14-26.
8. Walthers C.M., Seidlits S.K. Gene delivery strategies to promote spinal cord repair. Biomark. Insights 2015; Suppl 1: 11-29.
9. Hodgetts S.I., Harvey A.R. Neurotrophic Factors Used to Treat Spinal Cord Injury. Vitam. Horm. 2017; 104: 405-57.
10. Izmailov A.A., Povysheva T.V., Bashirov F.V. et al. Spinal Cord Molecular and Cellular Changes Induced by Adenoviral Vector- and Cell-Mediated Triple Gene Therapy after Severe Contusion. Front. Pharmacol. 2017; 8: 813.
11. Измайлов А.А., Соколов М.Е., Баширов Ф.В. и др. Сравнительный анализ эффективности прямой и клеточно-опосредованной генной терапии крыс с контузионной травмой спинного мозга. Гены и Клетки 2018; XII(4): 53-9.[Izmailov A.A., Sokolov M.E., Bashirov F.V. et al. Comparative analysis of the effectiveness of direct and cell-mediated gene therapy in rats with spinal cord contusion injury. Genes and Сells 2018; XII(4): 53-9].
12. Islamov R.R., Izmailov A.A., Sokolov M.E. et al. Evaluation of direct and cell-mediated triple-gene therapy in spinal cord injury in rats. Brain Res. Bull. 2017; 132(2): 44-52.
13. Chen N., Newcomb J., Garbuzova-Davis S. et al. Human Umbilical Cord Blood Cells Have Trophic Effects on Young and Aging Hippocampal Neurons in Vitro. Aging Dis. 2010; 1(3): 173-90.
14. Greenberg D.A., Jin K. From angiogenesis to neuropathology. Nature 2005; 438(7070): 954-9.
ремоделирования спинного мозга после контузионной травмы, которое выражалось в уменьшении количества астроцитов и микроглиальных клеток, а также в увеличении количества клеток олигодендроглии. Эти данные согласуются с результатами наших предыдущих исследований, в которых было показано улучшение локомоторной активности у крыс с травмой спинного мозга на фоне генной терапии [10, 11].
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 16-15-00010. Авторы выражают благодарность И.И. Салафутдинову и ТВ. Повышевой за помощь в экспериментах.
15. Shweiki D., Itin A., Soffer D. et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 1992; 359(6398): 843-5.
16. Rocha S.M., Cristovao A.C., Campos F.L. et al. Astrocyte-derived GDNF is a potent inhibitor of microglial activation. Neurobiol. Dis. 2012; 47(3): 407-15.
17. Сафиуллов З.З., Гаранина Е.Е., Измайлов А.А. и др. Адресная миграция и выживание генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека после трансплантации G93A мышам с моделью бокового амиотрофического склероза. Гены и Клетки 2015; X(4): 1-4. [Safiullin Z.Z., Garanina E.E., Izmailov A.A. et al. Targeted migration and survival of genetically modified human umbilical cord blood mononuclear cells after G93A transplantation to mice with a model of amyotrophic lateral sclerosis. Genes and Сells 2015; X(4): 1-4].
18. Islamov R.R., Rizvanov A.A., Mukhamedyarov M.A. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neural cell adhesion molecule. Curr. Gene Ther. 2015; 15(3): 266-76.
19. Islamov R.R., Rizvanov A.A., Fedotova V.Y. et al. Tandem Delivery of Multiple Therapeutic Genes Using Umbilical Cord Blood Cells Improves Symptomatic Outcomes in ALS. Mol. Neurobiol. 2017; 54(6): 4756-63.
20. Anderson M.A., Burda J.E., Ren Y. et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature 2016; 532(7598): 195-200.
21. Ohtake Y., Li S. Molecular mechanisms of scar-sourced axon growth inhibitors. Brain Research 2015; 1619: 22-35.
22. Anderson M.A., Ao Y., Sofroniew M.V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience Letters 2014; 565: 23-9.
23. Liddelow S.A., Guttenplan K.A., Clarke L.E. et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature 2017; 541(7638): 481-7.
24. Assinck P., Duncan G.J., Plemel J.R. et al. Myelinogenic plasticity of oligodendrocyte precursor cells following spinal cord contusion injury. J. Neurosci. 2017; 37(36): 8635-54.
25. Lee J.C., Mayer-Proschel M., Rao M.S. Gliogenesis in the central nervous system. GLIA 2000; 30(2): 105-21.
26. Taylor R.A., Sansing L.H. Microglial responses after ischemic stroke and intracerebral hemorrhage. Clinical and Developmental Immunology 2013; 2013: 746068.
