CC BY
32
С.А. Борзенок \ A.B. Васильев а, A.B. Шипунова 1,
Э.Б. Дашинимаев а, Ю.А. Комах 1, Е.В. Ковшун 1 Результаты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием аутофибробластов кожи реципиента
1 ФГУ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Москва, Россия
2 НИИ Биологии развития им. НК. Кольцова РАН,
Москва, Россия
S.A. Borzenok, A.V. Vasiliev, A.V. Shipunova, E.B. Dashinimaev, Yu.A. Komakh, E.V. Kovshun
The results of engineering a biokeratoprosthetic complex with a recipient skin autofibroblasts
В настоящее время единственным эффективным методом восстановления зрения пациентам с тяжелыми осложненными бельмами является кератопро-тезирование. Однако риск отторжения кератопротезов остается очень высоким (до 75% и более) в связи с керато-маляцией иммуновоспалительного генеза. Распространенным подходом в инжиниринге тканей является создание биопротезов, содержащих аллогенные фибробласты в комбинации с полимерными матрицами, интегрированными в организм реципиента. По нашему мнению, использование аутофибробластов для конструирования биокератопротезного комплекса является более перспективным направлением с точки зрения профилактики развития посттрансплантацион-ных реакций.
Цель исследования: разработка технологии изготовления конструкции биокератопротезного комплекса на основе аллогенного роговичного матрикса и прокультивированных аутофибробластов кожи реципиента для лечения осложненных бельм.
Материал и методы. В эксперименте in vitro использовались кадаверные роговицы человека, модифицированные рибофлавином и ультрафиолетовым облучением для увеличения прочностных свойств коллагеновых волокон. В качестве клеточных элементов биокератопротезного комплекса применялись выделенные и прокультивированные аутофибробласты кожи человека на коллагеновых микроносителях. Исследования проводились с использованием культуральных, морфологических и иммуноцитохимических методов исследований.
Результаты и обсуждение. Полученная конструкция биокератопротезного комплекса состоит из фотохимически стабилизированной роговицы, в интрастро-мальный карман которой введены титановая опорная пластина кератопротеза модели Федорова-Зуева и аутофибробласты, прокультивированные на коллагеновых микроносителях.
Фотохимически модифицированная донорская ал-логенная роговица является естественной биологической матрицей для аутофибробластов реципиентов. Ее стромальный каркас имеет параллельные коллагеновые пластины с межпластинчатыми щелями, что способствует оптимальной инвазии пролиферирующих фибробластов.
Пролиферация и миграция фибробластов в интра-стромальном кармане способствовала образованию фибриллярного синцития и интеграции коллагена микроносителей в строму роговицы. Далее отмечалась выраженная адгезия аутофибробластов к опорной титановой пластине кератопротеза с формированием на ее поверхности клеточного монослоя.
Результаты конструирования биокератопротезного комплекса в эксперименте in vitro позволяют считать предложенную конструкцию пригодной для проведения дальнейших экспериментов in vivo.
С.А. Борзенок 1, H.A. Онищенко а, ХД. Тонаева 1, М.Е.Крашенинников а, Ю.А. Комах 1, Е.В. Ковшун 1 Лимбальные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки: способ выделения и органного культивирования
1 ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова», Москва, Россия
2 ФГУ «ФНЦ трансплантологии и ИО
им. акад. В.И. Шумакова», Москва, Россия
S.A. Borzenok, N.A. Onishchenko, Kh.D. Tonaeva,
M.E. Krasheninnikov, Yu.A. Komakh, E.V. Kovshun Limbal multipotent mesenchymal stromal cells: a method of isolation and organ culturing
В связи с ростом числа повторных пересадок и малой эффективностью медикаментозных средств посттрансплантационной иммуносупрессии в настоящее время пристальное внимание стало уделяться свойствам мезенхимальных/прогениторных стволовых клеток (мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток) (МПСК), способных формировать иммунную толерантность при их сотрансплантации с донорским органом. Это положение актуально и для офтальмологии, так как в связи с развитием «болезни трансплантата роговицы» у пациентов, входящих в группу «кератопластики высокого риска», доля повторных пересадок достаточно высока и составляет 25^37%. Также известно, что в лимбальной зоне глаза локализуются клетки, обладающие фенотипом МПСК, которые могут быть объектом выбора для сотрансплантации с донорской роговицей в качестве клеточных индукторов локальной иммуносупрессии.
Цель исследования: разработка технологии выделения и культивирования аллогенных лимбальных мезенхимальных МПСК человека для сотрансплантации с донорской роговицей при кератопластике высокого риска.
Материал и методы. Из глаз трупов-доноров роговиц с помощью микрохирургической техники из пери-лимбальной зоны получали тканевые лоскуты с поли-садами Фогта размером 0,5x1,0x3,0 мм. Выделение и культивирование осуществлялось согласно отработанному нами протоколу: тканевые лоскуты подвергались обработке 0,03% коллагеназой II типа в течение 4 ч при +4°С, затем в течение 15 мин. — диспазой II при +37°С; далее культивирование осуществлялось с использованием стандартных питательных сред DMEM/F-12, содержащих ряд ростовых факторов. В работе применялись гистологические, иммуноцито-химические, морфометрические методы.
Результаты и обсуждение. В процессе органного культивирования лимбальных лоскутов в течение 6 нед. наблюдалось митотическое деление МПСК в межфиб-риллярных пространствах с сохранением стволовости молодых клеток, определяемой цитологическими и им-муноцитохимическими методами. Причем прирост МПСК в прокультивированных тканевых лоскутах, определяемый методом темнопольной статистической морфометрии, был значительным и достаточным для сотрансплантации реципиентам при кератопластике высокого риска. Для суждения об их супрессивной
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010
