Шванновские клетки в области травмы спинного мозга крысы при локальной доставке генов VEGF и FGF2 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.832-001-085

© Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, А.Р. Мухитов, Ю.А. Челышев, 2012

Я.О. Мухамедшина1, Г.Ф. Шаймарданова2, А.Р. Мухитов2, Ю.А. Челышев1

ШВАННОВСКИЕ КЛЕТКИ В ОБЛАСТИ ТРАВМЫ СПИННОГО МОЗГА КРЫСЫ ПРИ ЛОКАЛЬНОЙ ДОСТАВКЕ ГЕНОВ VEGF И FGF2*

'ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России

2ФГБУН «Казанский институт биохимии и биофизики» Казанского научного центра РАН

На модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне Т8 изучено влияние однократной трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой с генами VEGF и FGF2, на миграцию в спинной мозг, выживание и дифференциров-ку эндогенных шванновских клеток. Показана возможность выживания трансплантированных клеток в спинном мозге реципиента до 30 суток, а также их миграция на расстояние более 1 см в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы. При помощи иммуногистохимического выявления маркеров Krox20, P0 и p75 установлено, что локальная доставка генов VEGF и FGF2 на клеточных носителях стимулирует миграцию и выживание в спинном мозге эндогенных шванновских клеток, в том числе способных экспрессировать белок периферического миелина Р0 для потенциальной ремиелинизации поврежденных аксонов.

Ключевые слова: травма спинного мозга, шванновские клетки, клетки крови пуповины, трансфекция, VEGF,

FGF2.

Y.O. Mukhamedshina, G.F. Shaymardanova, A.R. Mukhitov, Yu.A. Chelyshev

THE SCHWANN CELLS IN TRAUMA AREA OF RAT SPINAL CORD AFTER LOCAL

DELIVERY OF GENES VEGF AND FGF2

On the model of rat spinal cord contusion trauma at T8 level the effect of single transplantation of plasmid transfected human umbilical cord blood mononuclear cells with VEGF and FGF2 genes was studied on migration into the injury region, survival and differentiation of endogenous Schwann cells.The possibility of survival of transplanted cells in spinal cord up to 30 days, as well as their migration at a distance of more than 1 sm in rostral and caudal directions from the epicenter of the trauma was revealed. Using immunohistochemical detection of markers Krox20, P0 and p75 it was shown, that local delivery of VEGF and FGF2 genes stimulated migration and survival of endogenous Schwann cells in the trauma region, including those which capable to express a protein of peripheral myelin P0 for potential remyelination of damaged axons.

Key words: spinal cord trauma, Schwann cells, umbilical cord blood cells, transfection, VEGF, FGF2.

Введение. Доставка в область повреждения спинного мозга мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных при помощи плазмидных векторов с клонированными генами нейротрофических и ангиогенных факторов, считается достаточно эффективным методом стимулирования нейрорегенерации [1]. Это связано с комбинированным позитивным влиянием как самих клеток [3, 5, 8], так и доставляемых с их помощью терапевтических генов, обеспечивающих синтез необходимых для регенерации молекул [6, 7]. Непосредственное введение в область повреждения полипептидных факторов приводит к их быстрому расщеплению эндогенными пептидазами. Поэтому для стимулирования нейрорегенерации эффективнее доставлять не сами белковые стимуляторы нейрорегенерации, а кодирующие их гены. С этой целью применительно к травме спинного мозга нами выбрана комбинация генов VEGF и FGF2 [1]. Обе молекулярные детерминанты являются одновременно нейротрофическими и ангиогенными факторами.

* Работа поддержана государственным контрактом ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации № 16.512.11.2101.

Цель: оценить влияние локальной доставки комбинации генов VEGF и FGF2 при помощи мо-нонуклеарных клеток крови пуповины человека на миграцию и выживание в области контузионной травмы спинного мозга крысы эндогенных шванновских клеток.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на 40 белых лабораторных крысах, самках и самцах весом 200-250 г. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» и одобренным этическим комитетом. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Крыс наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Животным всех групп проводили ламинэктомию на уровне ТВ, после чего наносили дозированную контузионную травму спинного мозга [1, 2]. Сразу после нанесения травмы трансфицированные плазмидой pBud-VEGF-FGF2 с комбинацией генов VEGF и FGF2 мононуклеар-ные клетки крови пуповины человека инъецировали по 1 млн в 5 мкл DPBS (БиолоТ) в 2 точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее эпицентра травмы и 0,5 мм латеральнее срединной линии при помощи гамильтоновского шприца (Sigma). Крысам контрольной группы не производили трансплантацию клеток. В течение 7 суток после операции всем экспериментальным животным внутримышечно вводили гентамицин (5 мг/кг) один раз в сутки.

Через 14, 21 и 30 суток после нанесения травмы животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4 % раствором параформальдегида (4° С). Фрагмент спинного мозга длиной 5 см забирали вместе с позвонками. Через 12 часов от начала фиксации выделяли спинной мозг и разделяли его на 5 равных частей.

На криостатных поперечных срезах спинного мозга толщиной 20 мкм при помощи флюоресцентной иммуногистохимии с последующей конфокальной микроскопией изучали выживание и миграционный потенциал трансфицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека с антителами против ядер клеток человека HNu (Chemicon) и эндогенных шванновских клеток с антителами против белка периферического миелина Р0 (Abcam) и низкоаффинного рецептора фактора роста нервов p75 (Santa Cruz).

На аналогичных срезах на расстоянии 1 см каудально и рострально от эпицентра травмы непрямым иммунопероксидазным методом выявляли экспрессию отецифического маркера шванновсих клеток с антителами против фактора транскрипции Krox20 (Covancе). Количество Krox20 -клеток подсчитывали на оцифрованных изображениях в 4 фиксированных зонах белого вещества. Просмотр препаратов и оцифровку изображений проводили на световом микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss) (Германия) и конфокальном сканирующем микроскопе LSM 510-Meta (Carl Zeiss) (Германия). Результаты морфометрии обрабатывали с использованием критерия Стьюдента (t).

Результаты и их обсуждение. К 30 суткам в области травмы спинного мозга и в прилегающих отделах обнаружены клетки, экспрессирующие специфические маркеры шванновских клеток. В контрольной и опытной группах аналогичные клетки выявлены на расстоянии до 2 см в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы. Ют^^клетки присутствуют в сером и белом веществе на расстоянии 0,5 и 1 см рострально и каудально от эпицентра травмы. На расстоянии 1,5 см в обоих направлениях отмечены единичные Krox20 -клетки, а на расстоянии 2 см эти клетки в сером веществе не найдены. Стабильная по количеству популяция ^т^^леток присутствует в задних канатиках на участке протяженностью до 2 см в обоих направлениях от эпицентра травмы. При трансплантации клеток, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, количество Krox20 -клеток в белом веществе на расстоянии 1 см рострально и каудально от эпицентра травмы увеличивается на 5В,5 и 63,5 %, соответственно, по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе животных без введения клеток. У животных опытной группы в белом веществе преимущественно в латеральной части бокового канатика слева и справа на расстоянии 1 см в каудальном направлении от эпицентра травмы обнаружено значительное количество клеток, одновременно экспрессирующих белок периферического миелина Р0 и белок p75 (рис. 1). Появление численно большой популяции шванновских клеток в области травмы спинного мозга можно рассматривать как благоприятный фактор стимулирования нейрорегенерации при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой с генами VEGF и FGF2.

афт / V ф

г Л

ф ф-

Рис. 1. Р0- и р75-иммунопозитивные клетки в латеральной части бокового канатика слева в спинном мозге крысы на расстоянии 1 см от эпицентра в каудальном направлении на 30 сутки после нанесения контузионной травмы и введения мононуклеарных клеток крови пуповины человека,

трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2.

Р0 - флюоресцентный краситель ТМТС (желтый цвет); р75 - флюоресцентный краситель А1еха 647 (красный цвет), ядра окрашены DAPI (синий цвет).

Конфокальная микроскопия. Увеличение х 400

При помощи иммунофлуоресцентной гистохимической реакции с антителами против ядер клеток человека показана возможность выживания трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека в спинном мозге до 30 суток, даже в условиях отсутствия специфической имму-носупрессивной терапии. К 14 суткам в области дорсальных канатиков на расстоянии 0,2 см в обоих направлениях обнаружено объемное скопление трансплантированных клеток (110 НКи-клеток в участке площадью 0,03 мм2) (рис. 2). К 21 и 30 суткам количество НКи-клеток постепенно снижается. К 30 суткам их единичные небольшие скопления присутствуют в участке протяженностью 1,15 см в каудальном направлении от эпицентра травмы. При этом наибольшее количество клеток наблюдается в области задних корешков (31 и 14 НКи-клеток в участке площадью 0,03 мм2 на расстоянии 1 и 1,15 см), что указывает на возможную преимущественную миграцию трансплантируемых клеток через задние корешки. В белом веществе в области боковых канатиков на границе с серым веществом НКи-клетки обнаружены в участке протяженностью 1 см от эпицентра травмы в каудальном направлении, а на расстоянии 1,15 см эти клетки уже не найдены. Выявленные нами сроки выживания мононуклеарных клеток крови пуповины человека соответствуют литературным данным [4]. Однако миграционный потенциал этих клеток, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 с генами VEGF и FGF2, при сравнении с аналогичным показателем в работе [4] превышает на 9,5 мм.

Рис. 2. Н№-иммунопозитивные клетки в области дорсальных канатиков спинного мозга крысы на расстоянии 0,2 см от эпицентра в каудальном направлении на 14 сутки после нанесения контузионной травмы и введения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2. Флюоресцентный краситель А1еха 488 (зеленый цвет), ядра окрашены DAPI (синий цвет). Пунктиром показана граница между белым (ниже пунктира) и серым веществом.

Конфокальная микроскопия. Увеличение х 400

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансфицированные плазмидой pBud-VEGF-FGF2 мононуклеарные клетки крови пуповины человека, немедленно трансплантированные в область травмы спинного мозга, за счет длительного выживания, выраженной собствен-

ной миграции и привлечения в спинной мозг эндогенных шванновских клеток обладают терапевтическим потенциалом, в том числе за счет ремиелинизации демиелинизированных аксонов.

Список литературы

1. Шаймарданова, Г. Ф. Посттравматические изменения спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных генами VEGF и FGF2 / Г. Ф. Шаймарданова, Я. О. Мухамедшина, С. С. Архипова и др. // Морфология. - 2011. -Т. 140, № 6. - С. 36-42.

2. Шаймарданова, Г. Ф. Экспрессия молекулярных детерминант шванновских клеток и периферического миелина в спинном мозге крысы при контузионной травме / Г. Ф. Шаймарданова, Я. О. Мухамедшина, С. С. Архипова и др. // Морфологические ведомости. - 2011. - № 2. - С. 73-77.

3. Chen, C. T. Infusion of human umbilical cord blood cells ameliorates hind limb dysfunction in experimental spinal cord injury through anti-inflammatory, vasculogenic and neurotrophic mechanisms / C. T. Chen, N. H. Foo, W. S. Liu et al. // Pediatr Neonatol. - 2008. - Vol. 49, № 3. - P. 77-83.

4. Dasari, V. R. Umbilical cord blood stem cell mediated downregulation of fas improves functional recovery of rats after spinal cord injury / V. R. Dasari, D. G. Spomar, L. Li et al. // Neurochem Res. - 2008. - Vol. 33, № 1. - P. 134-149.

5. Dasari, V. R. Neuronal apoptosis is inhibited by cord blood stem cells after spinal cord injury / V. R. Dasari, K. K. Veeravalli, A. J. Tsung et al. // J. Neurotrauma. - 2009. - Vol. 26, № 11. - P. 2057-2069.

6. Ikeda, Y. Development of angiogenic cell and gene therapy by transplantation of umbilical cord blood with vascular endothelial growth factor gene / Y. Ikeda, N. Fukuda, M. Wada et al. // Hypertens Res. -2004. - Vol. 27. - P. 119-128.

7. Kuh, S. U. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain-derived neutrophic factor into the spinal cord injured rat / S. U. Kuh, Y. E. Cho, D. H. Yoon et al. // Acta Neurochir. - 2005. - Vol. 147, № 9. - P. 985-992.

8. Zwart, I. Umbilical cord blood mesenchymal stromal cells are neuroprotective and promote regeneration in a rat optic tract model / I. Zwart, A. J. Hill, F. Al-Allaf et al. // Exp Neurology. - 2009. -Vol. 216, № 2. - P. 439-448.

Мухамедшина Яна Олеговна, студентка VI курса педиатрического факультета, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Россия, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: 8-927-430-74-11, е-mail: Yanakazmedhist1@rambler.ru.

Шаймарданова Гульнара Фердинантовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза, ФГБУН «Казанский институт биохимии и биофизики» Казанского научного центра РАН, Россия, 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, тел.: (843) 231-90-35, е-mail: gulnara_kzn@rambler.ru.

Мухитов Александр Ринатович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории микроскопии, ФГБУН «Казанский институт биохимии и биофизики» Казанского научного центра РАН, Россия, 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я 30, тел.: (843) 231-90-34, е-mail: alexmukhitov@mail.ru.

Челышев Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Россия, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: (843) 292-76-19, е-mail: chelyshev-kzn@yandex.ru.

УДК 616.71-018.46-002-092

© А.А. Нестеров, А.П. Нестеров, О.С. Пархоменко, А.А. Пархоменко, 2012

А.А. Нестеров, А.П. Нестеров, О.С. Пархоменко, А.А. Пархоменко

ПАТОГЕНЕЗ ОДОНТОГЕННОГО ОСТЕОМИЕЛИТА ЧЕЛЮСТЕЙ У ЛИЦ С ЗАВИСИМОСТЬЮ ОТ ДЕЗОМОРФИНА

ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России

В 2008 по 2012 гг. в клинике челюстно-лицевой хирургии проведено обследование и лечение 57 больных с хроническим одонтогенным остеомиелитом челюстей, развившимся на фоне наркотической интоксикации дезоморфином кустарного производства. Патогенез данного заболевания до конца не изучен, но ряд фактов по-

197