CC BY
48
С.А. Борзенок \ A.B. Васильев а, A.B. Шипунова 1,
Э.Б. Дашинимаев а, Ю.А. Комах 1, Е.В. Ковшун 1 Результаты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием аутофибробластов кожи реципиента
1 ФГУ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Москва, Россия
2 НИИ Биологии развития им. НК. Кольцова РАН,
Москва, Россия
S.A. Borzenok, A.V. Vasiliev, A.V. Shipunova, E.B. Dashinimaev, Yu.A. Komakh, E.V. Kovshun
The results of engineering a biokeratoprosthetic complex with a recipient skin autofibroblasts
В настоящее время единственным эффективным методом восстановления зрения пациентам с тяжелыми осложненными бельмами является кератопро-тезирование. Однако риск отторжения кератопротезов остается очень высоким (до 75% и более) в связи с керато-маляцией иммуновоспалительного генеза. Распространенным подходом в инжиниринге тканей является создание биопротезов, содержащих аллогенные фибробласты в комбинации с полимерными матрицами, интегрированными в организм реципиента. По нашему мнению, использование аутофибробластов для конструирования биокератопротезного комплекса является более перспективным направлением с точки зрения профилактики развития посттрансплантацион-ных реакций.
Цель исследования: разработка технологии изготовления конструкции биокератопротезного комплекса на основе аллогенного роговичного матрикса и прокультивированных аутофибробластов кожи реципиента для лечения осложненных бельм.
Материал и методы. В эксперименте in vitro использовались кадаверные роговицы человека, модифицированные рибофлавином и ультрафиолетовым облучением для увеличения прочностных свойств коллагеновых волокон. В качестве клеточных элементов биокератопротезного комплекса применялись выделенные и прокультивированные аутофибробласты кожи человека на коллагеновых микроносителях. Исследования проводились с использованием культуральных, морфологических и иммуноцитохимических методов исследований.
Результаты и обсуждение. Полученная конструкция биокератопротезного комплекса состоит из фотохимически стабилизированной роговицы, в интрастро-мальный карман которой введены титановая опорная пластина кератопротеза модели Федорова-Зуева и аутофибробласты, прокультивированные на коллагеновых микроносителях.
Фотохимически модифицированная донорская ал-логенная роговица является естественной биологической матрицей для аутофибробластов реципиентов. Ее стромальный каркас имеет параллельные коллагеновые пластины с межпластинчатыми щелями, что способствует оптимальной инвазии пролиферирующих фибробластов.
Пролиферация и миграция фибробластов в интра-стромальном кармане способствовала образованию фибриллярного синцития и интеграции коллагена микроносителей в строму роговицы. Далее отмечалась выраженная адгезия аутофибробластов к опорной титановой пластине кератопротеза с формированием на ее поверхности клеточного монослоя.
Результаты конструирования биокератопротезного комплекса в эксперименте in vitro позволяют считать предложенную конструкцию пригодной для проведения дальнейших экспериментов in vivo.
С.А. Борзенок 1, H.A. Онищенко а, ХД. Тонаева 1, М.Е.Крашенинников а, Ю.А. Комах 1, Е.В. Ковшун 1 Лимбальные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки: способ выделения и органного культивирования
1 ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова», Москва, Россия
2 ФГУ «ФНЦ трансплантологии и ИО
им. акад. В.И. Шумакова», Москва, Россия
S.A. Borzenok, N.A. Onishchenko, Kh.D. Tonaeva,
M.E. Krasheninnikov, Yu.A. Komakh, E.V. Kovshun Limbal multipotent mesenchymal stromal cells: a method of isolation and organ culturing
В связи с ростом числа повторных пересадок и малой эффективностью медикаментозных средств посттрансплантационной иммуносупрессии в настоящее время пристальное внимание стало уделяться свойствам мезенхимальных/прогениторных стволовых клеток (мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток) (МПСК), способных формировать иммунную толерантность при их сотрансплантации с донорским органом. Это положение актуально и для офтальмологии, так как в связи с развитием «болезни трансплантата роговицы» у пациентов, входящих в группу «кератопластики высокого риска», доля повторных пересадок достаточно высока и составляет 25^37%. Также известно, что в лимбальной зоне глаза локализуются клетки, обладающие фенотипом МПСК, которые могут быть объектом выбора для сотрансплантации с донорской роговицей в качестве клеточных индукторов локальной иммуносупрессии.
Цель исследования: разработка технологии выделения и культивирования аллогенных лимбальных мезенхимальных МПСК человека для сотрансплантации с донорской роговицей при кератопластике высокого риска.
Материал и методы. Из глаз трупов-доноров роговиц с помощью микрохирургической техники из пери-лимбальной зоны получали тканевые лоскуты с поли-садами Фогта размером 0,5x1,0x3,0 мм. Выделение и культивирование осуществлялось согласно отработанному нами протоколу: тканевые лоскуты подвергались обработке 0,03% коллагеназой II типа в течение 4 ч при +4°С, затем в течение 15 мин. — диспазой II при +37°С; далее культивирование осуществлялось с использованием стандартных питательных сред DMEM/F-12, содержащих ряд ростовых факторов. В работе применялись гистологические, иммуноцито-химические, морфометрические методы.
Результаты и обсуждение. В процессе органного культивирования лимбальных лоскутов в течение 6 нед. наблюдалось митотическое деление МПСК в межфиб-риллярных пространствах с сохранением стволовости молодых клеток, определяемой цитологическими и им-муноцитохимическими методами. Причем прирост МПСК в прокультивированных тканевых лоскутах, определяемый методом темнопольной статистической морфометрии, был значительным и достаточным для сотрансплантации реципиентам при кератопластике высокого риска. Для суждения об их супрессивной
функциональной активности в настоящее время нами проводятся исследования цитокинового статуса in vitro.
Таким образом, определены оптимальный режим и номинальный срок (6 нед.) культивирования МПСК по разработанному протоколу для сотрансплантации с донорской роговицей человека при кератопластике высокого риска.
A.Г. Борисов, A.A. Савченко, Ю.Е. Мальчевский,
B.А. Козлов, Е.Р. Черных, С.В. Смирнова,
A.A. Останин
Применение внутривенного введения аутогенных мультипотентных мезенхимальных строальных клеток, полученных из жировой ткани
НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН,
Красноярск, Россия
НИИ клинической иммунологии СО РАМ,
Новосибирск, Россия
A.G. Borisov, A.A. Savchenko, Yu.E. Malchevsky, V.A. Kozlov,
E.P. Chernykh, S.V. Smirnova, A.A. Ostanin Using intravenous introduction of autologous multipotent mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue
Применение стволовых клеток, которые способны усиливать собственную регенеративную деятельность организма, в лечении различных заболеваний привлекает наибольшее внимание. Актуальным является выбор источника получения стволовых клеток. Известно, что потенциал эмбриональных стволовых клеток очень высок, они могут давать начало практически всем типам клеток организма и характеризуются высокой пролиферативной активностью. Однако, использование клеток, выделяемых из человеческого эмбриона, связано со многими проблемами. Поэтому в настоящее время все большее внимание уделяется аутогенным стволовым клеткам (АСК). Чаще всего стволовые клетки получают из костного мозга. Менее травматично получать стволовые клетки из периферической крови и жировой ткани. В связи с этим, целью исследования явилась оценка изменений клинических и лабораторных показателей после внутривенного введения АСК, полученных из жировой ткани.
Материал и методы. Аутогенные стволовые клетки (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки) были выделены стандартно с помощью обработки жировой ткани коллагеназой. Трансплантация АСК проведена четырем добровольцам мужского пола в возрасте от 44 до 65 лет после получения от них информированного согласия. Общеклинические анализы и инструментальные исследования проведены до введения АСК, а также через 10 сут., 1, 6 и 12 мес. после внутривенной трансплантации.
Результаты. Трансплантация АСК не сопровождалась развитием каких-либо побочных реакций. Субъективно все обследуемые уже на второй день после введения отмечали улучшение общего самочувствия, повышение работоспособности. В динамике обследования ухудшения самочувствия ни через месяц, ни через год не выявлено.
Через месяц после введения АСК у всех обследуемых наблюдалось увеличение активности аланинамино-трансферазы и содержание сиаловых кислот с последующим снижением значений до исходных показателей через полгода.
Со стороны иммунной системы, наиболее выраженные изменения исследуемых показателей обнаружены через 1 мес. после введения АСК. Так, у одного пациента через 1 мес. после трансплантации АСК обнаружено снижение содержания лимфоцитов и С04+-клеток с последующим восстановлением их количества до исходного уровня через 6 мес. Кроме того, через 1 мес. после трансплантации у этого же пациента повысилось количество С08+- и С019+-лим-фоцитов, а также концентрация 1дА и 1дО. Причем повышенный уровень концентрации !д0 сохраняется и через 6 мес. после введения АСК, что также совпадает с высоким содержанием ЦИК. Значения всех исследуемых иммунологических показателей нормализовались через год.
При обследовании у второго пациента обнаружено, что через 1 мес. после трансплантации АСК понижается содержание С04+-лимфоцитов и повышается количество С08+-клеток, соответственно со значительным снижением величины дифференцировочного индекса. Через 6 мес. содержание регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови нормализуется, но при повышении величины дифференцировочного индекса относительно исходного уровня. Кроме того, у обследуемого пациента через 1 мес. после внутривенного введения АСК повышается количество С019+-лимфоцитов и снижается уровень С016/56+-клеток. Причем, если через 6 мес. количество С019+-клеток нормализуется, то содержание С016/56+-лимфоцитов остается пониженным относительно исходного уровня на 24,1%. Значительные изменения выявляются со стороны показателей гуморального звена иммунной системы. Так, через 1 мес. после трансплантации АСК повышается концентрация 1дМ в сыворотке крови, с последующим увеличением данного класса иммуноглобулина через 6 мес. В этот же период более чем в 2,5 раза снизилась концентрация 1дА. Содержание ЦИК в сыворотке крови у пациента через 1 мес. после внутривенного введения АСК снижается, но уровень нормализуется через 6 мес.
Наибольший интерес вызвали изменения со стороны сердечно-сосудистой системы, выявленные при ультразвуковых исследованиях. Так, у всех обследуемых к 6 мес. уменьшилась масса миокарда. Также при дуплексном сканировании установлено увеличение скорости кровотока нижних конечностей (от 29% до 95%), особенно выражены эти изменения на мелких сосудах. Аналогичные показатели остаются при УЗ исследовании и через год.
Выводы. Таким образом, после внутривенного введения АСК выявляется динамическая перестройка иммунной системы, выражающаяся в изменениях величин показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Наиболее выраженные изменения исследуемых величин показателей иммунного статуса выявляются через 1 мес. после трансплантации АСК. Через 6 мес. — большинство параметров иммунного статуса нормализуется до исходного уровня. У обследуемых пациентов направленность и уровень изменения величин показателей иммунного статуса не совпадает, что определяется исходным состоянием самого иммунитета и, вероятно, разным уровнем реактивности регуляторных гомеостатических систем. Также выявляется изменение величин ряда общеклинических показателей, характеризующих процессы состояние сердечно-сосудистой системы (уменьшение массы миокарда и усиления скорости кровотока).
