CC BY
26
Результаты изучения иммуногенной активности клеточных оболочек Francisella tularensis разных подвидов (сообщение 1)
A.В. Корнева (adm@chumin.irkutsk.ru), В.Б. Николаев, К.Ю. Ястремская, Е.Ю. Марков, В.В. Войткова, С.Ю. Соловьев, Ю.О. Попова, А.В. Мазепа,
B.С. Половинкина
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Резюме
Изучено влияние препаратов клеточных оболочек Francisella tularensis четырех подвидов, полученных из мочевинных лизатов туляремийного микроба, на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками экспериментальных животных. Показано стимулирующее влияние препаратов клеточных оболочек F. tularensis на синтез цитокинов. Результаты исследований позволяют рассматривать препараты клеточных оболочек F. tularensis в качестве компонентов при создании вакцин. Ключевые слова: туляремия, Francisella tularensis, клеточные оболочки, цитокины, иммунокомпетентные клетки, вакцины
Results of the Study of the Immunogenic Activity of Cellular Membranes Francisella tularensis Different Subspecies (1. report)
A.V. Kornevа (adm@chumin.irkutsk.ru), V.B. Nikolaev, K.Yu. Yastremskaya, E.Yu. Markov, V.V. Voytkova, S.Yu. Solovyov, Yu.O. Popova, A.V. Mazepa, V.S. Polovinkina
Federal State Institution of Public Health «Irkutsk Antiplague Research Institute» of Federal Service on Customers' Rights Protection
and Human Well-Being Surveillance
Abstract
The effect of cell membrane preparations of four subspecies of Francisella tularensis, derived from urea lysates tularemia microbe on cytokine production by immunocompetent cells of experimental animals have been studied. Stimulating influence cell membrane preparations of F. tularensis on cytokine synthesis was shown. The results allow to consider cell membrane preparations F. tularensis as constituent elements in the development of vaccines.
Key words: tularemia, Francisella tularensis, cell membranes, cytokines, immune cells, vaccines
Введение
Francisella tularensis - возбудитель зоонозной инфекции туляремии, природные очаги которой широко распространены во всем Северном полушарии в пределах умеренного климатического пояса, в том числе на территории Российской Федерации, и приурочены к различным климатическим зонам с разнообразными ландшафтами. Природным резервуаром данного возбудителя являются главным образом грызуны и зайцеобразные. Заражение происходит контактным, трансмиссивным, алиментарным и аспирационным путями.
В связи с рядом особенностей, таких как высокая вирулентность, возможность заражения аспирационным путем, устойчивость к воздействию факторов внешней среды и способность долго сохраняться в ней (от 5 суток до 10 месяцев), Центр по контролю и профилактике заболеваний США (Center for Disease Control and Prevention, CDC) включил F. tularensis в список потенциально опасных агентов биотерроризма с высшей категорией опасности «А» [1], что, несомненно, говорит об актуальности широкого исследования механизмов ви-
рулентности возбудителя туляремии и поиска путей создания эффективной вакцины против нее.
Известно, что туляремийный микроб, являясь внутриклеточным паразитом, обладает способностью противостоять бактерицидным механизмам фагоцитов и размножаться в них [2 - 5]. В то же время фагоциты под действием туляремийного микроба усиливают синтез ряда провоспалительных цитокинов, в том числе ИЛ-1 и ФНО-а, которые определяют течение инфекции в организме хозяина.
Локализация некоторых антигенных детерминант на поверхности клеток туляремийного микроба, данные о высокой протективной активности субклеточных фракций, а также входящих в их состав липополисахаридов и белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий обусловливают возможность использования поверхностных структур в качестве компонентов безопасных и эффективных профилактических и диагностических препаратов [6 - 8].
Одним из важнейших аспектов в изучении комплексных антигенных препаратов туляремийного микроба является оценка иммунного статуса экс-
периментальных животных, в частности продукции цитокинов клетками иммунофагоцитарной системы.
Цель исследования - изучение влияния препаратов клеточных оболочек F. tularensis разных подвидов, полученных из мочевинных лизатов ту-ляремийного микроба, на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками экспериментальных животных.
Материалы и методы
В работе были использованы шесть штаммов живых культур F. tularensis subsp. novicida Utah 112 (авирулентны для белых мышей в дозах 10 - 100 м.к.), F. tularensis subsp. mediasiatica А-61 (ЛД50 для белых мышей - 1 м.к.), F. tularensis subsp. tularensis B-399 A-Cole, F. tularensis subsp. holarctica 21/400, F. tularensis subsp. holarctica 306, F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ (вакцинный, ЛД50 для белых мышей - 2 х 106м.к.) из музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института.
Обеззараженные препараты клеточных оболочек получали лизисом живых клеток F. tularensis раствором мочевины. К суспензии микробных клеток в 0,9% растворе NaCl в равном объеме (1:1) добавляли 9 М раствор мочевины до достижения конечной концентрации 4,5 М, инкубировали в течение 24 часов при температуре 37 °С. Лизат микробных клеток, прошедший контроль специфической стерильности, подвергали центрифугированию при 10 тыс. g в течение 30 минут для освобождения от крупных фрагментов разрушенных клеток. Фракции клеточных оболочек получали центрифугированием осветленного лизата при 40 тыс. g в течение 60 минут.
Содержание белка определяли по методу O.H. Lowry с соавт. [9] или в его модификациях [10, 11], углеводов - в реакции с фенолом [12] после гидролиза препаратов в 2 н. H2SO4 в течение 2 часов при 95 °С. Содержание белка в препаратах варьировалось от 43 до 78% сухой массы, углеводов - от 20 до 38%.
В опыте были использованы 40 самцов сертифицированных белых беспородных мышей (НПО «Вектор», г. Новосибирск) массой 18 - 20 г (по пяти особей в группе). Животных выводили из эксперимента в соответствии с утвержденными правилами лабораторной практики (Приказ Минздрава России от 19.06.2003 г. № 267).
Подопытных животных распределили на семь групп. Белым мышам шести опытных групп вводили подкожно в объеме 0,2 мл забуференный физиологический раствор (ЗФР) pH 7,2 и в дозе 19 мкг - следующие препараты клеточных оболочек: F. tularensis Utah 112; F. tularensis А-61; F. tularensis B-399 A-Cole; F. tularensis 21/400; F. tularensis 306; F. tularensis 15 НИИЭГ. Контролем служили мыши, получившие подкожно по 0,2 мл ЗФР. Кровь у подопытных животных заби-
рали из хвостовой вены. Для получения плазмы в качестве антикоагулянта использовали 129 мМ цитратный буфер pH 7,4. Плазму крови получали центрифугированием (10 тыс. g при 4 °С в течение 15 минут).
Содержание цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-2 и ФНО-а в плазме крови оценивали в динамике на 3-и, 7-е и 21-е сутки после инокуляции животным исследуемых препаратов методом проточной флюоро-метрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США). В работе использовали коммерческие тест-системы Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standard Group I 23-Plex (Bio-Rad, США). Обработку данных осуществляли с помощью программы Bio-Plex Manager 5.0 Properties.
Содержание цитокинов в плазме крови анализировали в трех повторах. Количественные показатели содержания цитокинов в стандартных калибровочных разведениях, в контрольных и тестируемых образцах были воспроизводимы. Концентрацию цитокинов в плазме крови выражали в пкг/мл.
Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартного пакета прикладных программ Statistica, версия 6 (©StatSoft, Inc. 19842001, ИПЧИ 31415926535897), с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости Р < 0,05 и Р < 0,01; n = 15.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных данных показал, что уровень цитокинов в плазме крови у животных контрольной группы в среднем не превышал 1 пкг/мл.
На 3-и сутки после инокуляции препаратов экспериментальным животным было показано значительное увеличение синтеза ИЛ-1В (Р < 0,01) в ответ на иммунизацию препаратами F. tularensis subsp. tularensis B-399 A-Cole, F. tularensis subsp. holarctica 306, F. tularensis subsp. holarctica 21/400 и F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ. На 7-е сутки после иммунизации препаратами F. tularensis subsp. mediasiatica А-61 и F. tularensis subsp. novicida Utah 112 отмечено увеличение синтеза ИЛ-1В (Р < 0,05) (рис. 1).
Все препараты клеточных оболочек F. tularensis проявили стимулирующее влияние на синтез ФНО-а на 7-е сутки после иммунизации, но достоверное увеличение (Р < 0,05) было зафиксировано в ответ на введение препарата F. tularensis subsp. tularensis B-399 A-Cole. На 21-е сутки в плазме крови экспериментальных животных, иммунизированных клеточными оболочками, отмечали присутствие ФНО-а, но полученные значения выходили за пределы статистической значимости (рис. 2).
Усиление синтеза лимфокина ИЛ-2 на 7-е сутки после иммунизации наблюдали у экспериментальных животных в ответ на введение всех препаратов. К 21-м суткам содержание ИЛ-2 снизилось
Рисунок 1.
Синтез ИЛ-1 в ответ на иммунизацию препаратами клеточных оболочек F. tularensis
Рисунок 2.
Синтез ФНО- в ответ на иммунизацию препаратами клеточных оболочек F. tularensis
до значений ниже тех, что определялись в данном эксперименте (рис. 3).
Стоит отметить, что клеточные оболочки F. tularensis независимо от видовой принадлеж-
ности штаммов F. tularensis, из которых они получены, стимулировали продукцию ИЛ-lß, ФНО-а и ИЛ-2 иммунокомпетентными клетками экспериментальных животных. Тем не менее эффект стиму-
Рисунок 3.
Синтез ИЛ-2 в ответ на иммунизацию препаратами клеточных оболочек F. tularensis
ляции синтеза цитокинов был наиболее выражен в случае иммунизации белых мышей препаратами F. tularensis subsp. novicida Utah 112, F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306.
Повышенный уровень провоспалительного ци-токина ИЛ-1В на 3-и и 7-е сутки после инокуляции препаратов, а затем и синтез ФНО-а (на 7-е и 21-е сутки), высокие концентрации которого вызывают развитие системной воспалительной реакции, свидетельствуют о запуске цепи реакций, формирующих иммунный ответ макроорганизма.
Известно, что ИЛ-1В и ФНО-а являются корот-коживущими цитокинами и не депонируются в клетках, а синтезируются импульсно через транскрипцию мРНК соответствующего гена. Однако описаны случаи депонирования ФНО-а в тучных клетках [13], что, возможно, объясняет присутствие ФНО-а в плазме крови экспериментальных животных в высоких концентрациях на 21-е сутки.
В пользу активного формирования иммунитета у экспериментальных животных на введенные препараты клеточных оболочек F. tularensis говорит появление в плазме крови медиатора иммунного ответа ИЛ-2, стимулирующего антителообразо-вание к Т-зависимым антигенам и усиливающего пролиферацию Т-клеток. Данное обстоятельство может говорить о накоплении и активации эффек-торных клеток и, как следствие, о формировании иммунологической памяти [14].
Перспективность использования нативных поверхностных структур (полых везикул из наружных
мембран или клеточных оболочек - «теней» - ре-комбинантных бактериальных клеток) возбудителей бактериальных инфекций в качестве основы для конструирования химических бесклеточных вакцин подтверждают также результаты работ иностранных исследователей [15, 16].
Таким образом, полученные нами препараты клеточных оболочек туляремийного микроба обладают стимулирующим действием на продукцию провоспалительных цитокинов иммунокомпетент-ными клетками экспериментальных животных. Уровни цитокинов в плазме крови иммунизированных животных отражают, на наш взгляд, состояние работы иммунной системы в ответ на введение экспериментальных препаратов и характеризуют иммуногенную активность.
Выводы
1. Экспериментальные препараты клеточных оболочек туляремийного микроба, полученные из мочевинных лизатов живых клеток F. tularensis, обладают иммуногенной активностью.
2. Результаты исследования показали, что препараты клеточных оболочек F. tularensis разных подвидов оказывают стимулирующее действие на продукцию цитокинов ИЛ-1В, ИЛ-2 и ФНО-а у экспериментальных животных.
3. Количественные показатели содержания цитокинов ИЛ-1В, ИЛ-2 и ФНО-а в плазме крови экспериментальных животных и динамика их синтеза зависят от подвидовой принадлежности F. tularensis.
Полученные данные указывают на необходимость комплексного исследования иммуногенных свойств клеточных оболочек F. tularensis, выделенных из мочевинных лизатов живых микробных кле-
ток, и позволяют рассматривать их использование в качестве перспективных антигенных компонентов при создании эффективных и безопасных вакцинных препаратов.
Литература
1. Hepburn M.J., Friedlander A. M., Dembek Z.F., ed. Chapter 8: Tularemia. In: Textbooks of military medicine: medical aspects of biological warfare. Washington: Borden Institute. 2007; 167 - 184.
2. Fortier A.H., Green S.J., Polsinelli T., Jones T.R., Crawford R.M., Leiby D.A. et al. Life and death of an intracellular pathogen: Francisella tularensis and the macrophage. Immunol. Ser. 1994; 60: 349 - 361.
3. Mohapatra N.P., Soni S., Rajaram M. V. S., Dang P. M. C., Reilly T. J., El-Benna J. Francisella acid phosphatases inactivate NADPH oxidase complex components in human phagocytes by. J. Immun. 2010; 184 (9): 5141.
4. Oyston P.C.F. Francisella tularensis: unravelling the secrets of an intracellular pathogen. J. Med. Microbiol. 2008; 57 (8): 921 - 930.
5. Дубровина В.И. Функциональные особенности фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, вызываемом Francisella tularensis. Иркутск: Вост-Сиб. издательская компания; 2002.
6. Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Загоскина Т.Ю., Половинкина В.С., Иванова Т.А., Саппо С.Г. и др. Протективная активность субклеточных фракций Yersinia pestis при экспериментальной чуме у белых мышей. Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2004; 64 (3): 123 - 127.
7. Huntley J.F., Conley P.G., Rasko D.A., Hagman K.E., Apicella M.A., Norgard M.V. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect. Immun. 2008; 76: 3664 - 3671.
8. Войткова В.В. Формирование иммунного ответа макроорганизма на введение белково-полисахаридного комплекса Francisella tularensis разных подвидов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Иркутск; 2012.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1): 265 - 275.
10. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal. Biochem. 1977; 83 (2): 346 - 356.
11. Zaman Z., Verwilghem R.L. Quantitation of proteins solubilized in sodium dodecyl sulfate-mercaptoethanol-tris electrophoresis buffer. Anal. Biochem. 1979; 100 (1): 64 - 69.
12. Хансон Р, Филлипс Дж. Химический состав бактериальной клетки. Методы общей бактериологии. Москва: Мир; 1984. 2: 283 - 373.
13. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология: Учебник. 3-е изд., перераб. и доп. Москва: Медицина; 2010.
14. Медуницын Н.В. Вакцинология. Москва: Триада-Х; 2004.
15. Collins B.S. Gram-negative outer membrane vesicles in vaccine development. Discov. Med. 2011; 62 (12): 7 - 15.
16. Pierson T., Matrakas D., Taylor Y.U. Proteomic characterization and functional analysis of outer membrane vesicles of Francisella novicida suggests possible role in virulence and use as a vaccine. J. Proteome Res. 2011; 10: 954 - 967.
References
1. Hepburn M.J., Friedlander A.M., Dembek Z.F., ed. Chapter 8: Tularemia. In: Textbooks of military medicine: medical aspects of biological warfare. Washington: Borden Institute. 2007; 167 - 184.
2. Fortier A.H., Green S.J., Polsinelli T., Jones T.R., Crawford R.M., Leiby D.A. et al. Life and death of an intracellular pathogen: Francisella tularensis and the macrophage. Immunol. Ser. 1994; 60: 349 - 361.
3. Mohapatra N.P, Soni S., Rajaram M.V., Dang PM., Reilly T.J., El-Benna J. Francisella acid phosphatases inactivate NADPH oxidase complex components in human phagocytes by. J. Immun. 2010; 184 (9): 5141.
4. Oyston P.C. Francisella tularensis: unravelling the secrets of an intracellular pathogen. J. Med. Microbiol. 2008; 57 (8): 921 - 930.
5. Dubrovina V.I. Функциональные особенности фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, вызываемом Francisella tularensis. Irkutsk: East-Siberian; 2002 (in Russian).
6. Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Zagoskina T.Yu., Polovinkina V.S., Ivanova T.A., Sappo S.G. et al. Протективная активность субклеточных фракций Yersinia pestis при экспериментальной чуме у белых мышей. Bulletin of the East-Siberian Centre of Science of the Siberian Branch of the Russian Academy of Med. Sciences. 2004; 3 (64): 123 - 127 (in Russian).
7. Huntley J.F., Conley P.G., Rasko D.A., Hagman K.E., Apicella M.A., Norgard M.V. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect. Immun. 2008; 76: 3664 - 3671.
8. Voytkova V.V. Formation of host immune response to the injection of complex proteinpolysaccharide of Francisella tularensis subspecies different: PhD of biol. sci. diss. Irkutsk; 2012 (in Russian).
9. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1): 265 - 275.
10. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal. Biochem. 1977; 83 (2): 346 - 356.
11. Zaman Z., Verwilghem R.L. Quantitation of proteins solubilized in sodium dodecyl sulfate-mercaptoethanol-tris electrophoresis buffer. Anal. Biochem. 1979; 100 (1): 64 - 69.
Hanson R., Phillips G. The chemical composition of the bacterial cells. Manual of methods for general bacteriology. Мoscow: Mir; 1984. 2: 283 - 373 (in Russian).
Khaitov R^., Ignatieva G. A., Sydorovych I. G. Immunology. Norm and pathology: Textbook. 3-rd, edit. rev. and enl. Мoscow: Medicine; 2010 (in Russian).
14. Medunitsyn N. V. Vaccinology. Moscow: Triadа-Х; 2004 (in Russian).
15. Collins B. S. Gram-negative outer membrane vesicles in vaccine development. Discov. Med. 2011; 62 (12): 7 - 15.
16. Pierson T., Matrakas D., Taylor Y.U. Proteomic characterization and functional analysis of outer membrane vesicles of Francisella novicida suggests possible role in virulence and use as a vaccine. J. Proteome Res. 2011; 10: 954 - 967.
12.
13.
Вышла в свет монография «Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения при ликвидации последствий наводнения на Дальнем Востоке» под редакцией академика РАН, доктора мед. наук, профессора Г.Г. Онищенко и доктора мед. наук профессора С.В. Балахонова. Новосибирск: Наука-Центр; 2014: 648. ISBN 978-5-9554-0031-0
