CC BY
38
MICROBIOLOGY
© СУЖАЕВА Л.В., ЕГОРОВА С.А., 2020
Сужаева Л. В. , Егорова С. А.
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА ДЕТЕЙ
ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора, 197101, Санкт-Петербург, Россия
Исследования последних лет свидетельствуют, что резистентность бактерий существовала задолго до того, как антимикробные препараты (АМП) стали применять в клинической практике, устойчивостью к АМП обладают не только патогенные микроорганизмы. Изучены 511 штаммов E. coli, выделенные из микробиоты кишечника детей в возрасте от 1 мес до 17лет, проживающих в Санкт-Петербурге: определена чувствительность штаммов к 15 АМП диско-диффузионным методом, чувствительность к 6 коммерческим бактериофагам производства НПО «Микроген». Методом мультиплексной ПЦР проведён поиск генов, кодирующих b-лактамазы молекулярных классов ТЕМ, SHV, OXA, СТХ-М. 39,3% штаммов характеризовались устойчивостью к 1 и более классам АМП. Доля полирезистентных (устойчивых к 3 и более классам АМП) составляла 16,6%. Полирезистентны к клинически значимым группам АМП (цефалоспорины расширенного спектра (ЦРС) + фторхинолоны + аминогликозиды) 0,8% штаммов. Устойчивость к аминопенициллинам выявлена у 29,5% штаммов, ЦРС -11,2°%, фторхинолонам -13,3%, тетрациклину - 20°%, хлорамфениколу - 9,8%, амино-гликозидам - 2,5%. Резистентность к b-лактамам обусловлена продукцией b-лактамаз: к ампициллину - молекулярного семейства ТЕМ (81,9%), ЦРС - молекулярного семейства CTX-M (87,7%) групп CTX-M1 (66%) и CTX-M9 (34%). 43,5% полирезистентных штаммов E. coli чувствительны как минимум к одному из 6 коммерческих бактериофагов. Исследование показало, что микробиота кишечника детей является важным резервуаром штаммов E. coli, обладающих резистентностью (в т. ч. множественной) к АМП различных классов. Терапия бактериофагами является альтернативным методом эрадикации устойчивых к антибиотикам штаммов E. coli.
Ключевые слова: микробиота кишечника; E. coli, антибиотикорезистентность; b-лактамазы; бактериофаги; ТЕМ; SHV; OXA; СТХ-М.
Для цитирования: Сужаева Л. В., Егорова С. А. Резистентность к антимикробным препаратам штаммов Escherichia coli, выделенных из микробиоты кишечника детей. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65 (10): 638-644. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-10-638-644 Suzhaeva L. V., Egorova S. А.
ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF ESCHERICHIA COLI, ISOLATED FROM CHILDREN'S INTESTINAL MICROBIOTA
Saint-Petersburg Pasteur Institute, 197101, Saint-Petersburg, Russia
Recent studies have shown that bacterial resistance existed long before antimicrobials were used in medicine, and not only pathogens are resistant to antibiotics. 511 strains of E. coli isolated from the intestinal microbiota of children aged 1 month to 17 years living in St. Petersburg were studied: the .susceptibility to 15 antibiotics was determined by the disk diffusion method, as well as the susceptibility to 6 commercial bacteriophages produced by «Microgen» (Russia). The b-lactamase genes of molecular families TEM, SHV, OXA, and CTX-M were detected by multiplex PCR. 39,3% E. coli isolates were resistant to one or more antimicrobial classes. The proportion of multidrug resistant isolates (resistant to 3 or more classes) was 16,6%. Multidrug resistance to clinically significant antimicrobial classes (extended-spectrum cephalosporins (ESC) + fluoroquinolones + aminoglycosides) was detected in 0,8% isolates. Resistance to aminopenicillins was detected in 29,5%, ESC - 11,2%, fluoroquinolones - 13,3%, tetracycline - 20,0%, chloramphenicol - 9,8%, aminoglycosides - 2,5% isolates. b-lactam resistance was due to the beta-lactamase production: to ampicillin - the molecular family TEM (81,9%), ESC - the CTX-M molecular family (87,7%) CTX-M1 - (66%) and CTX-M9 groups (34%). 43,5% multidrug resistant E. coli isolates were susceptible to at least one of the six commercial bacteriophages produced by «Microgen». The study showed that the intestinal microbiota of children is an important reservoir of E. coli resistant (including multidrug resistance) to various classes of antibiotics, and bacteriophage therapy is an alternative method for eradication of antibiotic-resistant E. coli.
Key words: intestinal microbiota; E. coli; antibiotic resistance; beta-lactamases; bacteriophages; TEM; SHV; OXA; CTX-M. For citation: Suzhaeva L. V., EgorovaS. А. Antimicrobial resistance of Escherichia coli, isolatedfrom children's intestinal microbiota. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2020; 65 (10): 638-644 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-10-638-644
For correspondence: SuzhaevaL.V., junior researcher of laboratory of enteric infections; e-mail: slv2211@yandex.ru Information about authors:
Suzhaeva Ludmila V., https://orcid.org/0000-0001-7292-9933; Egorova Svetlana A., https://orcid.org/0000-0002-7589-0234.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgment. The study had no sponsorship.
Received 19.06.2020 Accepted 22.06.2020
Для корреспонденции: Сужаева Людмила Валерьевна, мл. науч. сотр. лаб. кишечных инфекций; e-mail: slv2211@yandex.ru
Резистентность к антимикробным препаратам (АМП) у возбудителей инфекционных болезней - растущая угроза здравоохранению, представляющая проблему для многих стран и сфер деятельности [1]. Одной из стратегических целей Глобального плана действий по борьбе с устойчивостью к АМП, принятого Всемирной ассамблеей здравоохранения, является совершенствование глобального мониторинга резистентности. В различных географических районах действуют региональные программы мониторинга резистентности возбудителей, вызывающих инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (EARS-Net, CAESAR, ReLAVRA), а также заболеваний, передающихся с пищевыми продуктами (NARMS, CIPARS, EFSA/ECDC) [1 - 4]. В руководстве ВОЗ по осуществлению глобального мониторинга перечислены виды биологического материала, возбудители, АМП, приоритетные для мониторинга резистентности в повседневной практике. Escherichia coli, выделенная из образцов крови, спинно-мозговой жидкости, мочи, отнесена к приоритетным возбудителям [5].
E. coli — широко распространённый микроорганизм, обитающий в кишечнике человека и животных [6], поверхностных водоёмах [7], почве [8]. Некоторые представители вида являются возбудителями диарей и заболеваний внекишечной локализации [9]. Антимикробная терапия является основой этиотропного лечения эшери-хиозов (тяжёлых форм диареи, циститов, пиелонефритов, сепсиса, менингита), мониторинг резистентности E. coli к АМП вызван необходимостью эффективного лечения этих заболеваний [10].
Больничная среда традиционно рассматривается как источник антибиотикорезистентных микроорганизмов. Исследования последних лет свидетельствуют, что резистентность существовала задолго до того, как АМП стали применять в клинической практике, устойчивостью к АМП обладают не только патогенные микроорганизмы. В микробиоме слюны и фекалий здоровых добровольцев обнаружены гены резистентности к 13 АМП [11]. Ми-кробиом кишечника является резервуаром детерминант резистентности и имеет благоприятные условия для их передачи путём горизонтального переноса, в том числе и патогенным микроорганизмам [12]. Приобретают актуальность исследования резистентности к АМП бактерий ми-кробиоты кишечника, расширяющие представления о механизмах её формирования и способах распространения.
Важной проблемой в лечении бактериальных инфекций является появление бактерий с множественной лекарственной устойчивостью. Ввиду высокой скорости её формирования снизился коммерческий интерес к разработке и производству новых АМП. В 2017 г. ВОЗ опубликовала перечень приоритетных патогенных микроорганизмов, для борьбы с лекарственной устойчивостью которых необходима разработка новых фармакологических препаратов. Одну из первых позиций в этом перечне занимают E. coli, устойчивые к цефалоспори-нам расширенного спектра (ЦРС) и карбапенемам. Из 32 новых АМП, находящихся в стадии разработки, только два активны против этих грамотрицательных бактерий [13]. В поисках альтернативных стратегий борьбы с лекарственной устойчивостью бактерий возобновился интерес к терапии бактериофагами. Отсутствие достаточного количества правильно спланированных рандо-минизированных исследований, свидетельствующих об их эффективности и безопасности, ограничивают их широкое использование [14].
МИКРОБИОЛОГИЯ
Цель - определить чувствительность к АМП штаммов E. coli, выделенных из микробиоты кишечника детей, проживающих в Санкт-Петербурге.
Материал и методы. Исследовано 511 штаммов E. coli, выделенных из микробиоты кишечника детей в возрасте от 1 мес до 17 лет, проживающих в Санкт-Петербурге. Диско-диффузионным методом (ДДМ) с использованием среды Мюллера-Хинтон и дисков производства Oxoid (Великобритания) согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», версии 2014, 2015 гг. определена чувствительность к 15 АМП (ампициллин, цефтазидим, цефотаксим, цефепим, меро-пенем, налидиксовая кислота, ципрофлоксацин, гента-мицин, тобрамицин, амикацин, нитрофурантоин, тетрациклин, хлорамфеникол, фосфомицин, триметоприм/ сульфаметоксазол), относящихся к семи классам АМП. Согласно Федеральным клиническим рекомендациям «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике» оценена чувствительность к 6 коммерческим бактериофагам производства АО НПО «Микроген»: бактериофаг коли (Пермь), колипротейный бактериофаг (Нижний Новгород), пи-обактериофаг поливалентный (Уфа), секстафаг® пио-бактериофаг поливалентный (Пермь), пиобактериофаг комплексный (Нижний Новгород), интести-бактериофаг (Нижний Новгород).
Фенотипическая детекция b-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) и цефалоспориназ молекулярного класса С (AmpC) проведена путём выявления синергизма с ингибиторами b-лактамаз (клавулановая кислота, клоксациллин) в формате теста с двумя дисками и с использованием набора «ESBL+AmpC screen disc kit» (Liofilchem, Италия). Методом мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией со специфическими праймерами проведён поиск генов, кодирующих b-лактамазы молекулярных классов ТЕМ, SHV, OXA, СТХ-М согласно ранее опубликованным протоколам
[15].
Достигнутый уровень значимости различий определён с использованием критерия сопряженности %2 Пирсона. 95% доверительные интервалы долей и частот рассчитаны методом Уилсона.
Результаты. Анализ результатов определения чувствительности штаммов E. coli к АМП показал, что 60,7% (95%ДИ:56,4-64,8) изолятов чувствительны ко всем исследованным АМП, 39,3% (95%ДИ:35,2-43,6) -характеризовались устойчивостью к 1 и более классам АМП. Доля штаммов, резистентных к 1 или 2 классам составила 22,7% (95%ДИ:19,3-26,5), полирезистентных (устойчивых к 3 и более классам АМП) - 16,6% (95%ДИ:13,7-20,1) (рис. 1.) Доля устойчивых штаммов, выделенных из фекалий детей разных возрастных групп, значимо не отличалась (%2=5,967; df=3; р=0,113) и находилась в пределах от 31,3 до 46,0%. Доля полирезистентных изолятов находилась в пределах от 12 до 23% и не имела значимых отличий (%2=5,223; df=3; р=0,156).
Доли штаммов, устойчивых к различным классам АМП, не одинаковы. Наибольшие доли резистентных штаммов выявлены по отношению к аминопеницилли-нам и тетрациклинам (29,5% и 20% соответственно), наименьшие - к аминогликозидам и нитрофуранам (2,5% и 0,8%, соответственно). Доля изолятов, устойчивых к ЦРС, составила 11,2%, хинолонам - 13,3%, три-метоприм/сульфаметоксазолу - 12,1%, хлорамфениколу
MICROBIOLOGY
Рис. 1. Доля штаммов Escherichia coli, чувствительных и резистентных к различному количеству классов АМП (%). S
- чувствительные ко всем исследуемым классам АМП; R(1)
- резистентные к одному классу АМП; R(2) - резистентные к двум классам АМП; R(3) - резистентные к трём и более классам АМП.
- 9,8%. Не выявлены штаммы, нечувствительные к кар-бапенемам и фосфомицину,
Резистентность к АМП различных классов отличалась у штаммов, устойчивых и чувствительных к ампициллину. Доля штаммов, резистентных к ЦРС, хиноло-нам, аминогликозидам, триметоприм/сульфаметоксазо-лу, хлорамфениколу, тетрациклину, значительно выше у резистентных к ампициллину штаммов (рис. 2). Частота выявления полирезистентных штаммов среди ампицил-линустойчивых изолятов составила 55% (95%ДИ:47,0-62,7), что значительно отличается от такого показателя среди чувствительных штаммов - 0,6% (95%ДИ: 0,2-2,0).
Подобные отличия отмечены у штаммов, кластеризованных по принципу чувствительности и нечувствительности ко всем остальным исследуемым классам АМП. Впечатляет доля полирезистентных изолятов среди штаммов, резистентных к аминогликозидам, ЦРС, хлорамфениколу, триметоприм/ сульфаметоксазолу (100%, 86%, 82%, 87%, соответственно) в отличие от долей среди штаммов, чувствительных к каждому из этих АМП (14,5%, 7,9%, 9,5%, 6,9% соответственно).
У штаммов, устойчивых к исследуемым АМП, выявлено 44 фенотипа резистентности: к одному классу АМП
- 6 фенотипов; двум классам - 8 фенотипов; трём классам - 11 фенотипов; четырём классам - 8 фенотипов; пяти классам - 6 фенотипов; шести классам - 3 фенотипа; семи классам - 2 фенотипа. Часто встречался фенотип устойчивости к одному классу АМП - к ампициллину (7,8%). Доля остальных фенотипов варьировала от 0,2 до 2,5%. Фенотипы множественной резистентности чаще всего содержали ампициллин (97,6%), тетрациклин (70,6%), триметоприм/сульфаметоксазол (63,5%).
При изучении 94 штаммов E. coli, устойчивых к ампициллину (чувствительных к ЦРС), выявлены гены b-лактамаз (bla) различных молекулярных классов. У 81,9% устойчивых штаммов выявлены bla-гены, кодирующие b-лактамазы молекулярного семейства ТЕМ, у 7,4% штаммов - ОХА, у 1,1% штаммов - SHV. У 3,2% штаммов одновременно выявлены гены ТЕМ и ОХА. У 12,8% штаммов гены известных b-лактамаз выявить не удалось. Наиболее распространённым механизмом резистентности к аминопенициллинам у штаммов E. coli является продукция БЛРС молекулярного семейства ТЕМ, что совпадает с данными литературы.
ТЕТ ЦРС ТРМ ХИН ХЛР АМГ MDR
АМП и группы АМП R к АМП ■ S к АМП
Рис. 2. Резистентность к различным АМП штаммов Escherichia coli, чувствительных и резистентных к ампициллину. R к АМП - резистентные к ампициллину; S - чувствительные к ампициллину; ТЕТ - тетрациклин; ЦРС - цефалоспорины расширенного спектра; ТРМ - триметоприм/сульфометокса-зол; ХИН - хинолоны; ХЛР - хлорамфеникол; АМГ - амино-гликозиды; MDR - полирезистентные штаммы.
При изучении 57 штаммов E. coli, устойчивых к ампициллину и ЦРС, на первом этапе использованы феноти-пические подтверждающие тесты, которые у 56 штаммов подтвердили продукцию БЛРС (синергизм с клавулано-вой кислотой) и у 1 штамма - продукцию b-лактамазы молекулярного класса С (синергизм с клоксациллином). У 87,7% штаммов, устойчивых к ампициллину и ЦРС, обнаружены bla-гены, кодирующие продукцию БЛРС молекулярного семейства СТХ-М, из них 22,8% штаммов продуцировали только СТХ-М, остальные 64,9% штаммов сочетали продукцию СТХ-М с другими b-лактамазами (ТЕМ, SHV, OXA). У 5,3% штаммов выявлены гены только молекулярного класса ТЕМ, у 3,5% - молекулярных классов ТеМ и SHV. У штамма с фенотипически подтверждённой продукцией b-лактамазы молекулярного класса С выявлены гены, кодирующие продукцию AmpC-цефалоспориназы CMY и ТЕМ. У одного изолята гены известных b-лактамаз выявить не удалось.
Гены БЛРС молекулярного семейства СТХ-М преимущественно представлены молекулярной группой СТХ-М1 (66%), СТХ-М9 (34%). Штаммы E. coli, обладающие генами цефотаксимаз, в большинстве случаев имели гены и других b-лактамаз. В группе изолятов с генами молекулярной группы СТХ-М9 они обнаружены у 94,1% штаммов, с генами СТХ-М1 - у 63,6% штаммов (Х2=5,967; df=3; />=0,113). Штаммы, обладающие генами БЛРС молекулярных групп СТХ-М1 и СТХ-М9, имели различную устойчивость к хлорамфениколу, тримето-прим/сульфаметоксазолу, хинолонам, аминогликозидам. Доля штаммов, резистентных к хлорамфениколу, триме-топрим/сульфаметоксазолу, аминогликозидам, в группе с СТХ-М1 меньше, чем в группе СТХ-М9. Доля штаммов резистентных к хинолонам, в группе с СТХ-М1 выше, чем в группе СТХ-М9. Устойчивость к остальным исследуемым АМП в указанных группах не отличалась.
В исследуемой популяции E. coli частота встречаемости штаммов, содержащих b-лактамазы различных
МИКРОБИОЛОГИЯ
Рис. 3. Сочетания генов b-лактамаз различных молекулярных классов.
молекулярных семейств, составила 27%. b-лактамазы семейства ТЕМ обнаружены у 22,7%, SHV - у 2,9%, OXA - у 2,5%, СТХ-М - у 9,8%, AmpC - у 0,19% штаммов. Сочетанная продукция b-лактамаз выявлена у 8,4% штаммов. Сочетания этих ферментов представлены 7 фенотипами (рис. 3). Доли штаммов E. coli, содержащих гены b-лактамаз различных молекулярных семейств и их сочетания, статистически значимо не отличались в группах детей разного пола и возраста.
При оценке чувствительности 511 штаммов E. coli к шести коммерческим препаратам на основе бактериофагов выявлено, что к действию бактериофага коли чувствительны 33,7% штаммов, коли-протейного бактериофага - 11,2%, пиобактериофага поливалентного - 16,2%, секстафага - 10,6%, пиобактериофага комплексного -6,8%, интести-бактериофага - 13,7%.
К одному из исследуемых бактериофагов чувствительны 17,2% штаммов, к двум - 11,4%, к трём - 6,7%, к четырём - 4,7%, к пяти - 1,8%, к шести - 0,8%. Минимум к одному из исследуемых бактериофагов чувствительны 42,5% штаммов E. coli.
Доля штаммов, чувствительных к бактериофагам, среди E. coli, чувствительных и резистентных к различным классам АМП, значимо не отличалась по отношению ко всем исследуемым бактериофагам, за исключением секстафага. Секстафаг чаще оказывал литическое действие на штаммы, чувствительные к ампициллину (13,1 %), ЦРС (11,7%), хинолонам (11,7%), тетрациклину
Рис. 4. Чувствительность полирезистентных штаммов Escherichia coli к коммерческим препаратам на основе бактериофагов. 1 - бактериофаг коли (Пермь), 2 - колипротейный бактериофаг (Нижний Новгород), 3 - пиобактериофаг поливалентный (Уфа), 4 - секстафаг® пиобактериофаг поливалентный (Пермь), 5 - пиобактериофаг комплексный (Нижний Новгород), 6 - интести-бактериофаг (Нижний Новгород).
(12%) по сравнению с резистентными к этим препаратам штаммами (4,6%, 1,8%, 2,9%, 4,9% соответственно).
Доля штаммов, чувствительных к каждому из исследуемых бактериофагов, значимо не отличалась у штаммов, резистентных к разному количеству классов АМП (см. таблицу). Доля штаммов, чувствительных как минимум к одному из исследуемых бактериофагов, среди полирезистентных штаммов составила 43,5%, среди БЛРС-продуцирующих штаммов - 44,0%. Полирезистентные штаммы чаще чувствительны к бактериофагу коли (24,6%). Чувствительность к поливалентным препаратам на основе бактериофагов варьировала от 4,3 до 10,1% (рис. 4).
Обсуждение. Сравнение показателей устойчивости штаммов E. coli к 15 АМП показало, что исследуемые штаммы наиболее часто резистентны к ампициллину и тетрациклину.
По данным литературы устойчивость к аминопе-нициллинам по сравнению с другими классами АМП имеет самые высокие показатели среди госпитальных штаммов E. coli, выделенных из крови и спинномозговой жидкости, среди изолятов, выделенных из мочи при инфекциях мочевыводящих путей (ИМП) [1, 16]. Резистентность к ампициллину у таких штаммов значи-
Доля (%) штаммов E. coli, чувствительных к действию коммерческих бактериофагов
Наименование бактериофагов Количество классов антибиотиков, к которым резистентны E. coli Всего X2
0 (n=310) 1 (n=73) 2 (n=43) 3 (n=35) 4 (n=22) 5 (n=14) 6 (n=12) 7 (n=2) n=511 (df=7) P
Бактериофаг коли 36,8 35,6 30,2 28,6 27,3 7,1 16,7 0 33,7 9,481 0,220
Колипротейный бактериофаг 11,3 9,6 7,0 11,4 13,6 21,4 16,7 0 11,2 3,193 0,867
Пиобактериофаг поливалентный 18,1 11,0 14,0 17,1 13,6 14,3 8,3 50,0 16,2 4,817 0,682
Секстафаг 13,5 11,0 2,3 5,7 4,5 0 0 0 10,6 11,042 0,137
Пиобактериофаг комплексный 6,1 6,8 9,3 8,6 13,6 7,1 0 0 6,8 3,44 0,842
Интести-бактериофаг 17,4 11,0 2,3 11,4 9,1 0 8,3 0 13,7 12,178 0,095
MICROBIOLOGY
тельно выше, чем у исследованных нами изолятов, выделенных из микробиоты кишечника (93% и 68% против 29%, соответственно). Данная ситуация выглядит вполне закономерной, так как препаратами стартовой терапии заболеваний этой локализации у пациентов детского возраста являются именно b-лактамные АМП, что способствует увеличению селективного давления и росту резистентности возбудителя к данной группе АМП.
Сравнение полученных результатов с данными литературы показало, что устойчивость к ампициллину диареегенных штаммов E. coli некоторых патотипов (энтеропатогенные, EPEC; энтеротоксигенные, ETEC) не отличается от таковой у штаммов, выделенных из микробиоты кишечника, у энтероинвазивных E. coli (EI-EC) значительно превышает таковую [17]. Вероятно, это связано с тем, что EIEC вызывает более тяжёлое клиническое течение болезни по сравнению с EPEC и ETEC и для лечения таких диарей чаще используются АМП.
Сравнение резистентности к ампициллину штаммов, выделенных из микробиоты кишечника здоровых детей в различных географических регионах, показало, что доля устойчивых штаммов в Санкт-Петербурге (29,5%) значительно ниже, чем в странах Африки и Азии (Ливия - 73% [18], Тайвань - 70,1% [19], Вьетнам - 65% [20], Индия - 63,7% [21] ), но выше, чем в европейских странах (Германия - 16,5%) [22]. Анализ данных литературы показывает, что в странах Азиатско-Тихоокеанского региона количество потребляемых АМП значительно выше, чем в странах Европы [23-25].
Исследование показало, что устойчивые к аминопе-нициллинам штаммы значительно чаще резистентны к другим классам АМП в отличие от чувствительных изолятов. Аналогичная картина характерна и для штаммов, устойчивых к ЦРС , что согласуется с общемировыми тенденциями [19, 21, 22].
Основным механизмом резистентности штаммов E. coli к аминопенициллинам является выработка БЛРС [26]. Наиболее распространёнными b-лактамазами, выявленными в данной работе, являются b-лактамазы молекулярного семейства TEM (81,9%).
Доля штаммов, устойчивых к ЦРС, составила 11,2%, что значительно ниже, чем среди госпитальных штаммов E. coli (72,6%) [27] и штаммов, выделенных при внеболь-ничных ИМП (20%) [16]. Вероятно, это связано с частым использованием этих АМП в качестве препаратов стартовой терапии различных инфекционных заболеваний у детей. Доля штаммов E. coli, устойчивых к ЦРС, в нашем исследовании сопоставима с показателями для штаммов, выделенных из микробиоты кишечника здоровых жителей стран Европы (Германии, Франции, Испании, Швеции, Венгрии, Австралии, Португалии), США, Аргентины, где она составляет 5-10%. Указанная доля значительно выше у жителей стран Азии (Тайланда, Вьетнама, Китая, Индии) и Мексики - 40-60%. Появление таких штаммов в микробиоте кишечника здоровых людей связано с предшествующим приёмом АМП данной группы, эпизодами пребывания в стационаре, употреблением пищевых продуктов и воды, контаминированных устойчивыми микроорганизмами, путешествием в страны с высокой распространенностью БЛРС-продуцирующих бактерий, профессиональной деятельностью в животноводстве (особенно в птицеводстве и свиноводстве), контактом с домашними животными [28].
Механизм устойчивости к ЦРС обусловлен в 87,7% случаев выработкой БЛРС молекулярного семей-
ства СТХ-М, групп СТХ-М1 (66%) и СТХ-М9 (34%). b-лактамазы молекулярных групп СТХ-М2, СТХ-М8, СТХ-М25 не выявлены. Полученные результаты отражают мировые тенденции распространения энтеро-бактерий, продуцирующих b-лактамазы молекулярной группы СТХ-М1, которые доминируют практически во всех регионах мира за исключением Китая, Юго-Восточной Азии, Южной Кореи, Японии, Испании, где преобладает группа СТХ-М9, Южной Америки, где преобладает группа СТХ-М2 [29].
Среди штаммов, устойчивых к ЦРС, доля полирезистентных значительно выше (86,0%) по сравнению с аналогичной долей у чувствительных к этим АМП штаммов (7,9%). Вероятно, плазмиды, несущие гены цефотаксимаз, содержат гены, определяющие резистентность к другим классам препаратов (хинолонам, аминогликозидам, тетрациклину, хлорамфениколу, три-метоприм/сульфаметоксазолу) [30].
Вызывает интерес устойчивость штаммов E. coli, выделенных из микробиоты кишечника детей, к тетрациклину - препарату, в настоящее время не используемому в педиатрической практике и редко применяемому у взрослых. Устойчивость к нему одинаково часто встречалась у штаммов, выделенных от детей в возрасте 1 мес и от детей дошкольного и школьного возраста. Вероятно, младенец приобретает такие штаммы от матери, так как кишечник новорожденного при естественных родах заселяется преимущественно «материнскими» микроорганизмами. В организме матери штаммы E. coli могли приобрести устойчивость к тетрациклину, остаточные количества которого содержатся в пищевых продуктах вследствие его использования в ветеринарии и животноводстве [31]. Аналогичный механизм формирования резистентности у штаммов E. coli в микробиоте кишечника нельзя исключить и у детей более старшего возраста.
В нашем исследовании резистентные к ципрофлокса-цину штаммы E. coli выявлены лишь в 2,9% случаев, что значительно отличается от показателей резистентности штаммов, вызывающих ИСМП (65,6%) и ИМП (17,6%) [27, 16]. Возможно, резистентные штаммы приобретены детьми от матери в момент рождения, поскольку детский и подростковый возраст является противопоказанием для приёма препаратов из группы хинолонов из-за риска нарушения формирования костно-мышечной системы [32].
Оценка чувствительности выделенных штаммов E. coli к коммерческим бактериофагам не выявило значимых отличий у штаммов в зависимости от чувствительности к различным классам АМП и их количеству. 43,5% полирезистентных штаммов чувствительны, как минимум к одному из шести исследуемых бактериофагов, что позволяет считать, что терапия бактериофагами является альтернативным методом эрадикации устойчивых к АМП штаммов E. coli.
Литическим действием на полирезистентные штаммы чаще обладал бактериофаг коли (24,6%), в отличие от остальных фагов, чувствительность к которым не превышала 10,1%. Можно предположить, что титр ко-лифага в моновалентном препарате бактериофага выше, чем в поливалентном в пересчёте на единицу объёма. Различия в чувствительности могут быть обусловлены различиями самих фаговых коктейлей у разных заводов-производителей ввиду использования ими в процессе изготовления отличающихся коллекций штаммов-«хозяев». Коллекции состоят из клинических штаммов,
выделенных при различных заболеваниях, вызванных E. coli, а исследуемые нами штаммы таковыми не являются. Нельзя не упомянуть о региональной специфичности фагов в отношении вида E. coli, отличающегося широким внутривидовым разнообразием [33]. Несмотря на объективно существующие ограничения, фаготерапия представляется перспективным методом борьбы с устойчивыми к АМП штаммами E. coli, учитывая растущий опыт создания препаратов бактериофагов с наибольшей литической активностью по отношению к целевому патогену и возможность локальной адаптации этих препаратов [34].
Выводы. При изучении чувствительности к АМП штаммов E. coli, выделенных из микробиоты кишечника детей, установлено, что 39,3% штаммов резистентны к АМП, причём 16,6% имеют множественную устойчивость к 3 и более классам. Одновременно устойчивы к клинически значимым группам АМП (ЦРС + фторхино-лоны + аминогликозиды) 0,8% штаммов. Устойчивость к b-лактамам (АМП часто используемым в педиатрической практике) выявлена у 29,5% штаммов, включая 11,2% устойчивых к ЦРС. Резистентность к b-лактамам обусловлена продукцией b-лактамаз: к ампициллину -молекулярного семейства ТЕМ (81,9%), ЦРС - молекулярного семейства CTX-M (87,7%) групп CTX-M1 (66%) и CTX-M9 (34%).
При изучении чувствительности полирезистентных штаммов E. coli к коммерческим бактериофагам производства НПО «Микроген» выявлено, что 43,5% этих штаммов чувствительны как минимум к одному из тестируемых бактериофагов. Литической активность чаще обладал бактериофаг коли, в сравнении с другими препаратами бактериофагов, содержащих в своем составе фаги против E. coli.
Исследование показало, что микробиота кишечника детей является важным резервуаром штаммов E. coli, обладающих резистентностью (в т. ч. множественной) к АМП различных классов. Появление таких штаммов в микробиоте кишечника может быть связано с их приобретением в момент рождения от матери, предшествующим приёмом АМП, эпизодами пребывания в стационаре, употреблением пищевых продуктов и воды, контаминированных устойчивыми микроорганизмами, путешествием в страны с высокой распространённостью резистентных к АМП штаммов. Устойчивые к АМП аутоштаммы E. coli могут быть причиной инфекции у ослабленных детей и пациентов отделений интенсивной терапии, могут передавать гены резистентности патогенным микроорганизмам. Дальнейшее изучение резистентности E. coli, присутствующих в микробиоте кишечника, будет способствовать расширению наших знаний о механизмах её формирования, путях распространения, способах её устранения.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (1-15, 18-25, 28-30, 33, 34 см . REFERENCES)
16. Палагин И.С., Сухорукова М.В., Дехнич А.В., Эйдельштейн М.В., Перепанова Т.С., Козлов Р.С. и др. Антибиотикорези-стентность возбудителей внебольничных инфекций мочевых путей в России: результаты многоцентрового исследования «Дармис-2018». Клиническая микробиология и антимикробная
МИКРОБИОЛОГИЯ
химиотерапия. 2019; 21(2):134-46. https://elibrary.ru/download/ elibrary_41179883_46071908.pdf.
17. Гончар Н.В., Партина И.В., Ныркова О.И., Драп А.С. Антибиоти-ко- и фагорезистентность клинических штаммов кишечной палочки у госпитализированных детей Санкт-Петербурга, больных эше-рихиозами. Антибиотики и химиотерапия. 2014; 59 (9-10): 38-43.
26. Егоров А.М., Уляшова М.М., Рубцова М.Ю. Бактериальные ферменты и резистентность к антибиотикам. Acta Naturae (русскоязычная версия). 2018; 10(4): 33-48. https://www.elibrary.ru/ download/elibrary_36916320_74780557.pdf.
27. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Иванчик Н.В., Склеенова Е.Ю., Шайдуллина Э. Р., Азизов И. С. и др. Антибиотикорези-стентность нозокомиальных штаммов Enterobacterales в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН 2015-2016. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2):147-59. https://elibrary.ru/download/elibrary_41179884_63500344.pdf.
31. Онищенко Г.Г., Шевелёва С.А., Хотимченко С.А. Гигиеническое обоснование допустимых уровней антибиотиков те-трациклиновой группы в пищевой продукции. Гигиена и санитария. 2012; 91 (6): 4-14. https://www.elibrary.ru/download/ elibrary_18846289_70501382.pdf.
32. Поляк М.С. Антибиотикотерапия. Теория и практика. СПб.: Ин-формМед; 2010.
REFERENCES
1. Central Asian and Eastern European surveillance of antimicrobial resistance. Annual report 2017. Copenhagen: World Health Organization Regional Office for Europe; 2017. Available at:
https://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0005/354434/
WH0_CAESAR_AnnualReport_2017.pdf.
2. Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance Surveillance (CIPARS) Annual Report 2013. Ontario: Public Health Agency of Canada; 2015. Available at: https://www.canada.ca/en/ public-health/services/surveillance/canadian-integrated-program-antimicrobial-resistance-surveillance-cipars/cipars-reports.html.
3. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2017. European Food Safety Authority Journal. 2019; 17(2): 5598. Doi: 10.2903/j.efsa.2019.5598.
4. CDC. National Antimicrobial Resistance Monitoring System (NARMS) Now: Human Data. Atlanta: Department of Health and Human Services; 2019. Available at: https://www.cdc.gov/narmsnow.
5. Global antimicrobial resistance surveillance system: manual for early implementation. Geneva: World Health Organization; 2017. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/han-dle/10665/188783/9789241549400_eng.pdf.
6. Escobar-Páramo P., Le Menac'h A., Le Gall T., Amorin C., Gou-riou S., Picard B. et al. Identification of forces shaping the commensal Escherichia coli genetic structure by comparing animal and human isolates. Environmental Microbiology. 2006; 8:1975-84. Doi:10.1111/j.1462-2920.2006.01077.x.
7. Hansen S., Messer T., Mittelstet A., Berry E. D., Bartelt-Hunt S., Abimbola O. Escherichia coli concentrations in waters of a reservoir system impacted by cattle and migratory waterfowl. Science of The Total Environment. 2020; 705: 135607. Doi:10.1016/j.scito-tenv.2019.135607.
8. Dusek N., Hewitt A. J., Schmidt K. N., Bergholz, P. W. Landscape-Scale Factors Affecting the Prevalence of Escherichia coli in Surface Soil Include Land Cover Type, Edge Interactions, and Soil pH. Applied and environmental microbiology. 2018; 84 (10): e02714-17. Doi:10.1128/AEM.02714-17.
9. Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2004; 2: 123-40. Doi: 10.1038/nr-micro818.
10. Vila J., Sáez-López E., Johnson J. R., Römling U., Dobrindt U., Cantón R. et al. Escherichia coli: an old friend with new tidings. FEMS microbiology reviews. 2016; 40 (4): 437-63. Doi:10.1093/ femsre/fuw005.
11. Sommer M., Dantas G., Church G. M. Functional characterization of the antibiotic resistance reservoir in the human microflora.
MICROBIOLOGY
Science (New York, N.Y.). 2009; 325(5944): 1128-31. Doi: 10.1126/ science.1176950.
12. Lerner A., Matthias T., Aminov R. Potential effects of horizontal gene exchange in the human gut. Frontiers in immunology. 2017; 8: 1630. Doi: 10.3389/fimmu.2017.01630.
13. Antibacterial agents in preclinical development: an open access database. Geneva: World Health Organization; 2019. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/330290/WH0-EMP-IAU-2019.12-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y.
14. Sabino J., Hirten R. P., Colombel J. F. Review article: bacteriophages in gastroenterology - from biology to clinical applications. Alimentary pharmacology & therapeutics. 2020; 51: 53-63. Doi: 10.1111/apt.15557.
15. Dallenne C., Costa A.D., Decre D., Favier C., Arlet G. Development of a set of multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important ß-lactamases in Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2010; 65 (3): 490-5. Doi: 10.1093/jac/dkp498.
16. Palagin I. S., Sukhorukova M. V., Dekhnich A. V., Edelstein M. V., Perepanova T. S., Kozlov R. S. et al. Antimicrobial resistance of pathogens causing community-acquired urinary tract infections in Russia: results of multicenter study «DARMIS-2018». Klin-icheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019; 21(2):134-46. (in Russian)
17. Gonchar N. V., Partina I. V., Nyrkova O. I., Drap A. C. Resistance of clinical strains of pathogenic E.coli to antibiotics and bacterio-phage in hospitalized children with escherichiosis in St.Petersburg. Antibiotiki i khimioterapiya. 2014; 59 (9-10): 38-43. (in Russian)
18. Ahmed S. F., Ali M. M., Mohamed Z. K., Moussa T. A., Klena J. D. Fecal carriage of extended-spectrum ß-lactamases and AmpC-producing Escherichia coli in a Libyan community. Annals of clinical microbiology and antimicrobials. 2014; 13:22. Doi: 10.1186/1476-0711-13-22.
19. Huang I. F., Lee W. Y., Wang J. L., Hung C. H., Hu H. H., Hung W. Y. et al.. Fecal carriage of multidrug-resistant Escherichia coli by community children in southern Taiwan. BMC gastroenterology. 2018; 18(1): 86. Doi: 10.1186/s12876-018-0807-x.
20. Dyar O. J., Hoa N. Q., Trung N. V., Phuc H. D., Larsson M., Chuc N. T. et al. High prevalence of antibiotic resistance in commensal Escherichia coli among children in rural Vietnam. BMC infectious diseases. 2012; 12: 92. Doi: 10.1186/1471-2334-12-92.
21. Gupta M., Didwal G., Bansal S., Kaushal K., Batra N., Gautam V. et al. Antibiotic-resistant Enterobacteriaceae in healthy gut flora: A report from north Indian semiurban community. The Indian journal of medical research. 2019; 149 (2): 276-80. Doi: 10.4103/ijmr. IJMR_207_18.
22. Valenza G., Nickel S., Pfeifer Y., Eller C., Krupa E., Lehner-Reindl V. et al. Extended-spectrum-ß-lactamase-producing Escherichia co-li as intestinal colonizers in the German community. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2014; 58 (2): 1228-30. Doi: 10.1128/ AAC.01993-13.
23. Holstiege J., Schink T., Molokhia M. Mazzaglia G., Innocenti F., Oteri A. et al. Systemic antibiotic prescribing to paediatric outpa-
tients in 5 European countries: a population-based cohort study. BMC Pediatrics. 2014; 14: 174. Doi:10.1186/1471-2431-14-174.
24. Boeckel T. V., Gandra S., Ashok A., Caudron Q., Grenfell B., Levin S. et al. Global antibiotic consumption 2000 to 2010: an analysis of national pharmaceutical sales data. The Lancet Infectious Diseases. 2014; 14 (8): 742-50. Doi: 10.1016/S1473-3099(14)70780-7.
25. Auta A., Hadi M. A., Oga E., Adewuyi E. O., Abdu-Aguye S. N., Adeloye D. et al. Global access to antibiotics without prescription in community pharmacies: A systematic review and metaanalysis. Journal of Infection. 2019; 78 (1): 8-18. Doi: 10.1016/j. jinf.2018.07.001.
26. Egorov A. M., Ulyashova M. M., Rubtsova M. Yu. Bacterial enzymes and antibiotic resistance. Acta Naturae. 2018; 10(4): 33-48. (in Russian)
27. Sukhorukova M. V., Edelstein M. V., Ivanchik N. V., Skleenova E. Yu., Shajdullina E. R., Azyzov I. S. et al. Antimicrobial resistance of nosocomial Enterobacterales isolates in Russia: results of multicenter epidemiological study «MARATHON 2015-2016». Klin-icheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019; 21(2):147-59. (in Russian)
28. Karanika S., Karantanos T., Arvanitis M., Grigoras C., Mylonakis E. Fecal colonization with extended-spectrum beta-lactamase-pro-ducing Enterobacteriaceae and risk factors among healthy individuals: a systematic review and metaanalysis. Clinical Infectious Diseases. 2016; 63(3): 310-8. Doi: 10.1093/cid/ciw283.
29. Kawamura K., Nagano N., Suzuki M., Wachino J. I., Kimura K., Arakawa Y. ESBL-producing Escherichia coli and its rapid rise among healthy people. Food safety (Tokyo, Japan). 2017; 5(4): 12250. Doi:10.14252/foodsafetyfscj.2017011.
30. Bartoloni A., Pallecchi L., Benedetti M., Fernandez C., Vallejos Y., Guzman E. et al. Multidrug-resistant commensal Escherichia coli in children, Peru and Bolivia. Emerging infectious diseases. 2006; 12 (6): 907-13. Doi: 10.3201/eid1206.051258.
31. Onishchenko G. G.,Sheveleva S. A., Khotimchenko S. A. Hygienic substantiation of the permissible levels for tetracycline-group antibiotics in food. Gigiena i sanitariya. 2012; 91 (6): 4-14. (in Russian)
32. Polyak M. S. Antibioticotherapia. Theory and practice. [Antibio-tikoterapiya. Teoriya i praktika]. St.Petersburg: InformMed; 2010. (in Russian)
33. Bourdin G., Navarro A., Sarker S. A., Pittet A. C., Qadri F., Sultana S. et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial biotechnology. 2014; 7(2): 165-76. Doi: 10.1111/1751-7915.12113.
34. Ujmajuridze A., Chanishvili N., Goderdzishvili M., Leitner L., Mehnert U., Chkhotua A. et al. Adapted bacteriophages for treating urinary tract infections. Frontiers in microbiology. 2018; 9: 1832. Doi: 10.3389/fmicb.2018.01832.
Поступила 19.06.20 Принята к печати 22.06.20
