CC BY
112
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
V
УДК 576.8:579:615.28]
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ВЫДЕЛЕНИЮ СПЕЦИФИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА, АКТИВНОГО В ОТНОШЕНИИ КОАГУЛАЗООТРИЦАТЕЛЬНЫХ СТАФИЛОКОККОВ
Р.Ф. Чанышева, А.А. Григорьев, О.В. Ковалишена,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Ковалишена Ольга Васильевна - e-mail: kovaiishena@maii.ru
В статье представлены результаты исследования по выделению коагулазоотрииательного стафилококкового бактериофага. Авторами была составлена и охарактеризована коллекция
штаммов коагулазоотрицательных стафилококков (CoNS) - возбудителей ИСМП, выделенных от пациентов, внешней среды медицинских организаций Нижнего Новгорода. Всего изучено 26 штаммов CoNS, включая 18 штаммов S. epidermidis, 5 - S. saprophyticus и по одному штамму S. haemolyticus, S. intermedius, S. Lugdunensis. Выделение и обнаружение бактериофагов из штаммов CoNS проводилось методом агаровых слоев Грациа. Из 26 штаммов CoNS продуцентами бактериофага явились лишь 10 штаммов S. epidermidis. Для выделения «чистой» линии бактериофага были проведены многократные пересевы полученных негативных колоний без признаков вторичного роста. В результате удалось получить линию фага высокой активности из штамма S. epidermidis, метициллинчувствительного, выделенного от пациента с ИСМП кардиохирургического стационара. По результатам электронно-микроскопического исследования установлено, что коагулазоотрицательный стафилококковый бактериофаг относится к IV морфологической группе вирусов бактерий по А.С. Тихоненко - «Фаги с длинным несокрашаюшимся отростком».
Ключевые слова: коагулазоотрицательный стафилококковый бактериофаг, инфекции, связанные с оказанием медицинской помоши.
Results of research on isolation of a coagulase-negative staphylococcal bacteriophage are presented in article. Authors made and characterized a collection of strains of coagulase-negative staphylococci (CoNS) - the etiological agents of healthcare-associated infections (HAIs), isolated from patients, environment of the medical settings of Nizhny Novgorod. In total 26 strains of CoNS, including 18 strains of S. epidermidis, 5 - S.saprophyticus and on one strain of S. haemolyticus, S. intermedius, S. Lugdunensis were investigated. Isolation and detection of bacteriophages from strains of CoNS was carried out by a method of agar layers of Gratsia. From 26 strains of CoNS producers of a bacteriophage were only 10 strains of S. epidermidis. For isolation of the «pure» line of a bacteriophage repeated resowings of the received negative colonies without signs of secondary growth were carried out. As a result it was succeeded to receive the line of a phage of high activity from the strain of S. epidermidis, metitsillinsusceptible, allocated from the patient with HAI of a cardiac hospital. By results of electronic microscopic research it is established that the of a coagulase-negative staphylococcal bacteriophage belongs to the IV morphological group of viruses of bacteria on A.S. Tikhonenko - «phages with a long not being reduced shoot».
Key words: of a coagulase-negative staphylococcal bacteriophage, healthcare-associated infections.
В этиологии инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи населению (ИСМП), отчетливо прослеживается тенденция роста заболеваемости ИСМП, вызванных коагулазоотрицательными стафилококками (CoNS), прежде всего Staphylococcus epidermidis Особую значимость CoNS приобрели как возбудители ИСМП новорожденных в учреждениях родовспоможения, пациентов в ОРИТ и в хирургических стационарах [1, 2, 3]. CoNS, в отличие от S. aureus, обладают меньшим набором факторов вирулентности. Патогенез инфекций, вызванных данной группой микроорганизмов, зависит, прежде всего, от факторов, обеспечивающих длительное существование в организме хозяина (факторы, обеспечивающие адгезию, формирование биопленок) [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Так, CoNS являются главными возбудителями инфекций, связанных с имплантацией медицинских устройств (венозных катетеров, артериовенозных шунтов для гемодиализа, ликворотводящих шунтов, катетеров для перитонеального диализа, эндокардиальных зондов-электродов, протезов суставов, сосудистых трансплантатов и протезированных клапанов, дренажей). Наиболее важным в патогенезе инфекций, ассоциированных с устройствами, является способность CoNS колонизировать поверхности полимера с образованием толстой, многослойной биопленки [2, 3, 4, 5, 6].
Особую важность представляет собой распространенность в популяции стафилококков явления резистентности к антимикробным препаратам (антибиотикам, дезинфектантам, антисептикам), что в свою очередь является причиной существенного ограничения выбора препаратов для лечения и профилактики стафилококковых инфекций. Увеличение доли стафилококков, устойчивых к метицил-лину (MRS), как маркеру резистентности ко всем р-лактамным антибиотикам, является наиболее актуальной проблемой [1, 2, 3, 4, 5]. Помимо устойчивости к р-лактамным антибиотикам, штаммы MRS, в том числе toNS, могут обладать устойчивостью к другим группам антибиотиков (макролидам, фторхинолонам, аминоглико-зидам, линкозамидам), частота устойчивости к которым варьирует в различных клиниках и странах.
В связи с этим необходим поиск альтернативных средств борьбы с ИСМП, вызванными CoNS. В этой роли возможно применение препаратов бактериофагов [6, 7]. К настоящему времени накоплено множество данных об использовании бактериофагов для эффективного лечения и профилактики различных бактериальных инфекций [8, 9]. Область применения бактериофагов широка и включает: фаготерапию -лечение больных и санация бактерионосителей; фагопрофилактику - профилактика возникновения инфекционных заболеваний у контактных лиц или медицинского персонала, фагирование внешней среды; а также фаготипирование как метод внутривидового типирования микроорганизмов. При этом в лечебных целях необходимо применять только препараты высокоактивных фагов, так как фаги с умеренной активностью способствуют распространению среди микроорганизмов факторов патогенности. Установлено, что фаги не просто входят в состав генома бактериальной клетки, они также являются основным средством горизонтального переноса генов, в том числе кодирующих различные факторы вирулентности. Таким образом, фаги играют существенную роль в эволюции и адаптации микроорганизмов [10].
Бактериофаги, гомологичные S. aureus, достаточно широко распространены и тщательно изучены [1, 7]. По сравнению с ними, бактериофаги, активные в отношении CoNS, до настоящего времени не представляли интереса, полученные препараты для фаготипирования и других целей не нашли широкого применения. Однако, с изменением представлений о значимости данной группы микроорганизмов, и прежде всего S. epidermidis, в развитии ИСМП, активно ведутся исследования по выделению коагулазоотрицательных бактериофагов и изучению их генома, а также возможности их применения [6, 7].
Все вышеизложенное и определило цель настоящего исследования: выделение специфического коагулазоотри-цательного бактериофага из культур микроорганизмов, вызвавших ИСМП у пациентов различных ЛПО Нижегородской области.
Материалы и методы
Объектом исследования послужили штаммы CoNS, выделенные из клинического материала пациентов с ИСМП и из внешней среды 7 медицинских организаций г. Н. Новгорода за период 2011-2012 гг., включая специализированный кар-диохирургический стационар, крупные взрослые и детские многопрофильные больницы, родильные дома. Работа включала следующие этапы: 1) отбор штаммов CoNS , выделенных из клинического материала ЛПО Н. Новгорода, их видовое типирование и характеристика антибиотикорези-стентности; 2) выделение и накопление фаговых частиц; 3) изучение морфологии выделенного фага.
В исследование были включены 26 штаммов КОС: 18 штаммов S. epidermidis, 5 - S. saprophyticus и по одному штамму S. haemolyticus, S. intermedius, S. lugdunensis. Идентификация стафилококков проводилась в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ». Оценивались морфологические и фенотипические характеристики: морфология колоний на кровяном агаре, наличие способности к плазмокоагуляции и лецити-назной активности. Биохимическая идентификация проводилась с помощью тест-систем ПБДС, производства НПО «Диагностические системы» (Н. Новгород); «СТАФИтест16» PLIVA-Lachema Diagnostica (Чехия); «BBL Crystal», Becton Dickinson (США).
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам проводилось диско-диффузионным методом на Мюллера-Хинтон агаре в соответствие с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Определялась чувствительность штаммов к 7 антимикробным препаратам: ванкомици-ну, клиндомицину, эритромицину, бензипенициллину, оксациллину, левофлоксацину, гентамицину.
Выделение и обнаружение бактериофагов из штаммов CoNS проводилось по общепринятой методике, а именно методом агаровых слоев Грациа [11]. Для приготовления бактериальной суспензии чистую суточную культуру CoNS (микроорганизмов) разводили в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия под оптический стандарт ГИСК им. Тарасевича, мутности, соответствующей 10 единицам мутности. Полученную взвесь CoNS (0,1 мл) вносили в пробирку с 2 мл 0,6% расплавленного и остуженного до температуры
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
45°С агара. Содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали вторым слоем в чашку Петри с 1,5% Мюллера-Хинтон агаром. После подсыхания агара посев ставили в термостат при температуре 37°С, учет результата проводился через 24 часа инкубации. Появление прозрачных бляшек (негативные колонии), хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий, указывает на присутствие бактериофага.
Для увеличения титра выделенного бактериофага крупные негативные колонии без признаков вторичного роста были помещены в физиологический раствор и обработаны хлороформом (1:10). Затем в количестве 0,4 мл были иноку-лированы во флаконы с питательным бульоном (50 мл) и суточными культурами (0,1 мл) штаммов СоЫБ (после предварительной инкубации в течение 6 часов при температуре 37°С). После 14 суток инкубации в термостате надосадочную жидкость (фаголизат) проверяли на наличие в ней бактериофага по методу агаровых слоев Грациа.
Исследование ультраструктуры фаговых частиц осуществляли методом негативного контрастирования 2,0% водным раствором уранилацетата при увеличении в 60-120 тыс. раз и ускоряющем напряжении 70 кВ.
Результаты и их обсуждение
Для выделения специфического бактериофага, активного в отношении СоЫБ, и прежде всего Б. ер1Сегт1С1Б, была создана рабочая коллекция из микроорганизмов (СоЫБ), актуальных для ЛПО Н. Новгорода.
Результаты исследования антибиотикочувствительности 14 штаммов Б. ер1Сегт1С15 показали, что 92,9% из них обладали устойчивостью к пенициллинам (13/14), доля метицил-линрезистентных Б. ер1Сегт1С1Б составила 50,0+13,4% (7/14) (рис. 1).
Гентамицин Левофлоксацин Оксациллин Бензилпенициллин Эритромицин Клиндомицин Ванкомицин
—на Я
-9—.
■60
92,9
н21
,4
ч50
0 20 40 60 80
Доля устойчивых культур,'
РИС. 1.
Спектр антибиотикорезистентности S.epidermidis, %.
Удельный вес полирезистентных штаммов, штаммов с перекрестной устойчивостью к р-лактамным антибиотикам и к 14- и 15-членным макролидам также составил 50,0+13,4% (7/14 штамма Б. ер1Сегт1С1Б) (таблица). Все полирезистент-ные штаммы были выделены от новорожденных с ИСМП, клинический материал: кровь, отделяемое пупочной ранки, материал из интубационной трубки. Следует отметить, что все штаммы сохраняли чувствительность к ванкомицину и хинолонам.
ТАБЛИЦА.
Результаты исследования чувствительности S. epidermidis к антибиотикам
Устойчивость к антибиотикам Доля устойчивых штаммов S. ep^derm^dis, %
Полирезистентность 50 (7/14)
Перекрестная устойчивость ко всем р-лактамным антибиотикам 50 (7/14)
Перекрестная устойчивость к аминогликозидам 14,3 (2/14)
Перекрестная устойчивость к 14- и 15-членным макролидам 50,0 (7/14)
Перекрестная устойчивость к линкозамидам 21,4 (7/14)
Устойчивость к хинолонам 0
100
Дальнейшая работа заключалась в непосредственном выделении бактериофага из культур рабочей коллекции. Результаты трех постановок показали: из 26 штаммов СоЫБ продуцентами бактериофага явились лишь 10 штаммов, все - Б. ер1Сегт1С1Б. При посеве взвеси данных микроорганизмов методом агаровых слоев бактериофаг сформировал мутные, округлой формы, с неровным краем и следами вторичного роста негативные колонии. Диаметр их не превышал 3,0 мм. Последовательный пересев (4 пассажа) негативных колоний привел к тому, что 7 штаммов Б. ер1Сегт1С1Б явились продуцентами фага, который наряду с мутными колониями формировал единичные колонии с прозрачным центром. Однако микроскопия бляшек показала, что на дне имеется слабовыраженный рост индикаторной культуры (рис. 2а). Для выделения «чистой» линии бактериофага были проведены многократные пересевы полученных негативных колоний без признаков вторичного роста.
В результате удалось получить линию фага высокой активности из штамма Б. ер1Сегт1С15 (№ 166), метициллинчувстви-тельного, выделенного из раневого отделяемого пациента с ИСМП специализированного кардиохирургического
Вид лизиса индикаторной культуры S. epidermidis на двухслойном Мюллер-Хинтон агаре, приготовленном по методу Грациа: а — морфология негативных колоний с признаками вторичного роста индикаторной культуры;
б — морфология негативных колоний «чистой» линиии фага; в — полный лизис индикаторной культуры (вся площадь чашки Петри).
стационара. Данный бактериофаг вызывал полный лизис индикаторной культуры на двухслойном Мюллер-Хинтон агаре, приготовленном по методу Грациа (рис. 2в), а также формировал прозрачные негативные колонии правильной округлой формы диаметром до 3,0 мм (рис. 2б).
По результатам проведенного электронномикроскопического исследования морфологии фаговых частиц установлено: вирионы бактериофага состоят из многогранной удлиненной головки гексагональной формы и длинного отростка и относятся к IV морфологической группе вирусов бактерий по А.С. Тихоненко - «Фаги с длинным несокращающимся отростком» (рис. 3) [12].
РИС. 3.
Морфология фаговых частиц.
Заключение
В результате проведенного исследования:
1. Была составлена и охарактеризована коллекция штаммов СоЫБ - возбудителей ИСМП, выделенных от пациентов,
внешней среды и актуальных для ЛПО различного профиля Н. Новгорода. Из штамма Б.ер1Сегт1С1Б, МББЕ, вызвавшего ИСМП у пациента кардиохирургического стационара, выделен коагулазонегативный стафилококковый бактериофаг с высокой активностью.
2. Изучена морфология негативных колоний стафилококкового бактериофага, а также ультраструктура самих фаговых частиц.
3. Установлено, что коагулазонегативный стафилококковый бактериофаг относится к IV морфологической группе вирусов бактерий по А.С. Тихоненко - «Фаги с длинным несокращающимся отростком».
Ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000. 239 с.
2. Благонравова А.С., Воробьева О.Н., Ковалишена О.В. и др. Эпидемиологические и микробиологические аспекты госпитальных гнойносептических инфекций новорожденных, обусловленных коагулазоотрица-тельными стафилококками. Медицинский альманах. 2009. № 2. С. 72-75.
3. Martins A., Cunha Mde L. Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci: epidemiological and molecular aspects. Microbiol Immunol. 2007. № 51 (9). Р. 787-95.
4. Von Eiff C., Peters G., Heilmann C. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis. 2002. № 2 (11). Р. 677-685.
5. Weisser M., Schoenfelder S.M.K., Orasch C. Hypervariability of biofilm formation and oxacillin resistance in a Staphylococcus epidermidis strain causing persistent severe infection in an immunocompromised patient. J Clin Microbiol. 2010. № 48. P. 2407-2412.
6. Gut^rrez D. et al. Genomic characterization of two Staphylococcus epidermidis bacteriophages with anti-biofilm potential. BMC Genomics. 2012. Jun 8. P. 213-228.
7. Deghorain M., Van Melderen L. The Staphylococci Phages Family: An Overview. Viruses. 2012. December. № 4 (12). P. 3316-3335.
8. Дроздова О.М., Брусина Е.Б. Применение бактериофагов в эпидемиологической практике: взгляд через столетие. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010. № 5. С. 20-24.
9. Асланов Б.И. и др. Перспективы фаготерапии госпитальных инфекций в условиях формирования антибиотикорезистентности. Инфекция и иммунитет. 2012. Т. 2. № 1-2. С. 471.
10. Brussow H., Canchaya C., Hardt W.D. Phages and the evolution of bacterial pathogens: From genomic rearrangements to lysogenic conversion. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. № 68. Р. 560-602.
11. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961.
12. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М. 1968.
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
