Биологическая характеристика эковаров коагулазонегативных стафилококков, выделенных от новорожденных пациентов детского стационара Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

NK

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

УДК: 579.84.017:616.9-053.31

Код специальности ВАК: 14.02.02

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКОВАРОВ КОАГУЛАЗОНЕГАТИВНЫХ СТАФИЛОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ НОВОРОЖДЕННЫХ ПАЦИЕНТОВ ДЕТСКОГО СТАЦИОНАРА

Е. В. Беляева1, Г. Б. Ермолина1, Е. В. Борискина1, И. С. Шкуркина1, Т. В. Носова2, И. В. Белова1, А. Г. Точилина1, И. В. Соловьева1, В. А. Никифоров1,

1 ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»,

2 ГБУЗ НО «Детская городская клиническая больница № 1 Приокского района», г. Нижний Новгород

Беляева Елена Вячеславовна - e-mail: iabnikif@yandex.ru

В статье проанализированы видовой состав и некоторые факторы патогенности и персистенции коагулазонегативных стафилококков, циркулирующих в детском стационаре в январе - марте 2016 г. Отмечено преобладание S. epidermidis и S. haemolyticus, отличавшихся полиантибиотико-резистентностью и устойчивостью к бактериофагам. Культуры S. haemolyticus чаще проявляли антибиотикорезистентность к пенициллинам, карбапенемам, цефалоспоринам и азитромици-ну, но лучше лизировались секстафагом и пиобактериофагом поливалентным, чем штаммы S. epidermidis. Культуры S. epidermidis обладали более высоким уровнем протеолитической активности, а S. haemolyticus - более высокой степенью пленкообразования. Ключевые слова: коагулазонегативные стафилококки, антибиотикорезистентность, фагочув-

ствительность, формирование биопленки.

The species composition and some factors of pathogenicity and persistence of coagulase-negative staphylococci circulating in a children's hospital in January - March 2016 were analyzed in the article. It was noted the predominance of S. epidermidis and S. haemolyticus, which were characterized by multidrug resistance to antibiotics and resistance to bacteriophage. Isolates of S.haemolyticus showed more often the antibiotic resistance to penicillins, carbapenems, cephalosporins and azithromycin, but better were lysed by sexstaphage and polyvalent pyobacteriophage than the strains of S. epidermidis. Strains of S. epidermidis showed higher levels of proteolytic activity, while S. haemolyticus demonstrated a higher degree of film formation.

Key words: coagulase-negative staphylococci, antibiotic resistance, sensitivity to bacteriophages, biofilm formation.

Введение

Формирование микрофлоры человека начинается с первых минут жизни. Этот процесс является многофакторным и во многом зависит от среды обитания. В особом положении находятся новорожденные дети, госпитализированные в стационар, так как при этом они из госпитальной среды родильного дома попадают в госпитальную среду больницы. В этом случае формирование микробиоценоза неизбежно происходит с участием госпитальной микрофлоры, которая, как известно, отличается особой агрессивностью и резистентностью к лечебным и дезинфицирующим средствам [1, 2].

Среди разнообразного видового состава микроорганизмов, колонизирующих различные локусы, значительное количество приходится на коагулазоотрицательные стафилококки (CoNS), которые находятся на коже и слизистых, входят в состав микробных ассоциаций. Являясь нормальными симбионтами, при определенных условиях они могут выступать в роли оппортунистических патогенов. Так, по данным ретроспективного анализа за 2007-2008 гг. в Н. Новгороде в этиологической структуре гнойно-септических инфекций новорожденных преобладали Staphylococcus spp. (74,0%), из них коагулазонегативные стафилококки (CoNS) - 70,2% [3]. В структуре возбудителей кожных и глазных форм перинатальной инфекционно-воспалитель-ной патологии у новорожденных г. Оренбурга доминировали стафилококки (76,2%), среди которых преобладали CoNS (82,4%) [4]. Из клинического материала от новорожденных в период пребывания в лечебных учреждениях

г. Перми в 77,9% была выделена грамположительная микрофлора с преобладанием стафилококков, среди которых доминировали CoNS (87,1%) [5].

Учитывая особенности защитных механизмов детей периода новорожденности, а особенно недоношенных, представляется важным оценить потенциальную угрозу со стороны Со№ госпитального происхождения, определив некоторые факторы патогенности этих бактерий.

Цель работы: изучение биологических характеристик штаммов коагулазонегативных стафилококков, циркулирующих в детском стационаре Н. Новгорода, а именно чувствительности к антимикробным препаратам (антибиотикам и бактериофагам), способности к образованию биопленок, выраженности внеклеточных факторов патогенности (протеазной и гиалуронидазной активности).

Материал и методы

В работе были использованы штаммы стафилококков, выделенные в стационаре в ходе текущей профилактической и лечебной работы от детей периода новорожденности (55) и из окружающей среды (2) в январе - марте 2016 г. Возраст детей составил от 1 часа жизни до 28 суток. Недоношенные дети, в том числе с экстремально низкой массой тела, рожденные на ранних сроках гестации, и доношенные были госпитализированы для дальнейшего выхаживания, в основном с диагнозом «перинатальная энцефалопатия и внутриутробная инфекция», особо тяжелые пациенты - в ОРИТ с применением искусственного дыхания методом продленной интубации. Микробиологический мониторинг включал взятие мазков из глаз, ушей, зева, носа и кожных складок при

Al

ЭдУД

поступлении в стационар и, при необходимости, в ходе лечения. У пациентов ОРИТ, находящихся на продленной интубации, анализы собирали с интубационных трубок еженедельно. Кровь на стерильность исследовали по клиническим показаниям. При положительных результатах для подтверждения или опровержения факта бактериемии проводили повторные заборы.

В ходе текущего мониторинга госпитальной среды осуществляли отбор проб с объектов внешней среды, с рук персонала.

Идентификацию штаммов проводили рутинными методами и методом времяпролетной MALDI-TOF масс-спектрометрии на масс-спектрометре Autoflex speed (Bruker Daltonics, Германия) с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0. Внешнюю калибровку проводили с использованием бактериального тест-стандарта (Bruker Daltonics, Германия), в качестве матрицы - а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (a-CHCA). Пробо-подготовка суточных культур исследуемых микроорганизмов проводилась методом прямого нанесения по стандартному протоколу, представленному в руководстве пользователя. О достоверности идентификации судили по значе-

ТАБЛИЦА 2.

Резистентность выделенных штаммов к антибиотикам (%)

Примечание: * - различия статистически значимы.

нию коэффициента совпадения Score values: 2,000-3,000 -идентификация до вида, 1,999-1,700 - идентификация до рода, 1,699-0 - идентификация не прошла) и значению категорий: А - достоверная идентификация до вида, В - достоверная идентификация до рода, С - недостоверный результат.

Чувствительность к антибиотикам: пенициллинам (окса-циллин, амоксициллин), аминогликозидам (амикацин), макролидам (азитромицин), линкозамидам (линкомицин), це-фалоспоринам 3-го поколения (цефтриаксон, цефотаксим, цефоперазон) и 4-го поколения (цефепим), гликопептидам (ванкомицин), карбопенемам (имипенем, меропенем) определяли диско-диффузионным методом. Литическую активность бактериофагов (секстафаг, пиобактериофаг поливалентный, интести-бактериофаг, пиобактериофаг комплексный, стафилококковый бактериофаг производства фирмы «Микроген») оценивали методом «стерильного пятна», учет результатов производили по 4-крестовой схеме с разделением на две группы: чувствительные - интенсивность лизиса «++++», «+++», «++», и устойчивые - отсутствие лизиса и слабочувствительные «+». Активность внеклеточных ферментов определяли по [6, 7]. Гиалуронидазную активность оценивали в полуколичественном тесте по диаметру зон лизиса гиа-луроновой кислоты в агарозе вокруг лунок с внеклеточными продуктами исследованных штаммов. Протеазную активность определяли количественно по оптической плотности (0П280) пептидов, образовавшихся в результате гидролиза казеина внеклеточными продуктами штаммов. Гемолитическую активность бактерий и их способность к формированию биопленки определяли по [8]. Способность к пленкообразованию исследуемых штаммов оценивали по прилипанию клеток к лункам пластикового планшета и интенсивности их окрашивания кристалвиолетом, которая измерялась в единицах оптической плотности при длине волны 540 нм. Степень пленкообразова-ния определяли по коэффициенту k, рассчитанному как отношение суммарной оптической плотности (0П540) опытных образцов к суммарной 0П540 контрольных.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ Microsoft Excel и Biostat 2009. Определяли показатель средних величин (М), стандартную ошибку средних величин этих показателей (m), достоверность различий показателей в сравниваемых группах с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Все исследованные штаммы были идентифицированы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии до вида с показателем Score больше 2,0, категория А. Совпадение с результатами рутинной идентификации составило 33,0%. Среди исследованных штаммов коагулазонегативных стафилококков преобладали S. epidermidis (66,7%), вторым по частоте выделения был вид S. haemolyticus (22,8%), также были единичные случаи обнаружения S. warneri и S. hominis (по 3 штамма). По ло-кусу выделения штаммы CoNS подразделены в таблице 1. В графе «раневое отделяемое» объединены изоляты из пупочной ранки и из очагов поражения на коже, штаммы из верхних дыхательных путей включали изоляты из зева, носа и отделяемого ушей, в качестве внешней среды были исследованы смывы с рук медперсонала и с пеленального столика. Следует отметить, что в этиологической структуре гнойно-септических инфекций новорожденных в родильных домах

ТАБЛИЦА 1.

Распределение штаммов с учетом источника выделения

Число выделенных штаммов

<Л 3 о (Л

№ Источник выделения о i_ ш Е СУ о СУ с с Е

m ф ф tО .с Э .с СП

1 Раневое отделяемое 21 16 3 2

2 Отделяемое глаз 11 9 2

3 Отделяемое верхних дыхательных путей 17 10 4 1 2

4 Кровь 3 2 1

5 Интубационные трубки 3 1 2

6 Внешняя среда 2 2

Антибиотики S. epidermidis (38) S. haemolyticus (13) Достоверность различия

Оксациллин 42,11±8,12* 84,64±10,42* р=0,007

Амоксициллин 21,0 5±6,70* 61,54±14,04* р=0,006

Цефтриаксон 42,11±8,12 61,54±14,04 р=0,234

Цефотаксим 44,74±8,17 61,54±14,04 р=0,305

Цефоперазон 10,53±5,05* 38,46±14,04* р=0,022

Цефепим 26,32±7,24* 76,92±12,16* р=0,0001

Имипенем 18,42±6,37* 53,85±14,39* р=0,013

Меропенем 23,68±6,99* 69,23±13,32* р=0,002

Амикацин 23,68±6,99 7,69±7,69 р=0,218

Азитромицин 31,58±7,64* 69,23±13,32* р=0,017

Ванкомицин 0 0

Линкомицин 26,32±7,24 7,69±7,69 р=0,165

NK

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

Н. Новгорода в 2007-2008 гг. среди CoNS также лидировал S. epidermidis (48,29%) [3], в клиническом материале от новорожденных г. Перми в 2006-2010 гг. доминировали S. epidermidis (22,0%) и S. haemolyticus (9,4%) [5]. Изучение видового состава CoNS в стационарах РФ в 2009-2010 гг. позволило сделать вывод об особой опасности S. epidermidis и S.haemolyticus как внутрибольничных патогенов, с необходимостью контроля в отделениях новорожденных также S. warneri, S. pasteuri, S. capitis [9].

Исследование антибиотикорезистентности культур CoNS показало, что все штаммы, за исключением одного -S.warneri, были чувствительны к ванкомицину, в отношении же других антибиотиков они проявляли различную степень резистентности. В таблице 2 представлены данные по антибиотикорезистентности двух лидирующих видов возбудителей ИСМП в нашем исследовании. Культуры S. haemolyticus чаще проявляли резистентность к антибиотикам пеницилли-нового ряда, карбапенемам, азитромицину, а также цефопе-разону и цефепиму, чем штаммы S. epidermidis. Следует отметить, что выделенные из внешней среды штаммы S.haemolyticus были чувствительны ко всем испытанным антибиотикам. Среди культур S. epidermidis полирезистентными (устойчивыми к трем и более антибиотикам) были 39,47±8,04%, а среди штаммов S. haemolyticus -84,62±10,42%, разница достоверна при р=0,004. Все клинические изоляты S. haemolyticus отличались полиантибиотико-резистентностью. Из трех штаммов S. hominis два были полирезистентными, а из трех культур S. warneri одна была устойчива к карбапенемам и амикацину. Высокий процент полирезистентных штаммов CoNS был отмечен в шести родовспомогательных учреждениях Н. Новгорода и Нижегородской области в 2007-2008 гг. (от 33,3 до 71,4%) [3], что соответствует

ТАБЛИЦА 3.

Показатели фагочувствительности выделенных штаммов

полученным нами данным. Что же касается стафилококков -возбудителей кожных и глазных форм инфекционно-воспа-лительной патологии новорожденных г. Оренбурга, то выделенные штаммы относительно редко проявляли резистентность к оксациллину, цефалоспоринам 1-3-го поколения (9,1% и 4,8-14,3% соответственно), но довольно часто - к линкомицину (34,7%), и частота встречаемости полиантиби-отикорезистентных штаммов не превышала 10% [4]. Эти показатели отличаются от полученных нами, что видимо обусловлено как региональными особенностями, так и условиями конкретных стационаров. Это лишний раз подчеркивает необходимость микробиологического мониторинга за госпитальными штаммами с изучением их качественных характеристик и антибиотикорезистентности.

Тестирование культур на чувствительность к бактериофагам показало, что большинство исследованных нами штаммов устойчиво к их действию (таблица 3). Лучшие результаты по фаголизису культур показали секстафаг, стафилококковый бактериофаг и пиобактериофаг поливалентный, причем штаммы S. haemolyticus чаще лизирова-лись секстафагом и пиобактериофагом поливалентным, чем штаммы S. epidermidis. В исследовании стафилококков, выделенных из клинического материала пациентов с ИСМП Н. Новгорода и Нижегородской области, также была отмечена низкая доля CoNS, чувствительных к стафилококковому (10,0%) и интести-бактериофагу (8,9%) [10].

Одним из показателей вирулентности культур бактерий является их гемолитическая активность (ГА). Учет радиуса зон лизиса вокруг колоний на кровяном агаре показал, что сильной ГА обладали все исследованные штаммы S. haemolyticus и S. hominis, а также 42,1% штаммов S. epidermidis. Слабую ГА проявляли культуры S. warneri и

Количество чувствительных штаммов

Бактериофаги S. epidermidis (38) S. haemolyticus(13) S. warneri (3) S. hominis(3)

абс. % абс. % абс. абс.

Стафилококковый 14 36,84±7,93 3 23,08±12,16 2 1

Пиобактериофаг комплексный 3 7,89±4,43 1 7,69±7,69 0 0

Интести-бактериофаг 2 5,26±3,67 1 7,69±7,69 0 0

Секстафаг 8 21,05±6,70*1 7 53,85±14,39*1 3 0

Пиобактериофаг поливалентный 5 13,16±5,56*2 5 38,46±14,04*2 1 0

Примечание: * - различия статистически значимы (1 - р=0,025; 2 - р=0,049). ТАБЛИЦА 4.

Показатели протеолитической активности и пленкообразования у выделенных штаммов

Выделенные штаммы Протеолитическая активность (ПА) Пленкообразование (ПО)

Число штаммов с ПА Значения ПА (е.а./мл) Число штаммов с ПО Значения ПО

S. epidermidis (38) (k) 0,813±0,094*1-3 35 4,345±0,400*4

S. haemolyticus (13) 9 0,125±0,058*1 13 6,086±0,640*4

S. hominis (3) 2 0,042±0,027*2 2 5,691±1,894

S. warneri (3) 2 0,029±0,021*3 3 3,726±0,940

Примечание: * - различия статистически значимы (1 - р=0,0001; 2 - р=0,028; 3 - р=0,025; 4 - р=0,027).

AI

SSM

34,2% штаммов S. epidermidis, а 23,7% эпидермальных стафилококков не обладали ГА. Следует отметить, что наличие ГА у штаммов S. epidermidis не было связано с локу-сом их выделения.

В качественном тесте у всех исследованных культур не была обнаружена гиалуронидазная активность, расценивающаяся как фактор патогенности с инвазивной функцией. Однако внеклеточные протеазы, способствующие гидролизу субстрата и облегчающие бактериальную инвазию, были выявлены у подавляющего большинства исследованных культур (табл. 4). Протеолитическая активность штаммов S. epidermidis по гидролизу казеина была значительно выше, чем у других культур.

Исследованные культуры в абсолютном большинстве обладали способностью к формированию биопленки, которую считали высокой при k>5, умеренной при значениях k от 2 до 5 (табл. 4). Наивысшей способностью к формированию биопленки обладал штамм S. epidermidis, выделенный из трахео-стомы (14,278), однако в целом наибольшие значения плен-кообразования показали штаммы S. haemolyticus, причем эти показатели были достоверно выше, чем у S. epidermidis.

Таким образом, циркулирующие в детском стационаре CoNS обладали выраженными патогенными и персистентными характеристиками - гемолитической, протеолитической активностями, способностью к формированию биопленки, что наряду с высокой долей антибиотикорезистентных культур создает предпосылки для формирования госпитальных штаммов.

Выводы

1. Среди коагулазонегативных стафилококков, выделенных в детском стационаре в январе - марте 2016 г., преобладали штаммы S. epidermidis и S. haemolyticus.

2. Исследованные CoNS отличались большой долей по-лиантибиотикорезистентных и устойчивых к бактериофагам штаммов. Культуры S. haemolyticus чаще проявляли антибиотикорезистентность к пенициллинам, карбапене-мам, цефалоспоринам и азитромицину, но лучше лизиро-вались секстафагом и пиобактериофагом поливалентным, чем штаммы S. epidermidis.

3. Исследованные культуры CoNS обладали гемолитической активностью, за исключением 23,7% штаммов S.epidermidis, не проявляли гиалуронидазную активность, но содержали внеклеточные протеазы. Уровень протеолитической активности по гидролизу казеина был достоверно выше у культур S. epidermidis.

4. Способность к формированию биопленки была выявлена у всех исследованных штаммов S. haemolyticus и у 92,1% S. epidermidis. Степень пленкообразования была выше у культур S. haemolyticus, чем у S. epidermidis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Митрофанова Н.Н., Мельников В.Л., Слётов М.М. Анализ данных микробиологического мониторинга в многопрофильном стационаре. Медицинский альманах. 2009. № 2. С. 90-92.

Mitrofanova N.N., Mel'nikov V.L., Slyotov M.M. Analiz dannyh mikro-biologicheskogo monitoringa v mnogoprofil'nom stacionare. Medicinskij al'manah. 2009. № 2. S. 90-92.

2. Сергевнин В.И., Клюкина Т.В., Ключарева Н.М. и др. Чувствительность возбудителей внутрибольничных гнойно-септических инфекций к дезинфицирующим средствам и антибиотикам. Журнал микробиологии. 2014. № 4. С. 61-65.

Sergevnin V.l., Klyukina T.V., Klyuchareva N.M. idr. CHuvstvitel'nost' voz-buditelej vnutribol'nichnyh gnojno-septicheskih infekcij k dezinficiruyush-chim sredstvam i antibiotikam. ZHurnal mikrobiologii. 2014. № 4. S. 61-65.

3. Благонравова А.С., Воробьева О.Н., Ковалишена О.В. и др. Эпидемиологические и микробиологические аспекты госпитальных гнойно-септических инфекций новорожденных, обусловленных коагулазоотрицательными стафилококками. Медицинский альманах. 2009. № 2. С. 72-75.

BlagonravovaA.S.,Vorob'evaO.N.,KovalishenaO.V.idr.Epidemiologicheskie i mikrobiologicheskie aspekty gospital'nyh gnojno-septicheskih infekcij novorozhdennyh, obuslovlennyh koagulazootricatel'nymi stafilokokkami. Medicinskij al'manah. 2009. № 2. S. 72-75.

4. Гриценко В.А., Бирюкова Т.В., Вялкова А.А., Иванов Ю.Б. Видовая структура и характеристика биопрофиля стафилококков - возбудителей перинатальной инфекционно-воспалительной патологии у детей Оренбурга. Журнал микробиологии. 2014. № 5. С. 90-95.

Gricenko V.A., Biryukova T.V., Vyalkova A.A., Ivanov YU.B. Vidovaya struktura i harakteristika bioprofilya stafilokokkov - vozbuditelej perinatal'noj infekcionno-vospalitel'noj patologii u detej Orenburga. Zhurnal mikrobiologii. 2014. № 5. S. 90-95.

5. Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Авдеева Н.С. Мониторинг колонизации условно-патогенной микрофлорой новорожденных в период пребывания в лечебных учреждениях. Медицинский альманах. 2011. № 6. С. 156-159.

Kuznecova M.V., Karpunina T.I., Avdeeva N.S. Monitoring kolonizacii uslovno-patogennoj mikrofloroj novorozhdennyh v period prebyvaniya v lechebnyh uchrezhdeniyah. Medicinskij al'manah. 2011. № 6. S.156-159.

6. Беляева Е.В., Борискина Е.В., Ермолина Г.Б. и др. Биологическая характеристика бактерий, колонизирующих слизистые оболочки дыхательных путей, при хронических заболеваниях. Медицинский альманах. 2009. № 2. С. 114-117.

Belyaeva E.V., Boriskina E.V., Ermolina G.B. i dr. Biologicheskaya harak-teristika bakterij, koloniziruyushchih slizistye obolochki dyhatel'nyh putej, pri hronicheskih zabolevaniyah. Medicinskij al'manah. 2009. № 2. S. 114-117.

7. Ермолина Г.Б. Простые количественный и качественный методы определения внеклеточной гиалуронидазы бактерий. Лабораторное дело. 1986. № 11. С. 691-692.

Ermolina G.B. Prostye kolichestvennyj i kachestvennyj metody opredeleniya vnekletochnoj gialuronidazy bakterij. Laboratornoe delo. 1986. № 11. S. 691-692.

8. Кузнецова М.В., Николоаева Н.В., Розанова С.М., Карпунина Т.И. Формирование биопленок нозокомиальными штаммами Pseudomonas aeruginosa. Журнал микробиологии. 2011. № 4. С. 8-14.

Kuznecova M.V., Nikoloaeva N.V., Rozanova S.M., Karpunina T.I. Formirovanie bioplenok nozokomial'nymi shtammami Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii. 2011. № 4. S. 8-14.

9. Воронина О.Л., Кунда М.С., Дмитренко О.А. и др. Оценка видового разнообразия коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2009-2010 гг. Журнал микробиологии. 2011. № 1. С. 3-8.

Voronina O.L., Kunda M.S., Dmitrenko O.A. i dr. Ocenka vidovogo raz-noobraziya koagulazootricatel'nyh stafilokokkov, vydelennyh v staciona-rah Rossijskoj Federacii v 2009-2010 gg. Zhurnal mikrobiologii. 2011. № 1. S. 3-8.

10. Чанышева Р.Ф., Ковалишена О.В. Состояние фагочувствительности стафилококков - возбудителей инфекций в медицинских организациях Нижегородской области. Медицинский альманах. 2014. № 2. С. 32-35.

Chanysheva R.F., Kovalishena O.V. Sostoyanie fagochuvstvitel'nosti stafilokokkov - vozbuditelej infekcij v medicinskih organizaciyah Nizhegorodskoj oblasti. Medicinskij al'manah. 2014. № 2. S. 32-35. [ТЧ