CC BY
22
УДК 615.273.52
РЕЗУЛЬТАТЫ ПЕРВИЧНОГО СКРИНИНГА НОВЫХ СОЛЕЙ ПРОИЗВОДНЫХ 7-ТИЕТАНИЛ-3-ПРОПИЛ-КСАНТИНА В ОТНОШЕНИИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В УСЛОВИЯХ IN VITRO.
Ураков1 А.Л., Самородов2А.В., Камилов2 Ф.Х., Халимов2А.Р., Тимирханова2Г.А., Халиуллин2 Ф.А.
1 ФГБОУ ВО «Ижевская Государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Ижевск, Россия.
2 ФГБОУ ВО «Башкирский Государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа, Россия.
Аннотация: Проведен скрининг впервые синтезированных производных 7-тиетанил-3-пропилксантина и применяемых в медицине лекарственных препаратов на систему гемостаза в условиях in vitro на донорской крови человека. Установлено различное влияние изученных соединений на функциональную активность тромбоцитов. Большинство соединений проявляют антиагрегационную активность, соединение под лабораторным шифром I проявляет проагрегантную активность, превосходящую по уровню препарат сравнения - этамзилат, что свидетельствует о его потенциально высоком гемостатическом эффекте. Методом тромбоэластографии изучен гемо-статический эффект соединения под лабораторным шифром I. Выявлены изменения показателей, характеризующих функциональную активность тромбоцитов и механико-физические свойства сгустка. Показатели, ответственные за систему фибринолиза, изменений не претерпевали. Полученные результаты убеждают в необходимости и актуальности дальнейших исследований влияния производных ряда 7-тиетанил-3-пропилксантина на систему гемостаза, как потенциальных корректоров системы гемостаза.
Ключевые слова: система гемостаза, тиетансодержащие ксантины, антиагрегационная активность, гемостати-ческая активность.
Введение. Одним из современных направлений в разработке новых лекарственных средств является синтез аналогов и производных применяемых в практической медицине лекарственных препаратов. Результаты предыдущих исследований, направленных на поиск новых средств коррекции системы гемостаза, демонстрируют наличие антиагрегационной и проагрегантной активности у ряда производных тиетансодержа-щих ксантина [1]. Полученные результаты мотивируют дальнейший поиск потенциальных ан-тиагрегантов и гемостатических препаратов среди производных данного ряда. В настоящей работе представлены результаты скрининга новых солей 7-тиетанил-3-пропилксантина в отношении системы гемостаза в условиях in vitro.
Цель. Оценить влияние 5 впервые синтезированных производных 7-тиетанил-3-пропилксан-тина [2] на систему гемостаза in vitro и сравнить
с применяемыми в медицине лекарственными препаратами.
Материалы и методы. Вся экспериментальная работа выполнена на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет в условиях in vitro в соответствии с рекомендациями "Руководства по доклиническому изучению новых фармакологических веществ" [3]. Исследование было одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России (№2 от 17.10.2012). Информированное согласие было получено у всех участников исследования до забора крови.
Взятие крови и центрифугирование. Взятие крови проводили из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Dickinson and Company, США). В
качестве стабилизатора венозной крови использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1.
Все тесты проводили на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 100g в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 300g в течение 15 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (Россия).
Агрегация тромбоцитов. Исследование влияния новых производных ксантина и препаратов сравнения на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro на крови человека осуществляли с помощью лазерного анализатора агрегации тромбоцитов "Биола 230LA" (г. Москва, Россия) [4]. В качестве индуктора агрегации использовали коллаген в концентрации 5 мг/мл производства "Технология-Стандарт" (г. Барнаул, Россия). Определение активности исследуемых производных проводили в концентрации 2*10~3 М/л. При анализе агрегатограмм обращали внимание на спонтанную агрегацию тромбоцитов, вызванную введением исследуемого вещества в плазму, рассчитывали степень подавления или усиления агрегации под действием производных ксантина, оценивали дезагрегационный эффект соединений.
Исследование влияния на коагуляционный компонент гемостаза. Исследование влияния на коагуляционный компонент гемостаза впервые синтезированных соединений и гепарина натрия проводили общепризнанными клоттинго-выми тестами на турбидиметрическом гемокоа-гулометре Solar CGL 2110 (ЗАО "СОЛАР", Беларусь). Изучались показатели активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени (ПВ) и концентрации фибриногена по A.Clauss [3]. Определение антикоагуляционной активности исследуемых веществ проводили в концентрации 10-3 г/мл. В работе использовались реактивы производства "Технология-Стандарт" (г. Барнаул, Россия).
Тромбоэластография. Тромбоэластографию проводили на аппарате TEG 5000 (Haemoscope Corporation, США). При анализе тромбоэласто-грамм определяли общую тенденцию коагуляции (R, CI, TMA, TPI), функциональную активность тромбоцитов и фибриногена (МА, Angle), активность фибринолиза (CLT, CL30, LY30) и
физико-механические свойства образовавшихся сгустков (E, G) [5]. В качестве активатора ТЭГ использовали 0,2 М р-р CaCh ("Технология-Стандарт", Россия).
Препараты сравнения. В качестве препаратов сравнения, согласно [3] из принципа химического подобия и установленной высокой биологической активности, в экспериментах использовали пентоксифиллин (раствор для инъекций 20 мг/мл-5 мл, ОАО "Борисовский завод медицинских препаратов" (Беларусь, г. Борисов), серия N 290715, годен до: 08.2018, произведено: 07.2015), кофеин-бензоат натрия (раствор для инъекций 200 мг/мл-1 мл, ОАО "Борисовский завод медицинских препаратов" (Беларусь, г. Борисов), серия N 040609, годен до: 08.2017, произведено: 04.06.2015), эуфиллин (раствор для внутривенного введения 24 мг/мл-10 мл, ОАО "Новосибхимфарм" (Россия, г. Новосибирск), серия N 10416, годен до: 05.2019, произведено: 01.04.2016), ацетилсалициловую кислоту (Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фар-масьютикал Ко., ЛТД, Китай, серия N 10Е16, годен до: 04.2017, произведено: 10.11.2015), этам-зилат (раствор для внутривенного и внутримышечного введения 125 мг/мл- 2 мл, ООО "Ал-вилс" (Россия, г. Москва), серия N 150814, годен до: 08.2018), гепарин натрия (раствор для инъекций 5000 МЕ/мл - 5 мл, ОАО «Синтез» (Россия, г. Курган), серия N 4602565003868, годен до: 11.2019, произведено: 31.10.2015)
Обработка результатов. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Выявлено, что вид распределения полученных данных отличается от нормального, поэтому при дальнейшей работе использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы, 25 и 75 про-центилей. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение. Результаты исследования влияния новых производных ксан-тина на адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние впервые синтезированных производных ксантина и препаратов сравнения на показатели функциональной активности тромбоцитов, п=7.
№ Шифр Изменение максимальной агрегации тромбоцитов, % к контролю Изменение АПТВ, % к контролю
1 I + |5,8 (4,7-6,9)| - 11,4 (1,1-2,4)|
2 II 8,5 (7,1-9,3)* 8,7 (7,5-10,1)
3 III 3,9 (3,2-4,8)* 3,2 (2,7-4,5)
4 IV 6,7 (6,1-8,2)* 6,3 (5,4-7,2)
5 V 5,4 (4,1-7,6) 1,7 (1,1-3,5)
6 Эуфиллин 2,5 (0,8-4,2) -
7 Кофеин-бензоат натрия 5,3 (3,9-7,2) -
8 Аспирин 0,0 (0,0-0,0) -
9 Пентоксифиллин 0,0 (0,0-0,0) -
10 Этамзилат + |4,3 (2,2-6,9)| -
11 Гепарин натрия - 54,7 (47,7-60,2)
Примечание: данные представлены Ме (25-75). + \Ме (25-75)1 - агрегация тромбоцитов усиливается, - \Ме (25-75)1 - время АПТВ сокращается. * - уровень статистической значимости различий в сравнении с кофеин-
соединений и препаратов сравнения не регистрировалась.
Соединения показали различной степени выраженности влияние на плазменный компонент гемостаза, проявляющееся изменением показателя внутреннего пути свертывания крови -АПТВ. На показатели концентрации фибриногена и ПВ исследуемые вещества и гепарин натрия влияния не оказывали. Синтезированные производные ксантина по уровню антикоагуля-ционной активности уступали препарату сравнения - гепарину натрия. Максимальное удлинение времени свертывания плазмы в тесте АПТВ не превышала 10% для исследуемых соединений. Следует отметить, что соединение под шифром I проявило прокоагуляционный эффект, ускоряя время выпадения первых нитей фибрина в кло-тинговых тестах. Сочетание проагрегантной и прокоагуляционной активности может свидетельствовать о потенциально высоком системном гемостатическом эффекте.
Следующим этапом определили влияние соединения I на систему гемостаза методом тром-боэластографии, позволяющим оценить систему
бензоат натриемр<0,05, п-частота наблюдений.
По результатам проведенного исследования установлено, что ацетилсалициловая кислота и пентоксифиллин не оказывают влияния на агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном. Среди лекарственных препаратов группы ксантина наибольшая активность регистрировалась у кофеин-бензоат натрия. При предварительной инкубации кофеин-бензоат натрия в обогащенной тромбоцитами плазме в течение 3 минут, происходило снижение коллаген-индуци-рованной агрегации в среднем лишь на 5,3% относительно контроля. Синтезированные соединения показали различной степени выраженности антиагрегационную активность, превышающую показатели пентоксифиллина и ацетилсалициловой кислоты. Соединения под лабораторными шифрами II и IV проявили антиагрегаци-онную активность, превосходящую значение ко-феин-бензоат натрия. Соединение под шифром I проявило проагрегантный эффект, усиливая агрегацию тромбоцитов в среднем на 5,8%, что соответствует значениям этамзилата (р>0,05). Дез-агрегационная активность у экспериментальных
гемостаза в комплексе по основным ключевым звеньям. По результатам исследования установлено, что соединение I проявляет гемостатиче-ские свойства (таблица 2). Принципиальным в
данном случае является изменение показателя активности тромбоцитов (МА) на фоне нормального количества тромбоцитов и фибриногена.
Таблица 2
Показатели тромбоэластографии при действии соединения I.
Показатель Контроль, n=7 Соединение I, n=7 p
SP, мин 10,3 (7,5-12,3) 8,2 (7,1-10,6) 0,01
R, мин 11,6 (9,7-13,2) 9,4 (8,7-10,1) 0,03
Angle, град 43,7 (42,4-44,3) 56,4 (49,2-61,1) 0,005
MA, мм 55,9 (51,2-57,8) 67,2 (63,8-74,5) 0,001
TMA, мин 35,4 (32,4-38,5) 24,1 (21,8-31,5) 0,005
G, дин/см2 6,3 (5,7-6,4) 8,9 (8,1-9,4) 0,006
E, дин/см2 127,3 (115,4-142,3) 134,8 (132,1-142,5) 0,001
TPI, /сек 15,1 (13,2-17,1) 17,1 (15,6-18,1) 0,001
CL30, % 97,5 (91,3-99,5) 96,5 (94,8-99,4) 0,6
LY30, % 0,6 (0,2-0,9) 0,0 (0,0-0,0) 0,4
CLT, мин 36,9 (32,4-38,3) 36,1 (34,2-38,6) 0,5
CI, 0,6 (0,3-1,3) 2,4 (1,9-3,1) 0,001
Примечание: данные представлены Ме (25-75). p- уровень статистической значимости различий признаков
группы соединения I в сравнении с контролем. n - количество проб.
т-г л (1 т Результаты проведенного исследования свиде-
Показатель МА в присутствии соединения I J Г
увеличен на 20,2% (p=0,001) по сравнению с контролем. Это приводит к статистически значимому увеличению общего коагуляционного потенциала в сторону гиперкоагуляции - показатель TMA сократился на 31,9% (p=0,005), а TPI увеличился на 13,2% (p=0,001) в сравнении с контролем. Увеличиваются значения прочности сгустка - показатель E и G возрастают в группе соединения I в 1,3 раза по сравнению с контролем. Показатели, ответственные за систему фиб-ринолиза (CLT, CL30, LY30), остаются на уровне контрольных значений. Таким образом, методом тромбоэластография подтверждается системный гемостатический эффект нового соединения I.
Заключение. Среди впервые синтезированных производных ксантина найдены соединения, превосходящие по антиагрегационной активности ряд применяемых в настоящее время препаратов, и обнаружено соединение, проявляющее проагрегантную и прокоагулянтную активность.
тельствует о перспективности дальнейшего поиска потенциальных корректоров системы гемостаза в ряду производных 7-тиетанил-3-про-пилксантина.
ЛИТЕРАТУРА.
1. Samorodov A., Kamilov F., Timirkhanova G., Antithrombotic activity of new 1-ethylxanthine cyclohex-ylammonium salt // FASEB J. 2014. Vol. 28. 1054.5.
2. Халиуллин Ф.А. Тиираны в синтезе биологически активных производных ксантина и бензимидазола // Дис. д-ра фарм. наук. Уфа. 1998. 428 с.
3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. -М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
4. Вот G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. 1962. ^l. 194. Р. 927-929.
5. Cotton B.A., Faz G., Hatch Q.M. Rapid thrombelas-tography delivers real-time results that predict transfusion within 1 hour of admission // J. Trauma. 2011. Vol. 71. № 2. P. 407-414.
THE RESULTS OF SCREENING OF NEW SALTS OF 7-THIETHANIL-3-PROPYL-XANTHINE DERIVATIVES ON THE HEMOSTASIS SYSTEM UNDER CONDITIONS IN VITRO.
Urakov1 A.L., Samorodov2A. V., Kamilov2 F.Kh., Khalimov2A.R., Timirkhanova2 G.A., Khaliullin2 F.A.
'Izhevsk State Medical Academy, Izhevsk, Russia. 2Bashkir State Medical University, Ufa, Russia.
Annotation: We have studied the influence of 5 firstly sythesized derivatives of 7-thietanil-3-propylxanthine and medically applied therapeutic agents on the hemostasis system under conditions in vitro with donated human blood. The impact of firstly synthesized derivatives of 7-thietanil-3-propylxanthine on the functional activity of platelets under conditions in vitro was studied with the help of a laser analyzer of platelet aggregation Biola 230 LA (Russia) and thromboelas-tography (TEG 5000, Haemoscope Corporation, USA). We have difined different influence of the studied compounds on functional activity of platelets. The compounds under lab I-code shows haemostatic activity, which exceeds levelwise a number of therapeutical agents. The findings prove that it is neccessary and up-to-date to continue research of this number of derivatives influencing the hemostasis system as potential antiplatelets and haemostatic agents.
Key words: hemostasis sistem, thietan-containing xanthine derivative, antiaggregation, haemostatic activity.
REFERENCES
1. Samorodov A., Kamilov F., Timirkhanova G., Antithrombotic activity of new 1-ethylxanthine cyclohex-ylammonium salt // FASEB J. 2014. Vol. 28. 1054.5.
2. Haliullin F.A. Tiirany v sinteze biologicheski ak-tivnyh proizvodnyh ksantina i benzimidazola // Dis. d-ra farm. nauk. Ufa. 1998. 428 s.
3. Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih issle-dovanij lekarstvennyh sredstv. Chast' pervaja. - M.: Grif i K, 2012. - 944 s.
4. Born G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. 1962. Vol. 194. P. 927-929.
5. Cotton B.A., Faz G., Hatch Q.M. Rapid thrombelas-tography delivers real-time results that predict transfusion within 1 hour of admission // J. Trauma. 2011. Vol. 71. № 2. P. 407-414.
