CC BY
65
Тезисы
Материалы Международного симпозиума «Актуальные вопросы донорского и персонального хранения стволовых клеток»
27 сентября 2009 г., Москва
21 сентября в Москве, в отеле «Ренессанс» Институт Стволовых Клеток Человека (Гемабанк) и Межрегиональная общественная организация специалистов по клеточным технологиям и регенеративной медицине проводят симпозиум «Актуальные вопросы донорского и персонального хранения стволовых клеток». Такой форум организуется уже в третий раз, на него приглашены представители всех российских банков, а также специалисты, работающие в области клеточных технологий, из Германии, Украины, Белоруссии, Казахстана. Во время работы симпозиума будут рассмотрены методические аспекты деятельности банков стволовых клеток (СК) и практическое применение СК, в частности пра-
вовые аспекты, для рассмотрения которых приглашены специалисты из Росздравнадзора. Одной из главных целей симпозиума является приближение работы банков и лабораторий в России и СНГ к единым международным стандартам. Для того, чтобы познакомиться с тем, как работают банки в Европе, приглашены Петер Вернет, основатель и первый президент ЫеЬсогс) — Европейской сети донорских банков стволовых гемопоэти-ческих клеток и Хольгер Грессманн, 1Т-эксперт ЫеЬсогс), которые познакомят с международными стандартами работы банков и с современными возможностями быстрого и эффективного подбора доноров на примере работы банков ЫеЬсогс).
С.А. Борзенок1, Х.Д. Тонаева1, H.A. Онищенко2,
М.Е. Крашенинников2, Ю.А. Комах1, ОМ Ролик1
Возможности применения культивированных лимбальных стволовых/прогениторных клеток с иммуносупрессивными свойствами при кератопластике высокого риска
1ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Москва 2 ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова», Москва
Среди пациентов с хирургической патологией роговицы синдромы иммунокомпрометированности обнаруживаются более чем у 80% больных, входящих в группу высокого риска по отторжению роговичного трансплантата. Локальное применение иммуносупрессивной химиотерапии ограничено целым рядом причин. Феномен иммуносупрессии стволовыми/прогениторными клетками (СК) обусловлен низкой экспрессией антигенов гистосовместимости и наличием на их поверхности неклассического антигена HLA-G, который экспрессируется только в условиях культивирования ex vivo, а также их способностью оптимизировать цитокиновый статус в клеточном микроокружении после трансплантации. СК способны вызывать ряд биологических эффектов на тканевом уровне (метаболическая регуляция, иммунная модуляция) и позитивно влиять на результаты приживления аллогенных донорских тканей при их сотранспланта-ции. В литературе имеются единичные публикации о применении в клинике совместной пересадки донорских роговиц человека и аллогенных лимбальных стволовых клеток после их предварительного культивирования. Технология выделения и культивирования аллогенных лимбальных клеток от доноров-трупов и верификация их иммуносупрессивных свойств для клинического применения не разработаны.
Нами проводятся доклинические исследования по оптимизации выделения и культивирования лимбальных стволовых клеток, способов кокультивирования их с мезенхимальными прогениторными клетками донора и/или реципиента для создания микроокружения, способствующего ингибированию спонтанной дифференциров-ки и развитию иммунной толерантности. В клинических исследованиях будет дан анализ сотрансплантации лимбальных стволовых/прогениторных клеток с иммуносупрессивными свойствами при кератопластике высокого риска.
С.Е. Волчков1* , О.В. Тюмина1, А.Н. Тороповский1,
Л.М. Трусова1, П.В. Борискин1, Л.Т. Волова2
Оценка мезенхимально-стромальных клеток
из различных источников
1 ГУЗСО «Клинический центр клеточных технологий»,
Самара
2 Институт экспериментальной медицины и биотехнологий при Г0УВГ10 «Самарский государственный медицинский университет Росздрава», Самара
Цель: провести сравнительную оценку адгезивной фракции клеток костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани.
Материал и методы. Биологический материал получали после подписания пациентом информированного согласия. Обработано 15 образцов костного мозга (КМ), 28 образцов пуповинной крови (ПК), 5 образцов жировой ткани (ЖТ). Подсчет, определение жизнеспособности клеток и скорости удвоения проводили на клеточном анализаторе \ЛСеН ХВ, иммунофенотип — фенотип на проточном цитометре ГАСБСапШ. Жировую, хрящевую и костную дифференцировку клеток проводили на ком-
e-mail: quality@cordbank.ru, bioen@mail.ru
Тезисы
D
мерческих средах NH Adipodiff, NH Chondrodiff, NH Osteodiff, с оценкой гистохимическим и иммуногисто-химическим методами. Цитокины определяли по технологии Х-МАР на проточном флуориметре Luminex Х100. Культивирование на бионосителях проводили в стандартных условиях, с оценкой на электронном микроскопе Quanta inspect S.
Результаты. Доля получения колоний костного мозга (п=15) и жировой ткани (п=5) — 100%, клетки пуповинной крови образуют колонии только в 14,2% случаев (п = 28). Экспрессия поверхностных антигенов была схожей у КМ и ПК в течение 20 удвоений. В ходе культивирования мы констатировали нарастание размеров клеток и уменьшение скорости удвоения культуры с увеличением времени культивирования. Исходя из морфологических и данных пролиферативной активности, мы разделили клетки на три типа: крупные, средние, мелкие. Дальнейшее исследование показало, что скорость удвоения культуры зависит в основном от мелких клеток и их количества. В настоящее время получены данные об успешной дифференцировке клеток костного мозга и пуповинной крови в жир, кость и хрящ. Клетки всех трех источников успешно заселяли бионосители и образовывали смешанный трансплантат.
Заключение. В ходе работы показана перспективность использования жировой ткани как альтернативного источника стромальных клеток, в то же время пуповинную кровь в качестве альтернативного источника использовать не целесообразно, так как вероятность получения колоний остается низкой.
Д.Д. Генкин, М.Ю. Васильев
Перспективы клинического применения
препаратов на основе аллогенных стволовых
клеток
ЗАО «Крионикс», Санкт-Петербург
В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что аллогенные стволовые клетки обладают мощным терапевтическим потенциалом при лечении как самых распространенных негематологических и не злокачественных заболеваний (таких как инфакркт миокарда, инсульт, хронический гепатит). Этот потенциал показан в достаточном количестве работ на животных. К настоящему моменту наблюдается переход от экспериментов с животными в область клинических испытаний. Основной интерес представляет клиническое применение препаратов аллогенных стволовых клеток у иммунологически некомпрометированных пациентов. Стандартизация подобных технологий с неизбежностью приводит, и будет приводить в дальнейшем к созданию фармацевтических клеточных препаратов на основе живых аллогенных клеток человека. Такой подход уже находит отражение в регуляторных документах в Европе и США. Накапливаются данные по успешному клиническому применению препаратов аллогенных стволовых клеток в рамках пилотных клинических испытаний при лечении различных негематологических заболеваний. В настоящий момент регуляторными инстанциями одобрены для испытаний I/II фазы (в том числе, например, при лечении инфаркта миокарда) фармацевтические препараты аллогенных стволовых клеток различного происхождения (мезенхимальные, пуповинной крови, костного мозга), Прохимал (Озирис Терапевтике, США), Криоцелл, (Институт гематологии и трансфузиологии, Россия), Мультистем (Атерезис Инк, США) и другие.
B.C. Горностаев1, H.H. Корнилов2, Т.А. Куляба2,
Р.В. Деев3,Т.М. Тихилов2
Использование культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани для пластики дефектов суставного хряща
10ОО «Биолот», Санкт-Петербург
2 РосНИИ Травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена, Санкт-Петербург
3 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
Нами создана методика получения культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани с целью их дальнейшего использования в интересах пациентов артрологического профиля. Алгоритм использования данной популяции клеток для целей клеточной хондропалстики подразумевает реализацию нескольких этапов.
На первом этапе в ходе диагностической артроско-пии у пациента получают фрагмент жировой ткани из жировых складок коленного сустава — объемом не более
1 см3. На следующем этапе в лабораторных условиях из него производят выделение фракции адгезивных к пластику клеток и выполняется их экспансия ex vivo. По достижению двукратного необходимого количества для трансплантации клеток (около 20 млн клеток) производится их иммунофенотипирование по протоколу, рекомендованному международным обществом по изучению стволовых клеток на наличие клеток, несущих маркеры гемопоэтического и мезенхимального ряда. Так же перед трансплантацией выполняется цитогенетическое исследование для исключения приобретения в культуре хромосомных аберраций.
На следующем этапе, в условиях операционной осуществляется артротомия, хирургическая обработка дефекта гиалиновой хрящевой ткани, трансплантация клеток в коммерчески доступном биодеградируемом гелевом носителе в количестве 10 млн, при объеме дефекта около 1 см3, герметизация области трансплантации лоскутом надкостницы, либо резорбируемомой коллагеновой мембраной. После прохождения пациентом этапа медицинской реабилитации выполняются контрольные MPT-исследования и, по показаниям, биопсия из области трансплантации.
Оставшаяся часть клеток подвергается криоконсервированию и хранится в банке в качестве индивидуального запаса до окончания лечения. В дальнейшем, с учетом мультипотентности данной категории клеток, их банки-рование может представлять собой дополнительную услугу персонального хранения.
A.C. Григорян1, Е.Г. Гилерович2, H.H. Павличенко1,
П.В. Кругляков1, И.Б. Соколова1, ДГ. Полынцев1
Влияние внутривенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на посттравматические процессы в головном мозге крыс
1 ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург
2 НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Оценка морфологических изменений в головном мозге после механического повреждения — важный этап исследования возможностей клеточной терапии в коррекции последствий тяжелой черепно-мозговой травмы. Наши эксперименты были проведены на крысах
та
Тезисы
инбредной линии Вистар-Киото. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были выделены из костного мозга животных, культивированы и окрашены флуоресцентным красителем РКН26 in vitro. Травму наносили в левом полушарии головного мозга. Животным из экспериментальной группы ММСК трансплантировали внутривенно на 3 сут. после операции в количестве 5 млн. Анализ результатов проводили через 7, 21 и 42 сут. после нанесения травмы. Анализ распределения ММСК в мозге показал, что при внутривенной трансплантации меченые клетки располагаются непосредственно в области травмы. Судя по клеточному составу инфильтрата, образующегося в травматической полости и прилежащих к ней участках нервной ткани, ММСК ускоряли процесс посттравматического воспаления в мозге. Морфометрический анализ показал, что трансплантация ММСК достоверно снижала количество погибших нейронов в краевой зоне повреждения в первые 7 сут. после нанесения травмы, но на более поздних сроках анализа эта разница нивелировалась. Трансплантация ММСК предотвращала патологическое расширение бокового желудочка травмированного полушария, наблюдавшееся в группе негативного контроля. Предварительно можно заключить, что внутривенная трансплантация ММСК оказывает выраженный положительный эффект на посттравматические репарационные процессы в мозге.
A.C. Григорян1, Р.В. Деев а, П.В. Кругляков1,
И.Б. Соколова1, Д.Г Полынцев1
Влияние аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на репаративные процессы при частичных разрывах связок
1 ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург
2 Военно медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
На сегодняшний день эффективной методики быстрого восстановления функций связок при их частичных или полных разрывах не разработано, в связи с чем актуален поиск новых подходов к активации репаратив-ных процессов в связке при ее повреждении. Одним из таких подходов является клеточная терапия. Наши эксперименты были проведены на беспородных кроликах. Аутогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были выделены из костного мозга животных, культивированы in vitro до третьего пассажа, иммунофенотипированы и использованы для трансплантации. Травма была смоделирована как поперечный надрез собственной связки надколенника на одну треть ее ширины. Было сформировано 3 экспериментальные группы: группа негативного контроля; группа стандартной терапии: животным накладывали на разрыв связки биодеградируемый шов в день операции; группа клеточной терапии: животным накладывали на разрыв связки биодеградируемый шов и гель из коллагена I типа, заселенный аутогенными ММСК, также в день операции. Гистологический анализ результатов проводили через 2 мес. после операции. Было показано, что коллагеновый гель, заселенный аутогенными ММСК, снижает выраженность воспалительного процесса в травмированной области в сравнении с группами контроля и стандартной терапии. Также клеточная терапия предотвращает гиперплазию перитендиния и фиброз, развивающийся в области повреждения; спо-
собствует восстановлению нормальной структуры перитендиния. ММСК способствуют регенерации коллагеновых волокон и препятствуют их некрозу и дистрофическому обызвествлению, характерным для группы негативного контроля и стандартной терапии. Наши данные показывают, что клеточная терапия с помощью аутогенных ММСК может оказывать существенный положительный эффект на репаративные процессы при повреждениях связок. Тем не менее, для более достоверной оценки эффективности данной методики необходимо провести анализ морфофункциональной структуры органа на более поздних сроках.
КС. Десятниченко1, С.Г. Курдюмов1, Е.В. Истранова1,
H.A. Слесаренко2, ИМ Селезнева3
Подходы в разработке матриц
для остеопластических тканеинженерных
технологий
1 НПО «Полистом», Москва
2 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина
3 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
Для возмещения врожденных и приобретенных дефектов костей лицевого и осевого скелета все чаще привлекаются технологии, использующие системы мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) различного происхождения (в том числе — предварительно сохраняемых в банках стволовых клеток) в сочетании с матрицей-носителем — скаффолдом. Выбору последнего, обеспечивающего иммобилизацию ММСК, их адресную доставку, стабильное нахождение в реци-пиентном ложе и остеогенную дифференцировку, отводят важную роль (Р.В. Деев с соавт., 2007).
В НПО «ПОЛИСТОМ» разработан остеопластический материал ИНДОСТ, представляющий собой композицию ортофосфатов кальция в нанодисперсной форме, коллагена I типа и факторов роста ксеногенной костной ткани, обладающий свойствами, которым должен обладать скаффолд: биосовместимсть, биодеградируемость, остеоиндуктивность (К.С. Десятниченко, С.Г. Курдюмов, 2008). Для получения на его основе трехмерной резор-бируемой матрицы, обеспечивающей жизнеспособность ММСК и стимулирующей их пролиферацию и последующую дифференцировку в остеогенные клетки решали ряд задач.
Оптимальные соотношения в координатах биодегради-руемость-механическая прочность достигнуты дополнительным упрочнением коллагеновой основы скаффолда посредством введения межмолекулярных сшивок с последующим тщательным удалением сшивающего реагента, неспецифически сорбирующегося на коллагене. Для оценки результатов такой обработки образцы материалов были выдержаны в дистиллированной воде, физиологическом растворе и культуральной среде ДМЕМ при температуре 20°С. После 12 сут. экспонирования при комнатной температуре во всех использованных в эксперименте водных средах ИНДОСТ-губка и ИНДОСТ-пластины оставались механически стабильными: сохраняли исходную геометрию, восстанавливающуюся после многократного сжатия пинцетом.
Исследования цитотоксичности материалов после дубления проводили с использованием первичной культуры фибробластов человека, которые были выделены из кожно-мышечных тканей эмбриона на сроке 6 нед.
Тезисы
Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров ИСК) и 100 Ед/ мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% С02. Использована культура клеток на 8 пассаже (CD133~, Cd117-, CD45-, CD90+, CD54-, CD62L-, CD62P-, CD9+, CD34-, CD31-, CD71-, CD20-, CD157-, CD106 + , CD62E+). По 100 мкл водной вытяжки из ИНДОСТов помещали в лунки 24-луночного планшета, в которые перед этим на сутки были высеяны клетки (плотность посева 35 тыс./см2, среда ДМЕМ с 10% ЗСК), и добавляли 400 мкл среды ДМЕМ без сыворотки. Для проведения исследования применили стандартный МТТ тест. В качестве контролей при проведении МТТ теста были использованы равные количества физиологического раствора. Результаты испытаний позволили считать, что все образцы исследованных материалов не содержат водорастворимых компонентов, отрицательно влияющих на жизнеспособность клеток, напротив, водная вытяжка из них имеет тенденцию повышения последней.
Исследование адгезии клеток к поверхности остеоп-ластических материалов ИНДОСТ было проведено через 2 часа после посева клеток в среде ДМЕМ без сыворотки. Образцы материалов были помещены в лунки 24-луночного планшета и залиты 500 мкл среды ДМЕМ, клетки высевали на поверхности образцов с плотностью 160 ты с./см2 и культивировали в течение 2 часов. Для визуализации клеток и оценки их жизнеспособности использовали метод окрашивания 0,0002% раствором акридинового оранжевого в фосфатном буфере. Оба материала являются адгезивными для клеток, при этом клетки распластываются на плотной поверхности материала ИНДОСТ-пластина и «проваливаются» в поры губчатого материала ИНДОСТ-губка.
Окислительный стресс, с неизбежностью сопровождающий хирургическое вмешательство, является причиной асептического воспаления, отека, деструкции окружающих имплантат тканей, апоптоза и некроза клеточных элементов — источника последующей репарации. В развитии этих процессов важную роль играют продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), несущие свободные радикалы. Для снижения отрицательных эффектов начальной фазы графтинга, обусловленных образованием ПОЛ, было предпринято использование антиоксидантов в композициях материалов ИНДОСТ. Испытания проведены путем субдермальной имплантации ИНДОСТ-пластины, содержащей антиоксидант (опыт) и без него (контроль) 12 беспородным крысам. Определяли содержание диеновых и триеновых конъюгатов (ДК и ТК), малонового диальдегида (МДА) и оснований Шиффа (ОШ) в полярной и неполярной фазах гексан-изопропанольного экстракта сыворотки крови (И.А. Волчегорский и др., 1989) на 3-и сутки после имплантации. Оказалось, что в опыте общее содержание ПОЛ достоверно ниже, чем в контроле, при меньшей степени окисления липидов: изменения в опыте, главным образом, во фракциях ДК и ТК, в контроле — во фракциях МДА и ОШ. На гистологических препаратах через 2 нед. после операции в опыте существенно менее выражена воспалительная инфильтрация в тканях, окружающих имплантат.
Пригодность ИНДОСТа в качестве матрицы для клеточно-тканевой конструкции была подтверждена в эксперименте по возмещению дефекта нижней челюсти у кроликов (А.И. Воложин и др., 2008). В эксперименте были использованы ММСК из костного мозга человека из криохранилища НИЦ Биомедицинских технологий.
Е.Е. Егоров
Сохранение свойств стволовых и прогениторных клеток человека после их иммортализации с помощью введения гена каталитического компонента теломеразы
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва
С помощью введения гена каталитического компонента теломеразы (ИТЕРТ) был получен ряд культур им-мортальных клеток человека. Эти культуры включают в себя: кожные фибробласты, мезенхимальные стро-мальные клетки костного мозга и жировой ткани, стро-мальные клетки из трепаната губчатой кости, клетки волосяного сосочка и нейральные стволовые клетки. Источником клеток служили ткани взрослого человека, за исключением нейральных стволовых клеток, полученных из фетального материала. Все исходные клетки обладали ограниченной способностью к пролиферации, а после трансфекции приобретали способность к неограниченному росту. Эксперименты с непрерывным культивированием продолжались от полугода до двух лет. После преодоления предела Хейфлика не наблюдали тенденций к замедлению или ускорению роста культур. Для ряда культур было показано появление в клетках теломеразной активности, удлинение теломер, локализация теломеразного белка, сохранение диплоидного кариотипа, сохранение способности переходить в состояние пролиферативного покоя и подверженность клеток контактному торможению пролиферации. Иммортали-зованные клетки сохраняли способности к дифферен-цировкам, присущие исходным клеткам. Иммортализо-ванные нейральные клетки были способны образовывать типичные нейросферы. Таким образом, по всем изученным признакам теломеризованные клетки не отличались от исходных.
При изучении эффективности колониеобразования теломеризованных клеток выяснилось, что это свойство не возрастает после теломеризации. Были подобраны оптимальные условия колониеобразования фибробластов, позволяющие увеличить долю делящихся при разреженном посеве клеток до цифр, характерных для массовой культуры. Таким образом, с помощью теломеризованных клеток было показано, что гетерогенность пролиферативного потенциала фибробластов, определяемая с помощью клонирования отдельных клеток, во многом отражает несовершенство технологии клонирования, а не является внутренним свойством клеток.
При оптимизации условий клонирования было показано, что одним из главных условий, способствующих пролиферации одиночных клеток является снижение парциального давления кислорода. В условиях сниженного кислорода были получены бессмертные теломеризованные клетки, которые при переносе в условия атмосферного кислорода быстро ограничивали свою пролиферацию.
Был проведен протеомный (МАШ 1-ТОР) масс-спектрометрический анализ теломеризованных фибробластов. Обнаружены изменения в содержании 74 белков. Наиболее интересными изменениями являются повышение контроля за конформациями белков, что проявилось в увеличенном количестве различных шаперонов. Также в теломеризованных клетках изменена редокс-регу-ляция: снижено содержание супероксид-дисмутаз 1 и
2 и повышено содержание тиоредоксина и пероксире-доксина 6.
га
Тезисы
A.A. Кулаков1, А.И. Грудянов1, ИМ Степанова1, В.Л. Зорин2 5,
А.И. Зорина35
Использование аутофибробластов при лечении пациентов с рецессиями слизистой оболочки и дефицитом десны в области зубов и зубных имплантатов
1ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий», Москва
2 НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва 3000 «Медико-биологические технологии», Москва
4 ММА им И.М. Сеченова, Москва
5 ООО «Биотехнологическая компания», Москва
Успехи современной эстетической стоматологии во многом определяются научной разработкой и внедрением в практику новых технологий, которые существенно меняют традиционные представления о возможностях лечения.
С сентября 2006г. на базе ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий» совместно с ООО «Медико-биологическая компания» проведены ограниченные клинические исследования по применению аутогенных фибробластов слизистой оболочки рта человека для восстановления утраченных межзубных десневых сосочков и воссоздания достаточного объема десны.
В группу исследования вошли 20 пациентов — добровольцев, из них 16 женщин и 4 мужчин, в возрасте от 20 до 45 лет без выраженной соматической патологии с наличием: тонкого биотипа десны; рецессий десны I-IV класса по Миллеру; наличием «черных треугольников»; ретракцией краевой десны после операции внутрикостной имплантации. Всего обследовано 120 зубов, из них 18 имплантатов и 102 зуба с рецессиями десны, возникшими после лечения хронического пародонтита.
Перед получением биоптата все пациенты проходили стандартное клинико-лабораторное обследование, включающее анализ крови на инфекции. Биопсию слизистой оболочки проводили со стороны преддверья полости рта, твердого неба или ретромолярного пространства, после чего материал поставляли в лабораторию для выделения и культивирования фибробластов. После получения необходимого количества клеток часть из них криоконсервировали для дальнейшего хранения и использования.
Культивированные аутогенные фибробласты слизистой оболочки полости рта человека поставляли в клинику в медицинском термоконтейнере в стерильных пробирках. Клеточный материал вводили в слизистую оболочку десны, прилежащую к шейке зуба и/или в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм в количестве 2^5x108 клеток в 200^400 мкл.
Для интерпретации полученных результатов применяли клинические визуальные, количественные и инструментальные методы исследования.
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
1. Получение исходного материала для последующего выращивания культуры аутофибробластов целесообразно проводить из области бугров верхней челюсти, неба или из преддверия полости рта.
2. Инъекционное введение аутофибробластов способствует увеличению субстрата мягких тканей в месте введения клеток и позволяет уменьшить или устранить рецессию десны, возникшую после проведения паро-донтологического лечения и имплантологических вмешательств.
3. Клинические и функциональные изменения обусловлены не реактивным местным ответом на травму при введении суспензии, а влиянием введенной культуры аутофибробластов. Это подтверждено результатами оптической когерентной томографии: увеличением толщины десны через 2 нед. на 200 мкм, через 2 мес. — на 230 мкм, с 5-го по 9-й месяцы результат оказывался максимальным — 254 мкм. Кроме увеличения толщины слизистой отмечалось формирование более контрастных и упорядоченных слоев слизистой оболочки.
4. Сравнительное изучение клинико-функциональных изменений в тканях десны показало, что нет разницы в клиническом эффекте при введении аутофибробластов в участки с разным исходным состоянием тканевого субстрата и с разными временными интервалами между инъекциями.
Заключение: Полученные результаты клинических, планиметрических и функциональных исследований показали безопасность и эффективность применения аутогенных фибробластов для устранения дефекта мягких тканей после пародонтологических и имплантологических вмешательств.
М.З. Кауламбаева*
Определение оптимальных условий выделения стволовых клеток пуповинной крови для культивирования in vitro
Научно-производственное предприятие «Антиген»,
Казахстан, Алматы
Потери клеточной массы в процессе сепарации, криоконсервирования и размораживания могут приводить к возникновению несостоятельности трансплантата и рецидива основного заболевания при пересадках. Решением данной проблемы может быть оптимизация методов сепарации и культивирование стволовых клеток пуповинной крови (ПК) in vitro.
Сепарацию пуповинной крови проводили общепринятыми методами: разделение в градиенте фиколла, 3% желатина, раствора полиглюкина и обработка лизи-рующим раствором. Оптимальным методом сепарации пуповинной крови является разделение в градиенте фиколла. В этом случае наблюдается больший процент выхода ядросодержащих (ЯСК) (75,35+6,55%) и моно-нуклеарных клеток (МНЮ (66,21+4,55%) и полное осаждение эритроцитов. Сепарация ПК с раствором полиглюкина приводит к значительной потере клеток. Вы-++ Сепарация с 3% раствором желатина имела сходный
+
+
дило полной очистки от эритроцитов. Обработка ПК ли-зирующим раствором приводит к полной очистке суспензии клеток от эритроцитов. Выход составил: ЯСК — ++
При культивировании клеток ПК, очищенных в градиенте фиколла (с=1,077) наблюдали прикрепление большей части клеток в течение 24 ч. и образование монослоя на 8^10 сут. культивирования. Культивирование приводило к получению культур, состоящих из удлиненных клеток с ветвящимися отростками и эпите-лиоподобных клеток.
Культивирование клеток ПК, сепарированных в растворах желатина и полиглюкина, оказалось невозможным
e-mail: marzah61z@mail.ru
Тезисы
из-за присутствия большого количества эритроцитов, которые препятствовали прикреплению и дальнейшему росту ядросодержащих клеток.
Обработка ПК лизирующим раствором приводило к повреждению мембран клеток, что в свою очередь ухудшало прикрепление клеток к подложке. Образование монослоя происходило более медленно — на 12—14 сут. культивирования.
М.З. Кауламбаева
Количественный учет гемопоэтических стволовых клеток в культурах пуповинной крови
Научно-производственное предприятие «Антиген»,
Казахстан, Алматы
Клетки пуповинной крови (ПК) после сепарации в градиенте фикола (р=1,077) культивировали на среде Игла —МЕМ с 20% аутогенной плазмы ПК и 500 ед/см3 лейкемию ингибирующего фактора (LIF) в С02-инкуба-торе. В зависимости от образца ПК клеточный монослой образовывался на 8—12 сут. культивирования.
Для определения процента гемопоэтических клеток в культуре пуповинной крови, нами была проведена проточная цитометрия клеток на маркеры CD 34+, CD 38+ и CD 45+. Фенотипирование пуповинной крови до и после культивирования проводили совместно с сотрудниками лаборатории цитологии Научного центра гинекологии, акушерства и перинатологии РК. Результаты представлены в таблице.
Результаты количественного учета гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после культивирования
Основные параметры Общее КОЛ-ВО клеток хЮ8 Кол-во CD34+ клеток хЮв Кол-во CD38+ клеток хЮ7 Кол-во CD4SC клеток хЮ8
После
сепарации S,6±0,S 1S,8±0,2 9,S±0,S 3,2±0,4
После
культивирования 45,8±2,9 69,7±2,3 41,S±2,S 36,S±2,7
Кратность
экспансии 8,3±1,2 4,40±0,S 4,38±0,6 11,40+0,4
На основании полученных результатов следует сделать вывод о том, что культивирование клеток пуповинной крови на среде Игла —МЕМ с 20% аутогенной плазмы ПК и LIF (500 ед/см3), приводит к увеличению доли гемопоэтических клеток. Кратность экспансии CD 34+ клеток достигает 4,4 раза, CD 38+ в 4,38 раза, наибольшую кратность экспансии достигают CD 45+ клетки в 11,4 раза. Применение метода культивирования in vitro клеток пуповинной крови можно использовать для экспансии стволовых клеток в образце ПК.
K.M. Насадюк
Сравнительная характеристика банкирования
пуповинной крови в украине и польше
Медицинский центр «ГЕМАФОНД»
Киев, Украина
Ценность пуповинной крови уже не ставится специалистами под сомнение, и в последнее десятилетие во всем мире активно создаются и функционируют банки
пуповинной крови, в том числе публичные (из государственного финансирования).
Учитывая «молодость» службы банкирования пуповинной крови в Украине (с 2004 г.), было принято решение изучить ее эволюцию в соседней Польше, беря во внимание как ряд общих для славян психологических факторов, так и сходные этапы экономического развития обеих стран.
Усилиями профессионалов-энтузиастов в Польше в 1996 г. был создан публичный банк пуповинной крови и через 7 лет первый частный, хотя на сегодняшний день в Польше существенно преобладает частное хранение. Следует отметить высокую осведомленность среднестатистического населения Польши о важности сохранения пуповинной крови, а также успехи в клиническом применении — более 10 трансплантаций. В 1994 г. в Польше была выполнена первая трансплантация образца пуповинной крови из публичного банка и в 2007 г. — первая трансплантация образца из частного банка.
Опыт польских коллег в области лабораторной практики и применения пуповинной крови, а также образовательных программ, направленных как на инструктаж медперсонала по качественному сбору пуповинной крови (обеспечение максимальных объемов забираемой крови, снижения количества нестерильных образцов), а также понимание государством огромной медико-социальной важности данного проекта несомненно важен для Украины, а международное сотрудничество позволит выйти на более высокий технологический уровень предоставляемой услуги.
И.С. Никольский, В.В. Никольская
Криоконсервирование и функциональная
активность гемопоэтических клеток
эмбриональной печени
Институт генетической и регенеративной медицины
АМН Украины, Киев
Углубленная оценка эффективности криоконсервирования требует применения функциональных тестов. Криоконсервирование клеток эмбриональной печени человека (КЗП) проводили по модифицированной методике с применением программного замораживателя «Planer» (Великобритания).
Жизнеспособность КЗП по исключению трипаново-го синего после размораживания составляла 85—90%. Количество КОЕ-ГМ до криоконсервирования и после размораживания практически не различалось и составляло соответственно 78,3+16,1/10® и 73,3+11,4/105 (р>0.05).
Радиозащитная активность и индукционность КЗП изучены на мышах линии СВА. На следующий после г-облучения в дозе 9 Гр мышам СВА вводили внутривен-x
9 нед. гестации или эти же клетки, преинкубированные с адгезивными мультипотентными стромальными клетками тимуса мышей (МСКТ).
К 100 сут. доля выживаемости в группах составил: контрольные облученные мыши — 0%, КЗП — 31 %, КЗП, преинкубированные с МСКТ — 37%. Значительно различалась и вычисленная методом линейной регрессии
x
x
x
Таким образом, примененная методика криоконсервирования практически не нарушает функциональной активности КЗП.
Тезисы
□.В. Повещенко1 * , И.И. Ким1, Д.В. Хабаров1,
Е.А. Комбанцев1, А.Б. Романов2, Е.А. Покушалов2,
В.И. Коненков1
Влияние мобилизации на фенотипические и функциональные характеристики клеток у больных ишемической болезнью сердца
1 НИИ Клинической и Экспериментальной лимфологии СО РАМН
Новосибирск
2 НИИ патологии кровообращения
им. акад. Е.Н. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи,
Новосибирск
Цель исследования — иммунофенотипический и функциональный анализ аутогенных мононуклеарных клеток периферической крови до и после мобилизации G-CSF стволовых клеток из костного мозга у больных ишемической болезнью сердца (ИБС).
Мобилизацию клеток проводили больным с диагнозом ИБС с помощью препарата Грасальва, сепарированную кровь после мобилизации получали после цитафере-за на аппарате Hemanetics. Мононуклеарную фракцию выделяли на градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,077). Иммунофенотипирование проводили на проточном цитофлюориметре с использованием моноклональных антител. Функциональные свойства оценивали с помощью МТТ теста и метода ангиогенеза in vitro на Матригеле.
Анализ уровня клеток с фенотипом гемопоэтических стволовых клеток (CD34+CD38+) показал увеличение количества этих клеток в сепарированной крови при мобилизации в среднем в 7,9 раз, что сопровождалось повышением в общем анализе крови лейкоцитов в 5 раз. Количество CD45+, CD14+, CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ клеток значительно не менялось при мобилизации. При проведении МТТ теста было показано, что культура мононуклеарных сепарированных клеток активно реагирует на стимуляцию митогеном, что свидетельствует об их высокой пролиферативной активности. Это также было подтверждено при определении клеточного цикла — количество клеток, находящихся в S/М фазе, составило 10% после мобилизации и 2% до введения G-CSF. Количество апоптотических клеток составило 2%, число CD95+ клеток 0,63%, что говорит о низкой готовности мононуклеарных клеток к апоптозу. При хранении клеток в 0,9% растворе NaCI при 4°С в течение 24 ч., размораживании после хранения в жидком азоте, жизнеспособность составила 97%. Изучение ангиогенеза in vitro показало образование капилляроподобных структур в Матригеле.
Таким образом, в результате исследования было показано, что под действием G-CSF происходит эффективная мобилизация прогениторных клеток из костного мозга в периферическую кровь, что может быть использовано для репарации сердечных тканей и стимуляции ангиогенеза у кардиологических больных.
e-mail: Poveschenkoov@yandex.ru
М.П. Потапнев1* , Н.В. Петёвка1, Н.В. Гончарова1,
И.Н. Северин1, А.В. Шахбазов2, М.В. Волк1, С.М. Космачева1
Пуповинная кровь как источник
гемопоэтических и негемопоэтических стволовых
клеток человека
1 Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии М3 РБ, Минск
2 Институт генетики и цитологии НАН Беларуси,, Минск
Популяции стволовых клеток (СК) пуповинной крови человека включают гемопоэтические СК (ГСК), т.н. мезенхимальные СК (МСК), эндотелиальные прогенитор-ные клетки, а также клетки, образующие эмбриональноподобные тельца. Плюрипотентные популяции СК пуповинной крови способны образовывать как мезенхимальные диффероны (остео-, хондро-, адипо- и миоб-ластический), так и экспрессировать нейрональные и гепатоцитарные маркёры in vitro и in vivo. Наибольший интерес привлекает возможность наращивания СК ех vivo для последующей аллогенной трансплантации.
Нами изучены закономерности роста СК пуповинной крови in vitro. Экспансию ГСК изучали в мононуклеарной (МНЮ и обогащенной методом иммуномагнитной сепарации CD34+ клетками (CD34 об.) фракциях пуповинной крови в бессывороточной среде StemSpan. Для индукции пролиферации использовали смесь цитокинов: IL-3, IL-6, CSF, Rt3/i. Влияние подложки МСК аллогенного костного мозга человека (МСК КМ) на поддержание гемопоэза исследовали с помощью клоногенного теста в полужидкой питательной среде на основе метилцеллюлозы, (MethoCult). Содержание CD34+ клеток на 0, 7 и 14 сут. оценивали методом проточной цитофлуориметрии.
Для 4 исследованных образцов пуповинной крови показана возможность поддержания культуры ГСК в логарифмической фазе роста CD34+ клеток на протяжении 14 сут. с увеличением их количества за этот период более чем в 200 раз (от 17 до 340) при культивировании без подложки. Подложка МСК КМ способствовала дополнительному увеличению количества CD34+ клеток в 2—10 раз по сравнению с экспансией без нее, что позволило нарастить CD34+ клетки более чем в 700 раз (105—1650). В клоногенном тесте подтверждено, что культивирование на подложке МСК КМ способствует поддержанию более ранних некоммитированных предшественников гемопоэза. Общее количество эритроцитар-ных, гранулоцитарных, макрофагальных и смешанных колоний ГСК увеличивалось в среднем в 189,5 раза для МНК и в 147,5 раза для CD34 об. фракции клеток пуповинной крови после 14 сут. экспансии на подложке.
Наращивание МСК пуповинной крови из фракции МНК в среде —МЕМ с 30% эмбриональной сыворотки коров и последующим пассированием в той же среде с 10% сыворотки было эффективным в 2 из 11 образцов пуповинной крови, в то время как из костного мозга МСК — в 100% случаев. По скорости роста МСК пуповинной крови не отличались от МСК КМ, были отрицательными по CD34, CD45 и положительными по CD105 и CD90 маркерам. Увеличение прироста МСК в 2—5 раз наблюдалось на подложке из желатина или в присутствии АВ сыворотки человека. В низкоадгезивных нейрогенных условиях МСК пуповинной крови формировали флотирующие сферические агрегаты, несущие характерные для нейросфер микроотростки. Нейрогенная дифференцировка МСК пуповиной крови была подтверждена по выявлению мРНК и белков нестин, NSE, МВР.
* e-mail: mpotapnev@yandex.ru
Тезисы
В отдельной серии экспериментов подтверждены способность МСК пуповинной крови к увеличению экспрессии щелочной фосфатазы в ответ на стимулы остеогенной дифференцировки и экспрессии аггрекана при хондрогенной дифференцировке in vitro.
Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности культивирования in vitro гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и возможности мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови к дифференцировке в нейрогенном, остеогенном и хонд-рогенном направлениях.
B.C. Толмачев*, Т.Г. Кравцова, H.Ü. Кудрина,
Е.И. Боровицкая, Д.Ж. Жайлаубаева, Г.К Смагулова
Изучение клеток, выделенных из пуповинной крови
РГП Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологиии М3 РК Казахстан, Алматы
Изучали мононуклеары крови (МНК), выделенные из 947 образцов пуповинной крови (ПК) за период с 2005 по 2008 г. В ПК выявлен некоторый процент образцов с наличием вирусных гепатитов, уреаплазмы, микоплазмы, хламидий и цитомегаловируса.
Установлено, что сепарацию клеток эффективнее проводить в 3% желатиноле и лизисом 10% NH4CI, что в большей степени сохраняет витальность и активность свойств хроматина малых МНК, по данным флуоримет-рии с этидием бромидом и акридиновым оранжевым. В 35 образцах ПК, в G0-G1 фазах клеточного цикла находились 97,99+0,96% МНК; 1,13+1,13% - в фазе синтеза, 0,9+0,32% клеток в G2-M. Пролиферативный +
ние связывания АО и риванола SO2 с фосфатными группами ДНК и увеличение гистонов по данным с прочным зеленым. Конденсация хроматина МНК в пуповинной крови в 2 раза выше, чем в периферической крови.
При культивировании МНК, без факторов роста количество CD34+, и CD45+ снижалась, хроматин дестабилизировался. Внесение в культуру фактора роста №1, способствовало увеличению количества МНК за 24 ч в 1,3—3,5 раза. В культурах МНК с 30% и 40% плацентарным экстрактом и фактором роста №3 выявлено статистически достоверно повышение количества МНК на 6—7 сут., по сравнению с 20%. Использование 10% смеси ДМСО/реополиглюкина 1:1 снижает потери живых МНК на 30%, сохраняет их морфологию и предохраняет от апоптоза. Митозов и CD34+ МНК больше в присутствии аутосыворотки, апоптотический индекс снижался. Смесь 10% глицерин/глюкоза способна сохранять CD45+ МНК, при этом процент потерь МНК снижается.
Х.Д. Тонаева1, М.Е. Крашенинников2, С.А. Борзенок1,
H.A. Онищенко2
Особенности выделения и культивирования лимбальных стволовых клеток глаза
1 ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Москва
2 ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова», Москва
Стволовые/прогениторные клетки обладают способностью оптимизировать цитокиновый статус в клеточном микроокружении после их локальной сотрансплантации
при пересадке тканей и органов. В литературе имеются единичные публикации о совместной пересадке в клинике донорских роговиц человека и аллогенных лимбальных стволовых/прогениторных клеток (ЛСК) после их предварительного культивирования. При этом технология выделения, культивирования аллогенных лимбальных клеток от доноров-трупов и верификация их иммуно-супрессивных свойств для клинического применения не разработаны.
Цель исследования: разработать технологию выделения и культивирования аллогенных ЛСК человека для сотрансплантации с донорской роговицей.
Материал и методы. Из 16 трупных донорских глаз человека выделялась зона палисад Фогта, содержащая наибольшее количество ЛСК. Выделение ЛСК проводилось методом трипсинизации с применением колла-геназ ИII типов и ЗДТА. Для культивирования использовалась среда 0МЕМ/Р12, содержащая фетальную бычью сыворотку и ряд ростовых факторов.
Результаты. За период наблюдения независимо от способа выделения наблюдалась пролиферативная активность ЛСК. Клетки находились в виде рыхлых конгломератов во взвешенном состоянии и проявляли тенденцию к коло-ниеобразованию. Отсутствие адгезии клеток на первых этапах культивирования обуславливалось низкой плавучей плотностью лимбальных стволовых клеток и присутствием высокой концентрации коллагена в среде.
Задача дальнейших исследований — поиск оптимальных способов культивирования ЛСК в достаточном объеме для использования в клинике при сотрансплантации с донорской роговицей.
В.А. Федоров*
Клеточные технологии в современной медицине
ООО «Инновационные Медицинские Технологии»,
Москва
В настоящее время, одним из наиболее перспективных направлений в области клеточных технологий является применение стволовых клеток. Значительные успехи клинического применения стволовых клеток достигнуты в клеточной трансплантологии, лечении онкологических заболеваний, ожогов, ран и при ряде других восстановительных процессов в тканях.
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапии при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях и злокачественных новообразованиях. Однако, поиск подходящего донора костного мозга — дорогой и длительный путь и иногда пациент не доживает до трансплантации. Создание банков пуповинной крови (ПК) в значительной степени облегчает поиск материала для трансплантации, что в сочетании с удобным способом получения такого материала и легкой его доступностью является предпосылкой для увеличения количества трансплантаций ГСК ПК. Использование современных технических средств позволяет сократить потери клеток при их выделении, предотвратить микробную контаминацию на всех этапах работы, осуществлять замораживание и хранение клеток в полностью автоматическом режиме с ежеминутным мониторингом состояния образца.
Существует несколько способов лейкоконцентрации ПК, основанных на седиментации эритроцитов с использованием различных методов фракционирования крови
e-mail: lab_cyto_kz@mail.ru
e-mail: dr_fedorov@haemoline.ru
га
Тезисы
и выделения концентрата ядросодержащих клеток, однако в деятельности банка ПК требуется использование технологии, максимально сохраняющей количество и состав стволовых клеток ПК. Для этого идеально подходит компактная автоматизированная система Берах («ВюБа!е», Швейцария) для автоматической обработки пуповинной и периферической крови, а также костного мозга с целью выделения стволовых клеток и дальнейшей их подготовки к криоконсервации на аппарате Соо1ггпх («ВюБа!е», Швейцария). Система Берах позволяет проводить обработку крови в рамках 8 протоколов, а ее принцип действия основан на сепарации центрифугированием, позволяющем разделять компоненты крови в соответствии с их плотностью и размером. Обработка крови или ее компонентов происходит в закрытой стерильной системе. После обработки компоненты крови собираются в стандартные мешки и готовы для дальнейшего использования.
Для безопасного и удобного культивирования стволовых клеток наша компания предлагает одноразовые, стерильные, закрытые системы, состоящие из мешка для клеточной культуры, бессывороточной среды для культивирования и набора магистралей («СеНБешх», Германия). Среди особенностей таких систем можно выделить биологическую, химическую и иммунологическую инертность, хорошую проницаемость для С02 и
02, прозрачность (мешки производятся из тефлона), возможность использования в широком диапазоне температур (от —■196°С до +200°С). Закрытая система позволяет исключить возможность заражения, т. к. инкубация, микроскопия, центрифугирование, заморозка и автоклавирование проводится в одном мешке. Использование бессывороточных сред способствует улучшению воспроизводимости результатов опыта вследствие большей стабильности состава среды; снижению риска заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмой; облегчению очистки продуктов клеточного метаболизма; снижению влияния дополнительных белков на результаты биологических исследований; отсутствию цитотоксичности сыворотки. Помимо этого для культивирования стволовых клеток активно используются цитокины, в частности для культивирования гемопоэтических стволовых клеток существует целый ряд цитокинов, стимулирующих их рост и развитие.
В медицинской практике и для научных исследований для хранения биологических материалов используется жидкий азот. Замораживание в жидком азоте использовалось для криоконсервации биологических тканей в течение многих десятилетий. Так, методы замораживания эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов человека были разработаны еще в 1960-х годах и в настоящее время получили широкое распространение, а в последнее время были разработаны методы для криоконсервации стволовых клеток человека.
При хранении биологических тканей при криогенных температурах приостанавливаются обменные процессы, что обеспечивает сохранение в течение длительного времени. Однако образующиеся внутри клеток большие кристаллы льда вызывают необратимые повреждения. Использование ДМСО в качестве криозащитного средства в сочетании с тщательным регулированием процесса замораживания задерживает образования кристаллов льда и таким образом защищает клетки в течение всего периода хранения.
В процессе криохранения необходимо тщательно регулировать температуру. Это особенно важно в том случае, когда замораживаются образцы с большой пло-
щадью поверхности и малой массой. Перенос образца из одной морозильной камеры в другую неотвратимо приводит к тому, что извлеченные образцы нагреваются. Нагревание происходит не только из-за того, что излучаемое из окружающего воздуха тепло обогревает образец, но также потому, что пары воды на открытом воздухе конденсируются и замерзают на поверхности мешков с образцами. Это непреднамеренное нагревание может происходить много раз в течение многих лет хранения в открываемом азотном дьюаре или в камере хранения.
Как в условиях однократного нагревания, так и при многократном нагреве образца невозможно ни документировать, ни узнать как термическую историю каждого подвергавшегося нагреванию образца в течение длительного хранения, так и степень повреждения в результате многократного нагрева.
Система BioArchive («Thermogenesis», США) сводит эти проблемы к минимуму путем замораживания образца в отсеке паров жидкого азота в закрытой системе с последующим перемещением образцов на специфический адрес системы BioArchive, не открывая саму систему. Когда образец необходимо достать, роботизированная система оптически подтверждает идентичность образца перед удалением только этого конкретного образца и передачей его в эвакуационный модуль в отсеке паров жидкого азота.
Система BioArchive на сегодняшний день является самой современной для хранения стволовых клеток в жидком азоте, позволяющей одновременно хранить 3626 образцов.
Данная система полностью автоматизирована, имеет два встроенных программных замораживателя и характеризуется низким расходом жидкого азота на один образец во время хранения и программного замораживания. Кроме того, одна такая система заменяет 6—7 дьюаров, имеет источник бесперебойного питания, что позволяет разместить или извлечь образец стволовых клеток в случае отключения электричества, а также имеет систему управления образцом.
Таким образом, система BioArchive представляет собой высокотехнологичный метод замораживания, хранения и извлечения стволовых клеток.
Основной причиной осложнений после трансплантации является реакция трансплантата против хозяина (РТПХ). Традиционная терапия связана с многочисленными побочными эффектами и часто не эффективна. В настоящее время для лечения РТПХ широко применяется метод экстракорпорального фотофереза. Этот метод основан на использовании псораленов и ультрафиолетового излучения диапазона А (ПУФА-тера-пия). Принцип метода заключается в заборе цельной крови у пациента, ее последующем центрифугировании на компоненты, основываясь на их различной удельной плотности: плазма, красные и белые кровяные клетки (лейкоцитарный слой). Красные клетки крови и плазма сразу возвращаются пациенту. Лейкоцитарный слой обрабатывается фотосенсибилизирующим препаратом, который затем активируется непродолжительным действием УФА излучения и сразу возвращается в кровоток пациента. Все стадии метода осуществляются в полностью автоматизированной закрытой системе UVAR XTS («Therakos», США), что позволяет исключить риск заражения и ошибки в работе персонала. Набор датчиков и система звукового оповещения обеспечивают исключение риска воздушной эмболии, контроль давления в системе, контроль скорости за-
Тезисы
бора и реинфузии крови, контроль поступления антикоагулянта, а также достаточную световую энергии для облучения клеток. Кроме того, экстракорпоральный фо-тоферез успешно применяется для лечения целого ряда онкологических заболеваний, таких как рефрактерная кожная Т-клеточная лимфома, а также используется как иммунотерапия в комплексном лечении ряда кожных, аутоиммунных и пролиферативных заболеваний, таких как вульгарная пузырчатка, псориатический артрит, псориаз, дерматиты, системная склеродермия, болезнь Рейтера и др.
В Л. Шахов1, A.B. Крылатов2*
Основные принципы клеточной трансплантации
при острой сердечной недостаточности
1 Томский государственный политехнический институт, Томск
2 Научно-исследовательский институт кардиологии СО РАМН, Томск
Цель исследования — определить принципы проведения эффективной клеточной траснплантации при острой сердечной недостаточности.
Моделировали острую и хроническую сердечную недостаточность (ОСН, ХСН) путем коронароокклюзии, криодеструкции левой коронарной артерии у крыс линии «Вистар». Костномозговые мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) получали в системе in vitro (с 5-азацитидином) в течение 21 сут. ММСК вводили интрамиокардиально или внутривенно, в разных дозах на 1, 5, 8, 21, 30 и 40-е сут. опыта. Оценивали электрофизиологические и структурно-функциональные свойства сердца.
Установлено, что ММСК, следует вводить не раньше 8, но не позднее 21 сут. эксперимента. ММСК, трансплантируемые внутрисердечно, но не внутривенно, восстанавливают поврежденный миокард в периинфарктной зоне.
За 21 сут. с помощью стандартных технологий не возможно вырастить необходимое количество ММСК.
Адаптация ММСК (гипоксия, гипертермия) и активация микроокружения миокарда (радиочастотное воздействие) усиливает эффект клеточной трансплантации.
Необходимое количество ММСК можно получить в криобанке или разработать биореактор для быстрого наращивания необходимой клеточной массы.
e-mail: krylatovav@mail.ru
•l'Therakos
Система для проведения экстракорпорального фотофереза - UVAR XTS («Therakos», США)
Экстракорпоральный фотоферез представляет собой метод, основанный на сочетании лейкафереза и облучения лейкоцитов, предварительно обработанных фотосенсибилизатором (8-метоксипсораленом), ультрафиолетовым светом диапазона А (320 - 400 нм).
Область применения:
Лечение онкологических, аутоиммунных, дерматологических и пролиферативных заболеваний:
• Т-клеточная злокачественная лимфома кожи,
• атопический дерматит,
• склеродермия,
• псориаз,
• ревматоидный артрит,
• отторжение органов после
• уменьшение реакции трансплантат против хозяина (РТПХ).
Особенности системы:
Безопасность для пациента:
одноразовая система расходных материалов, исключение риска воздушной эмболии, исключение риска заражения,
осуществление контроля поступления антикоагулянта, контроль давления в системе,
контроль скорости забора и возвращения крови пациенту, возможность изменения параметров процесса в течение процедуры, при необходимости автоматическая блокировка системы магистралей.
Простота в работе и обслуживании: удобное использование для оператора,
конструкция аппарата и расходных материалов исключают возможность ошибки при загрузке,
однократная венепункция, полная автоматизация процедуры,
быстрое и безопасное извлечение компонентов процедурного набора после завершения процедуры.
' наличие ключа данных, на котором фиксируется вся информация о протекании процесса.
«в ЫоьаРе.
Система для выделения стволовых клеток -
Sepax («BioSafe», Швейцария)
■ *
i
I
1
P
Самая современная, компактная система, позволяющая выделять стволовые клетки из пуповинной и периферической крови, а также из костного мозга. _
Идеальная система для быстрой автоматической обработки крови с высоким уровнем жизнеспособности клеток после процедуры.
Sepax позволяет проводить обработку крови в рамках 8 протоколов.
Принцип действия Sepax основан на сепарации центрифугированием, позволяющем разделять компоненты крови в соответствии с их плотностью и размерами. —
Система предназначена для применения в клеточной терапии, где необходимо получение определенных компонентов крови.
Обработка крови или ее компонентов происходит в закрытой стерильной системе. Компоненты крови собираются в стандартные мешки и готовы для дальнейшего использования (криоконсервация, наращивание in vitro, переливание пациенту и др.).
Эксклюзивный представитель ООО «Инновационные Медицинские Технологии» Москва, ул. Ивана Франко, д. 4, корп. 15, тел/факс: +7(495)380-36-62 E-mail:
dr fedorov@haemoline.ru , gerasimenkodv@haemoline.ru. neunvlovamv@delrus.org
■ ■ ' (■ “t ■ il
thermogenesis
Автоматизированная система для хранения стволовых клеток в жидком азоте -BioArchive («Thermogenesis», США).
Система рассчитана на 3626 образцов стволовых клеток
• Низкая стоимость операционного процесса
- Низкий расход жидкого азота на один образец во время хранения и программного замораживания
- Полностью автоматизированный процесс сокращает время работы I персонала
• Снижение затрат на оборудование
- Не требуется большого количества дьюаров для хранения (одна система BioArchive заменяет 6-7 дьюаров)
- Наличие двух встроенных программных замораживателей
• Безопасность и защита
- Полузакрытая система сокращает воздействие азота на оператора
- Источник бесперебойного питания позволяет разместить/извлечь образец в случае отключения электричества
- Параметры 24-х часового контроля и управления доступом включают в себя: Мониторинг уровня жидкого азота Пароль для доступа
Интегрированный программный замораживатель
- Минимизирует температурные колебания
- Отсутствует этап ручного переноса образца из программного замораживателя в дьюар для хранения
Криоконтейнер на 25 мл
- Постоянный геометрический размер образца
- Воспроизводимый процесс заморозки для каждой единицы
- Возможность роботизированной закладки на хранение и извлечение образцов
- Снижается вероятность ошибки, связанной с человеческим фактором Система управления образцом
- Использование штрих-кода исключает ошибки при перемещении образца
- Отчет по образцу:
История образца Инвентаризация График замораживания
www.thermogenesis.ru
Расходные материалы для культивирования стволовых клеток «Се1Юешх» (Германия): Комплекты СеПСго для культивирования клеток в закрытых системах.
• Се1Юго НРС для культивирования гемопоэтических клеток,
ЫК-клеток, Т-клеток
• Се1Юго ЭС для культивирования дендритных клеток Бессывороточные среды СеПСго:
• 8СвМ для культивирования: гемопоэтических прогениторных клеток, ИК-клеток, Т-клеток
• ЭС для культивирования дендритных клеток >—. л
Культуральные мешки УиеЫГе С с е Г" '
(сделаны из FEP Teflon)
CellGro цитокины
Для увеличения гемопоэтических прогениторных клеток, NK-клеток, Т-клеток и дендритных клеток.____________________________________
