CC BY
30
DOI: 10.23868/202011014
ВЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНО-ОПОСРЕДОВАННОЙ ДОСТАВКИ КОМБИНАЦИИ ГЕНОВ VEGF165, GDNF И NCAM1 НА МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ РЕАКЦИИ В СПИННОМ МОЗГЕ СВИНЕЙ С КОНТУЗИОННОЙ ТРАВМОЙ
М.А. Давлеева, Ф.В. Баширов, А.А. Измайлов, Ф.О. Фадеев, М.Е. Соколов, В.А. Маркосян, Р.Р. Гарифулин, М.С. Кузнецов, И.А. Пахалина, И.С. Минязева, Ю.А. Челышев, Р.Р. Исламов
Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Поступила: 20.052020 Принята к печати: 26.112020 Опубликована on-line: 27.112020
THE EFFECT OF CELL-MEDIATED DELIVERY OF COMBINATION VEGF165, GDNF, AND NCAM1 GENES ON MOLECULAR AND CELLULAR REACTIONS IN THE SPINAL CORD OF PIGS WITH CONTUSION TRAUMA
M.A. Davleeva, F.V. Bashirov, A.A. Izmailov, F.O. Fadeev, M.E. Sokolov, V.A. Markosyan, R.R. Garifulin, M.S. Kuznetsov, I.A. Pakhalina, I.S. Minyazeva, Yu.A. Chelyshev, R.R. Islamov
Kazan state medical university, Kazan, Russia
e-mail: gostev.andrei@mail.ru
В настоящее время способы лечения травмы спинного мозга ограничены. Одним из наиболее перспективных подходов, направленных на преодоление негативных посттравматических последствий в спинном мозге, является генная терапия. Многочисленные исследования, выполненные на грызунах, свидетельствуют о положительном влиянии доставки терапевтических генов в спинной мозг для стимулирования нейрорегенерации. Однако для выведения разработанных протоколов генной терапии на стадию клинических испытаний необходимо верифицировать полученные результаты в экспериментах на крупных лабораторных животных. Цель исследования: иммунофлуоресцентный анализ реакции маркеров клеточного стресса и апоптоза, синаптических белков и нейроглии при посттравматическом ремоделировании спинного мозга свиней породы вьетнамская вислобрюхая после интратекальной доставки генов, кодирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕвР165), глиальный нейротрофический фактор (8П1\Р) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (1\1САМ1), с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека (МККП). У опытных свиней (п=2) через 4 часа после моделирования дозированной кон-тузионной травмы спинного мозга на уровне ТИ8-ТИ9 интра-текально вводили 2х106 генетически модифицированные МККП, сверхэкспрессирующие рекомбинантные молекулы УЕвР, 8П1\Р и \ICAM в 200 мкл физиологического раствора. Контрольным животным (п=2) в цереброспинальную жидкость вводили 200 мкл физиологического раствора. Интактные свиньи (п=2) были использованы в работе для получения базовых значений для иммунофлуоресцентно-го анализа посттравматических молекулярных и клеточных реакций. Через 60 суток иммунофлуоресцентный анализ в ростральном и каудальном отделах спинного мозга относительно эпицентра травмы выявил положительные изменения у опытных свиней на фоне клеточно-опосредованной доставки генов VEGF165, GDNF и NCAM1. В передних рогах рострального и каудального отделов спинного мозга животных из терапевтической группы были обнаружены более высокий уровень флуоресценции синаптического белка синаптофизи-на, меньшее число астроцитов и клеток микроглии, что может свидетельствовать о функциональном восстановлении нейронов и сдерживании развития астроглиоза. В ростральном отделе в области кортикоспинального тракта генная терапия поддерживала численность олигодендроцитов, обеспечивающих миелинизации регенерирующих аксонов. Полученные результаты дают основание полагать, что генетически модифицированные МККП, сверхэкспрессирующие рекомбинантные молекулы УЕвР и вПЫР (в качестве терапевтических молекул) и \ICAM (в качестве молекулы, обеспечивающей выживание и адресное наведение клеточных носителей), способствуют посттравматической регенерации спинного мозга.
Ключевые слова: вьетнамские вислобрюхие свиньи, травма спинного мозга, сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕвР), глиальный нейротрофический фактор (вПЫР), нейро-нальная молекула клеточной адгезии (\ICAM), аденовирусный вектор, мононуклеарные клетки крови пуповины человека.
Currently, the treatments for spinal cord injury are limited. Gene therapy is one of the most promising approaches aimed at overcoming negative post-traumatic consequences in the spinal cord. Numerous studies performed in rodents indicate a positive effect of the delivery of therapeutic genes to the spinal cord to stimulate neuroregeneration. However, to bring the developed protocols of gene therapy to the stage of clinical trials, it is necessary to verify the results obtained in experiments on large laboratory animals. Objective: Immunofluorescence analysis of the response of markers of cell stress and apoptosis, synaptic proteins and neuroglia in the spinal cord of female vietnamese pot-bellied pigs after intrathecal delivery of genes encoding vascular endothelial growth factor (VEGF165), glial-derived neurotrophic factor and neuronal cell adhesion molecule (NCAM1), using human umbilical cord blood mononuclear cells (UCBMC). In experimental pigs (n = 2), 4 hours after modeling a dosed contusion injury of the spinal cord at the Th8-Th9 level, 2x106 genetically modified UCBMCs overexpressing recombinant VEGF, GDNF, and NCAM molecules in 200 |jl of saline were intrathecally injected. Control animals (n = 2) were injected with 200 jl of saline into the cerebrospinal fluid. Intact pigs (n = 2) were used to obtain baseline values for immunofluorescence analysis of post-traumatic molecular and cellular responses. After 60 days, immunofluorescence analysis in the rostral and caudal parts of the spinal cord relative to the epicenter of injury revealed positive changes in experimental pigs against the background of cell-mediated delivery of the VEGF165, GDNF, and NCAM1 genes. In the anterior horns of the rostral and caudal spinal cord of animals from the therapeutic group, a higher level of fluorescence of the synaptic protein synap-tophysin, a lower number of astrocytes and microglial cells were found, which may indicate functional recovery of neurons and suppression of the development of astrogliosis. In the rostral section, in the area of the corticospinal tract, gene therapy maintained the number of oligodendrocytes, which ensure myelination of regenerating axons. The results obtained suggest that genetically modified UCBMCs, overexpressing recombinant molecules VEGF and GDNF (as therapeutic molecules) and NCAM (as a molecule providing survival and targeted targeting of cell carriers), contribute to post-traumatic regeneration of the spinal cord.
Keywords: vietnamese pot-bellied pig, spinal cord injury, vascular endothelial growth factor (VEGF), glial-derived neurotrophic factor (GDNF), neuronal cell adhesion molecule (NCAM), adenoviral vector, human umbilical cord blood mononuclear cells.
Введение
Травма спинного мозга представляет собой комплексный процесс, включающий посттравматическую гибель клеток, ишемические и воспалительные повреждения, реактивный астроглиоз, разрывы и демиелини-зацию нервных проводников, нарушение межнейронных связей [1]. В этой связи для преодоления негативных последствий нейротравмы рассматриваются два основных подхода: нейропротекция (сдерживание гибели нейронов) и стимулирование нейрорегенерации (ремо-делирование нейроглии, поддержание роста аксонов и восстановление утраченных контактов в нейронных сетях) [2-4]. Несмотря на проведенные многочисленные эксперименты на животных к настоящему времени в практической медицине не существует эффективного терапевтического протокола лечения травмы спинного мозга [4, 5]. При этом положительные результаты, полученные в экспериментах на мелких животных (грызунах), отличающихся небольшими размерами, высоким уровнем метаболизма и регенераторной способностью, не могут быть прямо транслированы на пациента [6, 7]. Поэтому для внедрения новых современных методов лечения пациентов с травмой спинного мозга требуются доклинические испытания в моделях на крупных животных [8]. Среди известных модельных организмов, свиньи считаются наиболее оптимальными животными для доклинических испытаний [9]. Для экспериментальной неврологии анатомические особенности нервной ткани свиньи имеют ряд преимуществ. так, длина нервных отростков у человека сопоставима с длиной нейритов у свиней и многократно превышает их длину у грызунов, например, достигая более метра в длину в составе седалищного нерва.
В настоящее время одной из перспективных стратегий, направленных на стимулирование посттравматической регенерации спинного мозга, является генная терапия [10]. При этом ведутся активные разработки как прямой, так и клеточно-опосредованной доставки в спинной мозг терапевтических генов. Научный поиск ведется с использованием множества генов, кодирующих молекулы-стимуляторы нейрорегенерации, и клеточных носителей для их доставки в спинной мозг [11].
список генов, кодирующих синтез потенциальных молекул-стимуляторов нейрорегенерации, достаточно велик [12]. Нами разработан способ одновременной доставки трех терапевтических генов, кодирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБЭР), глиальный нейротрофический фактор (0Ю1\Р) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (1\1САМ) с помощью монону-клеарных клеток крови пуповины (МККП) человека [1316]. Положительный эффект ксенотрансплантации генетически модифицированных МККП, одновременно сверхэкспрессирующих рекомбинантные УБЭР, 0Ю1\Р и \ICAM, показан у трансгенных Э93А мышей с моделью бокового амиотрофического склероза [17] и у крыс моделью контузионной травмы спинного мозга [1 8, 1 9]. Важно отметить, что трансплантированные МККП адресно мигрировали в область нейродегенерации, сохраняли жизнеспособность и продуцировали реком-бинантные молекулы. Целесообразность использования МККП в качестве клеточных носителей терапевтических генов обусловлена их безопасностью для алло- или аутотрансплантации и терапевтическим потенциалом самих МККП [20], а также фундаментальным свойством лейкоцитов синтезировать и секретировать различные биологически активные молекулы [21, 22]. Недавно в пилотных экспериментах на свиньях нами было установлено, что интратекальное введение мини-свиньям
генетически модифицированных МККП способствует улучшению двигательной активности после моделирования контузионной травмы спинного мозга [23].
Целью настоящего исследования является иммуноф-луоресцентный анализ реакции маркеров клеточного стресса и апоптоза, синаптических белков и нейроглии при посттравматическом ремоделировании спинного мозга у свиней породы вьетнамская вислобрюхая после интратекальной доставки генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1 c помощью МККП.
Материал и методы
Генетическая модификация мононуклеарных
клеток крови пуповины человека
Генетические векторы, несущие ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165), ген гли-ального нейротрофического фактора (GDNF) и ген нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) получены на основе рекомбинантного репликативно-дефектного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5). Создание, наращивание, хроматографическая очистка, определение активности и количества рекомбинантных векторов (Ad5-VEGF, Ad5-GDNF, Ad5-NCAM) выполнены согласно договору на базе Федерального научно-исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Москва, Россия) [24].
Кровь пуповины забирали по инструкции и в соответствии с протоколом законных и этических норм, общепринятых в Банке стволовых клеток Казанского государственного медицинского университета, согласно лицензии ФС-16-01-001450 от 26 декабря 2017 года. МККП выделяли из свежей пуповинной крови в градиенте плотности фиколла (ПанЭко, Россия) и трансдуци-ровали тремя аденовирусными векторами в комбинации Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в равном соотношении каждого вектора Ad5-VEGF (1/3), Ad5-GDNF (1/3), Ad5-NCAM (1/3), где показатель MOI (multiplicity of infection — множественность инфицирования) был равен 10 [19, 25]. Трансдуцированные клетки инкубировали в течение 14 часов. Для однократной инъекции готовили 2х106 МККП+Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в 200 мкл физиологического раствора.
Дизайн эксперимента
В исследовании были использованы половозрелые (4 месячные) самки свиней (вьетнамская вислобрюхая) весом 20-25 кг (n=6). В течение двух недель до операции животные содержались по одной в загоне с 12-часовым периодом чередования светлого и темного времени суток, со свободным доступом к воде и корму. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с приказом Минздравсоцразвития № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и с разрешения Локального этического комитета Казанского государственного медицинского университета (№ 5 от 27.05.2014 и № 2.20.02.18, от 20.02. 2018).
В день операции премедикацию проводили с помощью введения Zoletil 100 (Virbac Sante Animale, Франция) (5 мг/кг) и ксила (Интерхеми, Нидерланды) (10 мг/кг) внутримышечно. Антибиотик цефазолин (РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) (60 мг) вводили внутримышечно перед операцией. Анестезию начинали с внутривенного введения Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, Франция) (10 мг/кг), после чего животных
А
Th
Th
Th
Б
Ростральный отдел
Эпицентр
Каудальный „отдел
Рис. 1. Отделы (А) и области (Б) спинного мозга, выбранные для иммунофлуоресцентного исследования: CA — connus anterior (передние рога); TC — tnactus conticospinalis (кортикоспинальный тракт)
подключали к ингаляционному наркозному аппарату, по которому подавали изофлуран (Laboratorios Karizoo, S.A., Испания). Температура прямой кишки оценивали непрерывно во время операции и поддерживали при помощи теплового одеяла. В начале операции устанавливали мочевой силиконовый катетер, который оставался в мочевом пузыре в послеоперационном периоде. В ходе операции для восполнения объема потерянной крови через венозный катетер, установленный в ушную вену, выполняли инфузию 400 мл раствора Рингера (ООО «Гротекс», Россия). Венозный катетер оставляли в вене для последующих послеоперационных назначений. Контузионную травму спинного мозга выполняли по протоколу, который был описан ранее [23]. После проведения ламинэктомии на уровне Th9-Th10 позвонков, металлический цилиндр импактора фиксировали на расстоянии 1 мм от открытой поверхности спинного мозга. Дозированную контузионную травму вызывали с помощью груза массой 50 г, падающего с высоты 50 см [8].
Экспериментальным животным через 4 часа после моделирования нейротравмы интратекально вводили 200 мкл 0,9% раствора NaCl (Контрольная группа; n=2) или генетически модифицированные МККП, сверхэк-спрессирующие терапевтические гены (VEGF165, GDNF, NCAM1) (Опытная группа; n=2) на уровне L4-L5 позвонков под анестезией Zoletil® 100 (Virbac Sante Animale, Франция) (5 мг/кг) и ксила (Интерхеми, Нидерланды) (10 мг/кг) [26]. Группа интактных животных (Интактная группа; n=2) была использована для получения базовых значений для иммунофлуоресцентного анализа. Свиней из контрольной и опытной группы выводили из эксперимента через 60 суток после моделирования нейро-травмы. Продолжительность настоящего эксперимента обусловлена результатами наших предыдущих исследований на свиньях породы вьетнамская вислобрюхая с травмой спинного мозга [23].
Иммунофлуоресцентный анализ
Через 60 суток после моделирования нейротравмы свиней из контрольной и опытной групп подвергали эвтаназии. Животных вводили в глубокий наркоз с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, Франция) объёмом 0,5 мл в/м и постепенным повышением концентрации изофлурана (Laboratorios Karizoo, S.A., Испания) до 5,0 об%. Затем животных интракардиально перфузировали 4% параформальдегидом (Sigma, США) на фосфатно-солевом буфере (рН=7,4). Для иммунофлуоресцентного анализа выделяли каудальный
(15 мм) и ростральный (15 мм) отделы на расстоянии 7,5 мм от эпицентра (рис. 1). Полученные образцы пост-фиксировали в 4% растворе параформальдегида (Sigma, США) при 4 °С в течение 12 ч и с целью криопротекции инкубировали в 30% растворе сахарозы (Sigma, США). Поперечные свободно плавающие срезы спинного мозга толщиной 20 мкм готовили на криостате Microm HM 560. Ростральный и каудальный отделы были использованы для иммунофлуоресцентного анализа молекулярных и клеточных изменений при посттравматическом ремо-делировании спинного мозга.
Изготовленные срезы промывали в PBS с 1% Triton X-100 в течение 5 минут 3 раза, неспецифические места связывания первичных антител (АТ) блокировали в растворе PBS, содержащем 1% Тритон X-100 и 5% сыворотку осла, в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммунофлуоресцентные реакции проводили с помощью АТ против маркеров клеточного стресса (Hsp27) и апоптоза (Caspase3), синаптических белков (PSD95 и Synaptophysin), клеток макроглии (GFAP) и микроглии (Iba1) в передних рогах (cornus anterior, CA) спинного мозга (табл. 1 ). В кортикоспинальном тракте (tractus corticospinals, TC) олигодендроциты выявляли с помощью АТ против Olig2. Первый этап реакции проводили при температуре 4 °С в течение 12 ч. После промывки в PBS срезы инкубировали с вторичными антителами (см. табл. 1). Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали раствором DAPI (10 мкг/мл; Sigma, США). Анализ иммунофлуоресцентной реакции проводили с помощью конфокального сканирующего микроскопа LEICA TCS SP5 MP (Leica Microsystems, США) и Carl Zeiss AxioScope.A1 (Carl Zeiss, Германия). Цифровые изображения структур анализировали в квадрате площадью 0,05 мм2 с помощью программы ImageJ (NIH). При подсчете количества иммунопозитивных клеток (Hsp27, Caspase3, GFAP, Olig2 и Iba1) учитывали наличие ядер, выявляемых при помощи DAPI. Уровень флуоресценции в реакциях с АТ против синаптических белков (Synaptophysin и PSD95) оценивали как среднюю интенсивность пикселей с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, США). Изображения получали при стандартизированных значениях пинхола, мощности лазеров и скорости сканирования.
Статистический анализ
Анализа полученных данных выполняли в среде для статистических вычислений R 3.6.3 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Австрия). Описательные
Таблица. Первичные и вторичные антитела, использованные для иммунофлуоресцентной реакции.
Антитела Хозяин Разведение Производитель
Caspase3 Rabbit 1 200 Abcam, Великобритания
HSP27 Rabbit 1 200 Abcam, Великобритания
GFAP Mouse 1 200 Santa Cruz, США
Iba1 Rabbit 1 150 Abcam, Великобритания
Olig2 Rabbit 1 100 Abcam, Великобритания
PSD95 Rabbit 1 200 Abcam, Великобритания
Synaptophysin Rabbit 1 200 Abcam, Великобритания
Anti-mouse IgG conjugated with Alexa 488 Donkey 1 200 Invitrogen, США
Anti-rabbit IgG conjugated with Alexa 647 Donkey 1 200 Invitrogen, США
А
Ростральный отдел
Каудальный отдел
Б
Ibal/Dapj Б'
*н . .. 30
i . - \ s
о 25
- " * 1 ' ' \
i '' ; ч ® 20
о § x 15
t • ? s §
100 Mm 10
В
GFAP/Dapi
•:< • г 'к •
■ Ы ■ fu ;
- . . < ■' Г , '-■■
GFAß/Däpi '
, г- ; V V^ii . 'V' >"■''■' / ■ ! Ä ' :
В.. Контрольная группа
Интактная группа п к „ 1
Ростральный отдел
Опытная группа Ростральный отдел
Контрольная группа Каудальный отдел
Опытная группа Каудальный отдел
Рис. 2. Реакция нейроглии спинного мозга свиней через 60 суток после моделирования нейротравмы: А — имму-нофлуоресцентная реакция с АТ к 0Нд2 в кортикоспиналь-ном тракте спинного мозга опытного животного; Б — им-мунофлуоресцентная реакция с антителами к 1Ьа1 в передних рогах спинного мозга опытного животного; В — иммунофлуоресцентная реакция с антителами к вРАР в передних рогах спинного мозга опытного животного; А', Б', В' — результат статистического анализа количества иммунопозитивных клеток в ростральном и каудальном от эпицентра повреждения отделах спинного мозга в разных экспериментальных группах. Ядра клеток докрашены йАР! (синий). Масштабный отрезок — 100 рт; * — различия между экспериментальными группами, р<0,05
статистики представлены в виде медиан, 1-ого и 3-его квартилей. Для сравнения значений количественных переменных между группами применяли тест Краскела-Уоллиса. Для попарных межгрупповых сравнений использовали тест Данна с поправкой, различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Olig2+ клетки. Количественный анализ 0Ид2-позитивных клеток (олигодендроциты) в области кортикоспинального тракта ^гасШэ согйсозртаПз, ТС)
обнаружил уменьшение численности олигодендроцитов в ростральном (22 [21;25]) и каудальном (20 [19;21]) отделах у животных контрольной группы и в каудальном отделе (20 [18;23]) из опытной, при сравнении с интакт-ной группой (28 [26;30]) (р<0,05). В ростральном отделе у мини-свиней после инфузии генетически модифицированных МККП количество 0Пд2-позитивных клеток (26 [25;28]) не отличалось от значений у интактных животных (рис. 2А). Таким образом, в ответ на травму количество олигодендроцитов уменьшается приблизительно в одинаковой степени в обоих, ростральном и кау-дальном отделах (рис. 2). У животных опытной группы
А
Ростральный отдел
Б
Каудальный отдел
Synaptoptiysin/Dapi
А'
í
PSD95/Dap¡
"Ч. .-V ■
ч
"00 |дт
Б'
Í
-.1
N
'—Интактная группа
Контрольная группа Ростральный отдел
Опытная группа Ростральный отдел
Контрольная группа Каудальный отдел
Опытная группа Каудальный отдел
Рис. 3. Реакция синаптических белков в передних рогах спинного мозга свиней через 60 суток после моделирования нейротравмы: А — иммунофлуоресцентная реакция с Ат Бупар^рЬ^п в спинном мозге опытного животного; Б — иммунофлуоресцентная реакция
с АТ к РБй95 в спинном мозге опытного животного; А', Б' — статистический анализ уровня флуоресценции в реакциях с АТ против синаптических белков в ростральном и каудальном от эпицентра повреждения отделах спинного мозга в разных экспериментальных группах. Ядра клеток докрашены йАР! (синий). Масштабный отрезок — 100 рт; * — различия между экспериментальными группами, р<0,05
3Q
^ 2U
3Q
4и
2G
в ростральном отделе отмечена тенденция к нарастанию 0Нд2-позитивных клеток в условиях интратекальной доставки целевых генов с помощью МККП.
Iba1+ клетки. Подсчет количества Iba1-позитивных клеток в передних рогах (cornus anterior, CA) спинного мозга обнаружил увеличение численности микроглии в ростральном (25 [23;25]) и каудальном (26 [23;28]) отделах у контрольных свиней и в каудальном (20 [18;24]) — у животных опытной группы, при сравнении с интактной группой (12 [10;15]) (р<0,05). Количество Ibal-позитивных клеток в ростральном отделе мини-свиней опытной группы (16 [14; 17]) было меньше чем, чем у животных из контрольной группы и не отличалось от интактных (рис. 2Б). Анализ полученных данных обнаружил, что после контузионной травмы спинного мозга количество клеток микроглии существенно нарастает в обоих исследованных отделах (рис. 2). Интратекальная инфузия генетически модифицированных МККП снижает их количество, что наиболее выражено в ростральном отделе.
GFAP клетки. Анализ численности GFAP-позитивных клеток (астроциты) в передних рогах спинного мозга выявил увеличение количества астроцитов в ростральном (20 [19;22]) и каудальном (22 [20;25]) отделах в контрольной группе и в ростральном отделе (15 [14; 15]) в опытной группе, при сравнении с интактной группой (11 [10;12]) (р<0,05). При этом количество GFAP-позитивных клеток в каудальном отделе у свиней опытной группы (14 [13;15]) не отличалось от значений интактных животных (рис. 2В). Таким образом, количество астро-цитов на данном сроке еще сохраняется на высоком уровне. Реактивный астроглиоз в ростральном отделе более выражен, чем в каудальном (рис. 2). Образование реактивных астроцитов подтипа А1 индуцируется активированной нейровоспалительной микроглией, которая секретирует цитокины II-1 а, TNF и C1q. В ответ астроциты А1 утрачивают способность поддерживать выживание нейронов, рост аксонов и синаптогенез и индуцируют гибель нейронов и олигодендроцитов. Гибель поврежденных нейронов ЦНС in vivo предотвращается при блокировании образования реактивных астроцитов A1 [27]. Следует отметить, что интратекальная доставка
целевых генов снижает реактивный астроглиоз в обоих (ростральном и каудальном) отделах.
Синаптические маркеры. Анализ уровня синаптических белков (БупарШрЬ^п и РБ095) в нейронах передних рогов спинного мозга показал существенные различия в уровень флуоресценции в ростральном и каудальном отделах в экспериментальных группах. Уровень белка БупарШрЬ^п был значительно снижен в ростральном (23.4 [19.8;28.9]) и каудальном (16.4 [14.9;21.2]) отделах у контрольных животных и в каудальном отделе (26.8 [20.0;33.1]) у свиней из опытной группы, при сравнении с интактными животными (42.8 [41.1;43.8]) (р<0,05). При этом у свиней опытной группы уровень флуоресценции белка БупарШрЬ^п в ростральном отделе (38.1 [33.6;46.0]) была выше, чем у контрольных и не отличалась от интактных в том же отделе (рис. 3А). Анализ иммунофлуоресцентной реакции с АТ против РБ095 обнаружил уменьшение уровня флуоресценции РБ095 в каудальном отделе животных опытной (29.0 [26.0;38.0]) и контрольной (36.9 [32.4;41.5]) групп, при сравнении с интактной группой (46.9 [44.9;49.3]) (р<0,05). В ростральном отделе значения у свиней контрольной (41.4 [40.7;42.3]) и опытной групп (46.9 [36.7;50.3]) не отличались от интактной (рис. 3Б). Таким образом, в ответ на травму экспрессия БупарйрЬ^т снижается в обоих отделах, при этом рекомбинантные УБОГ, 00\1Г и 1\1САМ поддерживают экспрессию этого пресинаптического белка, что наиболее выражено в ростральном отделе. В отношении РБ095 отмечено менее выраженное снижение его экспрессии на данном сроке исследования и отсутствие влияния генетически модифицированных МККП на этот показатель (рис. 3).
Маркеры стресса и апоптоза. Через 60 суток после моделирования нейротравмы количество Caspase3-позитивных клеток в передних рогах спинного мозга в ростральном отделе не отличалось у животных опытной (10.0 [9.0;13.0]) и контрольной (11.5 [9.0;15.0]) групп (рис. 4А). В каудальном отделе подсчет клеток, вступивших в апопотоз, также не выявил различий в опытной (17.0 [13.0;20.0]) и контрольной (16.0 [15.8;19.5])
А
Ростральный отдел
Каудальный отдел
А'
Б
еЗ/Рар1
100 мт
Б'
■Г"
Интактная группа —'
Контрольная группа Ростральный отдел
Опытная группа Ростральный отдел
Контрольная группа Каудальный отдел
Опытная группа Каудальный отдел
Рис. 4. Реакция маркеров стресса и апоптоза в передних рогах спинного мозга свиней через 60 суток после моделирования нейротравмы. А — иммунофлуоресцентная реакция
с АТ к НБр27 в спинном мозге опытного животного; Б — иммунофлуоресцентная реакция
с АТ к проапоптозному белку СаБраБе3 в спинном мозге опытного животного; А', Б' — статистический анализ количества иммунопозитивных клеток в ростральном и каудальном от эпицентра повреждения отделах спинного мозга в разных экспериментальных группах. Ядра клеток докрашены ОДР! (синий). Масштабный отрезок — 100 рт; * — различия между экспериментальными группами, р<0,05
25
£ 20
V 5
0
К 20
группах. Следует отметить, что в обеих экспериментальных группах СаБраБеЗ-позитивных клеток было больше в каудальном отделе при сравнении с ростральным (р<0,05). Анализ иммунофлуоресцентной реакции с АТ против белка теплового шока (НБр27) в передних рогах спинного мозга обнаружил значительное увеличение числа НБр27-позитивных клеток в ростральном и каудальном отделах спинного мозга животных обеих экспериментальных групп при сравнении с интактными животными (1.0 [1.0;2.0]) (р<0,05). В ростральном отделе количество НБр27-позитивных клеток в опытной группе составило 12.5 [10.0;17.2] и в контрольной группе — 17.0 [14.8;20.0], что не отличалось от соответствующих значений в каудальном отделе спинного мозга, где количество НБр27-позитивных клеток в опытной группе было 18.0 [16.0;20.0], а в контрольной — 19.0 [18.0;21.2] (рис. 4Б). По критерию количества НБр27- и СаБраБеЗ-иммунопозитивных клеток значительных различий в эффектах генетически модифицированных МККП не установлено. Однако, как в каудальном, так и в ростральном отделах зарегистрирована тенденция к снижению НБр27- и СаБраБеЗ-иммунопозитивных клеток на фоне клеточно-опосредо-ванной доставки целевых генов.
Сопоставляя сдвиги в посттравматических реакциях глиальных клеток в ростральном и каудальном отделах, следует отметить их наибольшую выраженность в ростральном отделе. В нем в большей мере проявляется позитивный эффект клеточно-опосредованной доставки комбинации генов по критерию сохранности или формирования новых пресинаптических структур. Такая избирательность ответов в ростральном отделе может быть связана с особенностями топографии трактов у данного вида животных, по сравнению с известной у грызунов, что может быть причиной преимущественного повреждения восходящих сенсорных путей спинного мозга свиньи.
Результаты настоящего исследования согласуются с нашими данными, полученными при изучении влияния генетически модифицированных МККП, сверх-экспрессирующих рекомбинантные молекулы УБОБ, ООЫБ и 1\1САМ, на нейрорегенерацию у крыс с травмой
спинного мозга [15]. Так у крыс после интратекальной доставки целевых генов в передних рогах спинного мозга было показано снижение экспрессии белка теплового шока НБр27, восстановление экспрессии синаптических белков, снижение количества астро-цитов и клеток микроглии и повышение численности олигодендроцитов [15]. Более того, полученные данные о положительных посттравматических молекулярных и клеточных сдвигах в спинном мозге свиней являются обоснованием восстановления двигательной активности задних конечностей у свиней с травмой спинного мозга в наших ранних исследованиях [17].
Таким образом, сдерживание развития астроглиоза, поддержание миелинизации и восстановление функциональной активности нейронов в спинном мозге крыс и свиней дают основание полагать, что интратекальная доставка генов УБвП65, вО№ и М0ДМ1 с помощью МККП при травме спинного мозга оказывает аналогичное влияние на молекулярные и клеточные изменения у мелких (грызунов) и крупных (свиней) животных.
В эксперименте на животных для доставки генов, кодирующих ООЫБ, \1ОБ (фактор роста нервов), ВОЫБ (мозговой нейротрофический фактор), С\1ТБ (цилиар-ный нейротрофический фактор), \1Т3 (нейротрофин 3) применяются различные клеточные носители (клетки-предшественники нейронов, клетки-предшественники олигодендроцитов, шванновские клетки, стволовая мезенхимная клетка, фибробласты) [11]. При этом в клинических исследованиях для клеточной терапии используют различные клеточные популяции, полученные из крови пуповины. Так, установлено улучшение двигательной функции у пациентов с хронической спинномозговой травмой после инъекции МККП в задние корешки спинного мозга [28]. В других клинических исследованиях пациентам с травмой спинного мозга интратекально вводили стволовые клетки, выделенные из крови пуповины [29, 30]. Можно предположить, что генетическая модификация МККП, направленная на продукцию молекул-стимуляторов нейрорегене-рации, может улучшить восстановление пациентов с травмой спинного мозга.
Полученные нами данные дают основание полагать, что интратекальная доставка одновременно трех терапевтических генов, кодирующих VEGF, GDNF и NCAM, с помощью МККП, представляет собой эффективный метод стимулирования нейрорегенерации и может быть использован для дальнейшей разработки лечения нейро-травм у человека.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. O'Shea T.M., Burda J.E., Sofroniew M.V. Cell biology of spinal cord Injury and repair. The Journal of clinical investigation. Am. Soc. Clin. Inv. 2017; 127(9): 3259-70.
2. Petrosyan H.A., Alessi V., Hunanyan A.S. et al. Spinal electromagnetic stimulation combined with transgene delivery of neurotrophin NT-3 and exercise: novel combination therapy for spinal contusion injury. J. Neurophysiol. 2015; 114(5): 2923-40.
3. Ahuja C.S., Fehlings M. Concise Review: Bridging the Gap: Novel Neuroregenerative and Neuroprotective Strategies in Spinal Cord Injury. STEM CELLS Transl. Med. 2016; 5(7): 914-24.
4. Badner A., Siddiqui A.M., Fehlings M.G. Spinal cord injuries: how could cell therapy help? Expert Opinion on Biol. Ther. 2017; 17(5): 529-41.
5. Thuret S., Moon L.D.F., Gage F.H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature reviews. Neuroscience 2006; 7(8): 628-43.
6. Boekhoff T.M., Flieshardt C., Ensinger E.M. et al. Quantitative magnetic resonance imaging characteristics: evaluation of prognostic value in the dog as a translational model for spinal cord injury. J. Spinal disorders & Techniques 2012; 25(3): E81-7.
7. Zurita M., Aguayo C., Bonilla C. et al. The pig model of chronic paraplegia: A challenge for experimental studies in spinal cord injury. Progress in Neurobiol. Prog. Neurobiol. 2012; 97(3): 288-303.
8. Jones C.F., Lee J.H.T., Kwon B.K. et al. Development of a large-animal model to measure dynamic cerebrospinal fluid pressure during spinal cord injury: Laboratory investigation. J. Neurosurg. 2012; 16(6): 624-35.
9. Lee J.H.T., Jones C.F., Okon E.B. et al. A Novel Porcine Model of Traumatic Thoracic Spinal Cord Injury. J. Neurotrauma 2013; 30(3): 142-59.
10. James N.D., Shea J., Muir E.M. et al. Chondroitinase gene therapy improves upper limb function following cervical contusion injury. Exp. Neurol. 2015; 271: 131-5.
11. Walthers C.M., Seidlits S.K. Gene delivery strategies to promote spinal cord repair. Biomarker Insights 2015; 2015 Suppl 1: 11-29.
12. Hodgetts S.I., Harvey A.R. Neurotrophic Factors Used to Treat Spinal Cord Injury. Vitamins and Hormones 2017; 104: 405-57.
13. Chen J., Bernreuther C., Dihne M. Cell adhesion molecule l1-trans-fected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury. J. Neurotrauma 2005; 22(8): 896-906.
14. Krakora D., Mulcrone P., Meyer M. et al. Synergistic effects of GDNF and VEGF on lifespan and disease progression in a familial ALS rat model. Mol. Ther. 2013; 21(8): 1602-10.
15. Izmailov A.A., Povysheva T.V., Bashirov F.V. et al. Spinal Cord Molecular and Cellular Changes Induced by Adenoviral Vector- and Cell-Mediated Triple Gene Therapy after Severe Contusion. Frontiers in Pharmacol. 2017; 8: 813.
16. Islamov R.R., Izmailov A.A., Sokolov M.E. et al. Evaluation of direct and cell-mediated triple-gene therapy in spinal cord injury in rats. Brain Res. Bulletin 2017; 132: 44-52.
17. Islamov R.R., Rizvanov A.A., Fedotova V.Y. et al. Tandem Delivery of Multiple Therapeutic Genes Using Umbilical Cord Blood Cells Improves Symptomatic Outcomes in ALS. Mol. Neurobiology 2017; 54(6): 4756-63.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 16-15-00010. Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр Российской академии наук». Авторы выражают благодарность И.И. Салафутдинову за помощь в экспериментах.
18. Измайлов А.А., Соколов М.Е., Баширов Ф.В. и др. Сравнительный анализ эффективности прямой и клеточно-опосредованной генной терапии крыс с контузионной травмой спинного мозга. Гены и Клетки 2018; XII(4): 53-9. [Izmailov A.A., Sokolov M.E., Bashirov F.V. et al. Comparative analysis of the efficacy of direct and cell-mediated gene therapy in rats with spinal contusion injury. Genes and Cells 2018; XII(4): 53-9].
19. Фадеев Ф.О., Баширов Ф.В., Измайлов А.А. и др. Нейроглия при контузионной травме спинного мозга крысы на фоне клеточно-опосредо-ванной доставки комбинации генов VEGF165, GDNF и NCAM1 в сочетании с эпидуральной электрической стимуляцией. Гены и Клетки 2020; XV(2): 58-65. [Fadeev F.O., Bashirov F.V., Izmailov A.A. et al. Neuroglia in rat spinal cord contusion injury on the background of cell-mediated delivery of a combination of VEGF165, GDNF, and NCAM1 genes in combination with epidural electrical stimulation. Genes and Cells 2020; XV(2): 58-65].
20. Yang W.Z., Zhang Y., Wu F. et al. Safety evaluation of allogeneic umbilical cord blood mononuclear cell therapy for degenerative conditions. J. Transl. Med. 2010; 8(1): 1-6.
21. Neuhoff S., Moers J., Rieks M. et al. Proliferation, differentiation, and cytokine secretion of human umbilical cord blood-derived mononuclear cells in vitro. Exp. Hematol. 2007; 35(7): 1119-31.
22. Fan C.G., Zhang Q.J., Tang F.W. Human umbilical cord blood cells express neurotrophic factors. Neuroscience Letters 2005; 380(3): 322-5.
23. Islamov R.R., Sokolov M.E., Bashirov F.V. et al. A pilot study of cellmediated gene therapy for spinal cord injury in mini pigs. Neuroscience Letters 2017; 644: 67-75.
24. Shcherbinin D.N., Esmagambetov I.B., Noskov A.N. et al. Protective immune response against Bacillus anthracis induced by intranasal introduction of a recombinant adenovirus expressing the protective antigen fused to the Fc-fragment of IgG2a. Acta Naturae 2014; 6(1): 76-84.
25. Islamov R.R., Rizvanov A.A., Mukhamedyarov M.A. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neur. Current Gene Therapy 2015; 15(3): 266-76.
26. Riley J., Federici T., Park J. et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: Preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurg. 2009; 65(4): 754-61.
27. Liddelow S.A., Guttenplan K.A., Clarke L.E. et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature 2017; 541(7638): 481-7.
28. Zhu H., Poon W., Liu Y. et al. Phase III Clinical Trial Assessing Safety and Efficacy of Umbilical Cord Blood Mononuclear Cell Transplant Therapy of Chronic Complete Spinal Cord Injury. Cell Transplantation 2016; 25(11): 1925-43.
29. Liu J., Han D., Wang Z. et al. Clinical analysis of the treatment of spinal cord injury with umbilical cord mesenchymal stem cells. Cytotherapy 2013; 15(2): 185-91.
30. Yao L.Q., He C., Zhao Y. et al. Human umbilical cord blood stem cell transplantation for the treatment of chronic spinal cord injury: Electrophysiological changes and long-term efficacy. Neural Reg. Res. 2013; 8(5): 397-403.
