CC BY
83
УДК 617.713-089.28
Борзенок С.А.1, Васильев А.В.2, Шипунова А.В.1, Дашинимаев Э.Б.2,
Мороз З.И.1, Комах Ю.А.1, Ковшун Е.В.1
1ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии», Москва. ^Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, Москва.
E-mail: shipunova84@mail.ru
ТКАНЕИНЖЕНЕРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ БИОКЕРАТОПРОТЕЗНОГО КОМПЛЕКСА
Проведена разработка и обоснование преимуществ технологии изготовления биоинженерной конструкции кератопротезного комплекса с использованием модифицированной донорской роговицы и культивированных фибробластов кожи для лечения осложненных и истонченных бельм. Ключевые слова: биоинженерная конструкция, кератопротезный комплекс
Актуальность
По данным ВОЗ в 2010 году заболевания роговицы явились причиной слепоты 8 млн. людей во всем мире. При осложненных и истонченных бельмах операцией выбора является протезирование роговицы [2-4,7,10,14,15,18]. Однако развитие таких осложнений, как асептический некроз, приводит к распаду окружающих тканей и протрузии (выпадению) имплантированного кератопротеза [3,4,7,10,15,18].
К некрозу могут приводить повышенное внутриглазное давление, ретропротезная мембрана, расслоение бельма в поверхностных слоях, несовпадение радиусов кривизны бельма и опорной пластинки кератопротеза (ОПК), постоянное давление ОПК на патологически измененные ткани бельма, повышенное испарение с поверхности роговицы и т.д. [2,14,15,18]. Одной из основных причин асептического некроза является нарушение трофики, возникающее после введения ОПК с избыточной механической жесткостью конструкции и малой площадью перфораций в толщу бельма [4,7,10].
На сегодня наиболее эффективной и безопасной техникой повышения биомеханической прочности роговицы является кросслинкинг роговичного коллагена. Данный способ основан на эффекте фотополимеризации стромальных волокон под воздействием фоточувствительной субстанции рибофлавина, и низких доз ультрафиолетового излучения твердотельного и\А-источника [17,20]. В результате фотохимических реакций происходит утолщение коллагеновых волокон, повышение ригидности роговицы и ее устойчивости к действию протеолитических ферментов.
В настоящее время одним из самых развивающихся направлений в медицине можно считать клеточнозамещающие технологии. Перс-
пективным направлением является создание биоинженерных конструкций, содержащих культивированные постнатальные фибробла-сты кожи человека в комбинации с биоматриксами, интегрирующимися в организм реципиента. Подобные трансплантаты широко используются в комбустиологии, урологии, стоматологии, офтальмологии и других клинических областях медицины [1,6,8,9,11-13,16,19]. Данные конструкции оказывают стимулирующее действие на процессы регенерации даже в условиях инфицированной раны, позволяя избежать ряда осложнений, имеющих место при трансплантации целых тканей. На примере «живого эквивалента дермы» (культивированных фиб-робластов кожи в трехмерном коллагеновом геле) показано, что помимо выработки фиброб-ластами факторов роста, способствующих адгезии, росту, пролиферации клеточных элементов, коллагена I и II типов, компонентов внеклеточного матрикса, происходит трансформация фибробластов в миофибробласты, контракция геля и образование структуры, похожей на соединительную ткань [1, 8, 13, 16].
Цель
Разработка и обоснование преимуществ технологии изготовления конструкции биоке-ратопротезного комплекса на основе кросслин-кинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы и культивированных фибробла-стов кожи для повышения качества трансплантата при использовании его в лечении тяжелых осложненных бельм.
Материалы и методы
Метод кросслинкинга роговичного коллагена. В эксперименте in vitro использовалось 24
кадаверные роговицы человека, невостребованные для трансплантации. Для имплантации титановой ОПК модели Федорова-Зуева в строме данных роговиц был сформирован карман 6 х 8 мм, соответствующий размерам пластинки. Часть роговиц (N=12) в качестве контроля помещали на 14 суток в среду DMEM (Биолот, Россия), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США). Затем для сканирующего электронного исследования роговицы фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. Остальные роговицы помещали на 1 час в раствор, содержащий 5% декстран и 0,1% рибофлавин [5], после чего роговицы облучали ультрафиолетом с помощью прибора для кросслинкинга роговичного коллагена UV-X™ (IROC, Швейцария) мощностью 3 МВт/см2 (5,4 Дж/ см2), длиной волны 365 нм, сфокусированной на 12 мм от вершины роговицы. Общее время манипуляции составило 30 минут, при этом каждые 5 мин на поверхность роговицы наносился раствор 0,1% рибофлавина
Метод выделения и культивирования фибробластов. Фибробласты выделялись из биоптата кожи взрослого человека с помощью механической дезагрегации и ферментативной обработки 0,1% коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующими отмывкой и центрифугированием. Клеточный осадок трижды отмывали в среде DMEM. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС. На 3-ем пассаже культуры фиброб-ластов трансфицировали геном зеленого флуоресцирующего белка GFP под CMV-промотором при помощи лентивирусной конструк-циииООО Евроген, Россия) для возможности
Рисунок 1
их прижизненной визуализации с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX51 (Olympus, Япония). Часть трансфицированных клеток пассировали на титановый опорный элемент кератопротеза Федорова-Зуева и культивировали в течение 14 суток в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС. Другую часть клеток смешивали с коллагеновыми микроносителями CultiSpher-S (Percell, HyQone, США), представляющими собой био-деградируемые коллагеновые сферы диаметром 100-200 мкм с неровной поверхностью, в соотношении 106 клеток на 1мл микроносителей. Культивирование проводилось в течение 7 суток в среде DMEM c 10% ЭТС.
Моделирование конструкции биокератоп-ротезного комплекса. Использовались ОПК модели Федорова-Зуева. В интрастромальный карман кросслинкинг-модифицированной роговицы вводили титановую ОПК Федорова-Зуева. Далее при помощи автоматической пипетки в карман инъецировали 200 мкл суспензии культивированных фибробластов на микроносителях. Полученные конструкции инкубировали в стандартных культуральных условиях: 5% СО2 100% влажность, 370С. Наблюдение с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа проводили на 1,3,7 и 14 сутки (рис.1).
Для проведения сканирующей электронной микроскопии на растровом ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI, Нидерланды) и иммуногистохимических исследований полученные конструкции биокератопро-тезных комплексов фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина.
Для идентификации и подтверждения жизнеспособности введенных фибробластов использовалась иммуногистохимическая окраска антителами против зеленого белка EGFP (Invitrogen, США). Определение актина проводилось с помощью первичных мышиных моноклональных антител против б-SMA (Abcam, США). Ядра клеток окрашивались DAPI (Invitrogen, США). Для вторичной окраски антителами использовались поликлональные антитела против Mouse IgG, связанные с флуоресцентным красителем Су-5 (Abcam, США)
Результаты
Культивированные фибробласты адгези-ровались на титановую ОПК и полностью за-
селяли ее поверхность к 5 дню. С помощью инвертированной флуоресцентной микроскопии (ИФМ) установлено, что к этому же сроку клетки заселяли всю площадь поверхности коллагеновых микросфер.
По данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) коллагеновые волокна кросслинкинг-модифицированной стромы имели более плотную упаковку по сравнению со стромой интактных роговиц.
Результаты ИФМ и иммуногистохимичес-ких исследований показали наличие жизнеспособных фибробластов внутри интрастромаль-ного кармана. На различных сроках культивирования визуализировались «зеленые» клетки на всей площади интрастромального кармана. В результате окрашивания на маркер миофиб-робластов альфа-актин выявлена флюоресценция, подтверждающая наличие белка в клетках, начиная с 7 суток культивирования (рис.2). К 7 суткам инкубирования начинали образовываться тонкие фибриллы в виде перемычек между поверхностями микроносителей и стромой роговицы (рис.3). На этом же сроке наблюдалась биодеградация коллагеновых микросфер и их начальная интеграция в ткани роговицы.
Таким образом, уже через 7 суток инкубирования биокератопротезный комплекс может быть имплантирован пациентам (рис.4).
Обсуждение
Проведение процедуры кросслинкинга на аллогенных донорских роговицах по данным СЭМ позволило увеличить прочностные свойства коллагеновых волокон стромы, что особенно важно при использовании протезных конструкций.
Биологическая инертность опорной пластинки из титанового материала подтверждена выраженной адгезией фибробластов, формированием клеточного монослоя и дальнейшей пролиферацией клеток вокруг опорного элемента внутри интрастромального кармана.
Коллагеновые микроносители, примененные в качестве 3-х мерного матрикса (3D), способствовали малотравматичному введению клеток в интрастромальный карман роговицы и являлись дополнительным субстратом для синтеза межклеточного вещества. Внутри кармана культивированные фибробласты на микроносителях в 3D-условиях дифференци-
ровались в миофибробласты, что способствовало развитие контракции, образование прочной фиброзной ткани вокруг опорного элемента кератопротеза.
Рисунок 2
Рисунок 3
Рисунок 4
Заключение роносителях, способствующих развитию проТаким образом, разработанная конструк- лиферативных процессов, направленных на
ция биокератопротезного комплекса обладает поддержание трофики биокератопротезного
рядом преимуществ за счет повышения проч- комплекса, формирование прочной фиброзной
ностных свойств «сшитой» стромы роговицы и ткани вокруг ОПК, профилактику кератомаля-
введения фибробластов на коллагеновых мик- ции и протрузии ОПК.
---------------------------- 11.10.2011
Список литературы:
1.Васильев А.В. Макаров П.В., Роговая О.С. и др. Восстановление дефектов роговицы с помощью тканевой инженерии // Известия РАН. Серия биол. - 2005. - Т.32. - С.5-8.
2.Гундорова Р.А., Малаева Л.В., Удинцов Б.Е. Кератопротезирование // Методическое письмо.-М., 1977.
З.Зуев В.К. Сквозное кератопротезирование роговой оболочки при ожоговых бельмах. Дис. ... канд. мед. наук. М., 1974. -122 с.
4.Калинников Ю.Ю. Оптическое биокератопротезирование ожоговых бельм. Дис. ... д-ра мед. наук.- М., 2004.-303 с.
5.Мороз З.И., Борзенок С.А., Калинников Ю.Ю. и др. Способ обработки трупной роговицы человека перед кератопластикой. Патент РФ № 2381649
6.Пальцев М.А. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1.-М.: Медицина. Шико, 2009.-272 с.
7.Пучковская Н.А., Якименко С.А. Оптическое кератопротезирование. - Киев.: Здоров’я, 1986.-120с.
8.Роговая О.С., Васильев А.В., Киселев И.В. и др. Использование фибробластов человека, выращенных на микроносителях, для формирования эквивалента соединительной ткани // Онтогенез. - 2004. - Т.35. - №2. - С.105-109.
9.Саркисов Д.С., Алексеев А.А., Глущенко Е.В. и др. Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении целостности кожного покрова // Вестник РАМН. 1994. Т.6. С. 6-11.
10.Федоров С.Н., Мороз З.И., Зуев В.К. Кератопротезирование, М.: Медицина, 1982.-144с.
11.Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей- М.: Техносфера, 2007. - 304 с.
12.Шехтер А.Б., Берченко Г.Н. Фибробласты и развитие соединительной ткани: ультраструктурные аспекты биосинтеза, фибриллогенеза и катаболизма коллагена // Архив патологии - 1978. Вып. 8. - С.70.
13.Bell E., Rosenberg M. The commercial use of cultivated human cells // Transplantat. Proc., 1990.V. 22 P. 971-974.
14.Chirilia T.V., Constable I.I., Crawford G. et all. Keratoprosthesis // US Patent 5,300,116,5 April 1994.
15.Dohlman С.Н., Netland P. A., Fung W.C. Experience with a keratoprosthesis. // Anales del Instituto Barraquer. 1999. - Vol. 31. -N2.
16.Horch R.E., Kopp J., Kneser U. et all. Tissue engineering of cultured skin substitutes //J. Cell. Mol. Med. - 2005. - Vol.9, №3 - P.592-608.
17.Spoerl E., Wollensak G., Dittert D et all. Thermomechanical Behavior of Collagen-Cross-Linked Porcine Cornea // Ophthalmologia 2004; Vol. 218; 136-140.
18.Strampelli B. Keratoprosthesis with osteodental tissue // Amer.J.0phthalmol.-1993.-Vol.89.-P.1029-1039.
19.Yonezawa M., Tanizaki H., Inoguchi N et. all. Clinical study with allogenic cultured dermal substitutes for chronic leg ulcers // Int. J. Dermatol. - 2007. - Vol.46. - №1. - P.36-42.
20.Wollensak G., Spoerl E., Seiler Th. Stress Strain Measurements of Human and Porcine Corneas after Riboflavin/Ultraviolet-A Induced Crosslinking // J. Cataract Refract. Surg.; Sep. 2003; Vol. 29; 1780-1785.
UDC 617.713-089.28
Borzenok S.A.1, Vasilyev A.V.2, Shipunova A.V.1, Dashinimaev E.B.2, Moroz Z.I.1,
Kovshun E.V.1,Komakh Y.A.1
1The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Moscow
2NK Koltsov Institute of Developmental Biology, Moscow
TISSUE ENGINEERING OF BIOKERATOPROSTHETIC COMPLEX
Different methods of leukomas strengthening are used. Bioengineering constructions containing skin fibroblasts are performed to repair and replace body tissues. The aim of the study was to develop biokeratoprosthetic complex based on cross-linking modified allogenic donor corneas and cultured postnatal human skin fibroblasts.
Key words: bioengineering construction, keratoprosthetic complex.
