CC BY
7
с 30 по 50 сутки периодически регистрировались достоверные различия по данному показателю в группах ТСМ ФМ+ВВ5 и ТСМ ФМ+ВВ10 при сравнении с первой контрольной группой. В результате морфометрического анализа продемонстрировано, что процент сохранной ткани в группах ТСМ ФМ+ВВ10 и ТСМ ВВ10 был значительно выше (Р <0,05) при сравнении с аналогичным показателем в группах контрольных крыс — ТСМ и ТСМ ФМ. Оба варианта трансплантации ВВ способствовали поддержанию популяции 0!1д2+/1\1Э2+ и 0!1д2+/1\1Э2- клеток и в опытных группах были обнаружены достоверные различия при сравнении с ТСМ ФМ в зонах УР и 1_Р. В результате ПЦР-Рв было определено, что в\в МСК-ВВ значительно увеличивали экспрессию мРНК гена Mbp. Высокая дозировка ВВ при в\в приводит к увеличению экспрессии мРНК генов Gap43, S100a10. Минимальная дозировка ВВ при в/в приводит к увеличению экспрессии мРНК генов Psd95 и NeuN.
Результаты данного исследования продемонстрировали, что в/в МСК-ВВ приводит к более эффективному восстановлению двигательной функции после ТСМ у крыс по сравнению с контролем. В/в МСК-ВВ приводит к повышенному росту 0Пд2+ клеток в сером и белом веществе спинного мозга, что косвенно свидетельствует о стимуляции миелинизации в нем.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ RUNX2 НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ОСТЕОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
Д.А. Костина1, А.А. Лобов1, Е.С. Громова1, 2, В.В. Карелкин3, Д.В. Смирнова1, 4, А.Б. Малашичева1
1 Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский Государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
3 НМиЦ ТО им. Р.Р. Вредена, Санкт-Петербург, Россия
4 Национальный исследовательский университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: Runx2, остеобласты, остеогенная дифференцировка.
Runx2 является ключевым регулятором и маркером остеогенной дифференцировки. Он влияет на экспрессию других проостеогенных генов и является звеном многих сигнальных каскадов, таких как Wnt, Notch, Sox9, Msx2, и сигнальный путь Hedgehog [1]. Регуляторная активность Runx2 по-разному изменяется в отношении разных генов-мишеней в зависимости от стадии диф-ференцировки, а на стадии минерализации его уровень снижается [2]. Runx2 является важнейшим регулятором дифференцировки остеобластов [3]. Остеобласты — это клетки взрослой кости, которые синтезируют большое количество различных белков, в том числе Runx2, и обладают способностью к внеклеточной минерализации. Однако роль Runx2 на поздних стадиях остеогенной диф-ференцировки остается слабо изученной.
Чтобы выяснить, какую роль играет Runx2 в дифферен-цировке остеобластов, были созданы лентивирусные конструкции, несущие 3 различные изоформы гена RUNX2: ген, кодирующий полноразмерный белок дикого типа, кодирующий укороченный вариант белка дикого типа и му-тантный вариант гена RUNX2, содержащий стоп-кодон,
а также лентивирусная конструкция, несущая шпилечную РНК к RUNX2, приводящую к подавлению синтеза белка Runx2 при внесении в клетки. Методом лентивирусной трансдукции мы активировали либо подавляли продукцию Runx2 в первичных клетках остеобластов человека.
Биологический эффект лентивирусных конструкций был подтвержден несколькими методами: методом ПЦР в реальном времени было показано, что внесение лентивирусных конструкций приводило к повышению транскрипции RUNX2 для всех трех изоформ в различных типах клеток. Методом иммуноблоттинга было показано, что при использовании созданных лентивирусных конструкций в клетках синтезируется повышенное количество соответствующих изоформ белка Runx2. С помощью исследования активности промотора RUNX2 методом измерения активности люциферазы было показано, что промотор RUNX2 активируется в ответ на внесение конструкций. При внесении шпильки на RUNX2 активность его промотора снижалась.
Влияние повышенной экспрессии RUNX2 на фенотип остеобластов было исследовано методами ПЦР в реальном времени и иммуноцитохимии. Согласно полученным результатам, RUNX2 стимулирует экспрессию остеокальцина, классической мишени RUNX2 и подавляет экспрессии остеомаркера BMP2 в остеобластах, а внесение шпильки на RUNX2 нивелирует этот эффект.
Таким образом, было показано, что активация Runx2 в остеобластах влияет на их синтетические способности. Исследование проведено при поддержке гранта РНФ 18-14-00152
Литература:
1. Rutkovskiy A., Stensl0kken K.-O., Vaage I.J. Med. Sci. Monitor Basic Res., 2016, Vol. 22, P. 95-106.
2. Wu H., Whitfield T.W., Gordon J.A.R., et. al. Gen. Biol., 2014, Vol. 15, No. 3, P. 52.
3. Franceschi R.T., Ge C., Xiao G., et al. Ann. of the New York Academy of Sci., 2007, Vol.1116, No. 1, P. 196-207.
РЕЗИДЕНТНЫЕ Т-КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА В ЗАЖИВЛЕНИИ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ РАН
Е.Г. Костоломова1' 2, Ю.Г. Суховей2, И.Г. Унгер2, Т.В. Акунеева2
1 ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет Минздрава РФ, Тюмень, Россия
2 ООО «Тюменский филиал института клинической
и фундаментальной иммунологии», Тюмень, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: проточная цитометрия, кожа, резидентные Т-клетки, заживление ран, острая рана, хроническая рана.
Лечение длительно незаживающих ран это одна из сложнейших проблем. Boyman O. et al. предположили, что резидентные Т-клетки кожи играют главную роль в кожном иммунном гомеостазе и патологии [1].
Цель работы: изучить роль эпидермальных ар+ и у5+ T-клеток человека в заживлении острых и хроническими ран.
Материалы и методы. Образцы ткани и крови пациентов были доставлены из ГБУЗ ТО «ОКБ № 1», с острой травмой (n=10), с хронической (n=9). Суспензию клеток кожи получали по методике [2]. Исследование
фенотипического состава Т-лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии с использованием моно-клональных антител CD3, CD28, aßTCR и ySTCR на приборе Cytomics FC500 (Beckman Coulter, d±IA). В качестве негативного контроля использовались IgG. Aнализ образца составил 50000-75000 клеток.
Результаты. Исследована популяция aß+ и уб+ T-клеток в здоровом человеческом эпидермисе и дерме [3]. Обнаружено 2,7%±0,76 и 0,26 i 0,09 соответственно уб+ T-клеток в коже по сравнению с кровью. Субпопуляция aß+ T-клеток составила (10,29%±3,4 и 65,7%±11,3 соответственно). Эпидермальные CD3+CD28+aß+(79,2%±7,9 и 5,4%±1,77) и CD3+CD28+y6+(71,3%±10,5 и 4,6%±1,21 ) клетки экспрессируют высокие уровни CLA по сравнению с клетками крови. Процесс заживления нарушается при хронических ранах, в связи со сниженным количеством резидентных T-клеток в коже или функционально дефектных. Не было обнаружено существенных различий в соотношении aß+ к уб+ T-клеткам при хронических ранах по сравнению с острыми. Однако, анализ абсолютных значений обнаружил, что 2890± 254 aß и 283 ± 31 уб Т клеток/см2 в нормальном эпидермисе и 10 860± 512aß и 300± 57 уб T клеток/см 2 при острых и хронических ранах соответственно. В месте ран обнаружены в основном aß Т-клетки (p <0,001), тогда как Т-клетки уб, являются популяцией кожи.
Таким образом обнаруженная дисфункция Т-клеток может быть вызвана повышенной экспрессией ингиби-рующих рецепторов, таких как апоптоз, которая усиливается в ответ на тяжелые повреждения. Идентификация эквивалента Т-клеток кожи человека позволит получить представление о механизме эффективного восстановления острых ран и выявит новые мишени для терапевтического вмешательства при лечении хронических ран. С клинической точки зрения, повреждение Т-клеток на ранней стадии процесса заживления раны может быть прогностическим фактором для формирования хронической раны.
Литература:
1. Boyman O, Conrad C, Tonel G, et al. Trends Immunol. 2007. V.
28. P. 51-57.
2. Гольцов С.В., Костоломова Е.Г., Суховей Ю.Г. и др. Пат.
РФ № 2630607 C1, MПK G01N 33/53. 2017.
3. Суховей Ю.Г., Костоломова Е.Г., Унгер И.Г., Aкунеева Т.В.
РИЖ, 2017. Т. 11(20). № 3. С. 521-523.
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМНОГО ВЛИЯНИЯ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ, НАХОДЯЩИХСЯ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ АДИПОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Н.В. Костюк, М.Б. Белякова, М.В. Черноруцкий, М.Б. Петрова
ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава РФ, Тверь, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: жировая ткань, мезенхимные стромаль-ные клетки, зрелые адипоциты, адипогенная дифференци-ровка, сокультивирование.
Нарушение нормального функционирования клеток жировой ткани лежит в основе патогенеза различных заболеваний, в том числе ожирения, диабета и т. д. Учитывая широкий спектр биологически активных молекул, продуцируемых этой тканью, можно предполагать
ключевую роль сдвига паракринных взаимодействий в развитии патологии. Цель настоящей работы — оценить in vitro взаимное влияние клеток жировой ткани, находящихся на разных этапах адипогенной дифференцировки.
В работе использовали клетки жировой ткани разной локализации, полученные от человека, крысы, кролика. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) и зрелые адипоциты выделяли в соответствии со стандартными протоколами. Адипогеную дифференцировку МСК индуцировали добавлением смеси инсулина, дексамета-зона и изобутилметилксантана с последующей заменой на питательную среду, содержащую инсулин. От монокультуры к совместным культурам переходили через 0, 2, 5, 7 дней от начала индукции, моделируя разные стадии адипогенеза. Сокультивирование вели с использованием двухуровневой системы, где легко адгезирующие клетки локализованы на дне сосуда, а зрелые адипоци-ты — на «потолке» [1]. В ходе эксперимента оценивали долю жизнеспособных и липид-содержащих клеток, фиксировали время появления первых липидных капель, характер их распределения в цитоплазме, относительное количество липидов в культуре. Общее время наблюдения — 14 дней. Контролем служили индуцированные и неиндуцированные монокультуры МСК.
В целом адипоциты в совместной культуре оказывают стимулирующее действие на дифференцировку МСК, сокращая время появления первых липидных капель, увеличивая долю запасающих клеток и количество три-глицеридов в них. Эффект присутствия зрелых клеток тем значительнее, чем на более ранней стадии находятся дифференцирующиеся клетки. Обратного влияния МСК и преадипоцитов на зрелые адипоциты отмечено не было. Полученные результаты подтверждают важную роль паракринной регуляции внутри жировой ткани.
Литература:
1. Kostiuk N.V., Ве1уа1«^а M.B., Egorova E.N. et al. Seien. heritage.
2017. N. 13. P. 3.
СТРОМАЛЬНО-ВАСКУЛЯРНАЯ ФРАКЦИЯ ЛИПОАСПИРАТА В РЕЖИМЕ МОНОТЕРАПИИ И СОЧЕТАННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ С ПРЕПАРАТОМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЛЕЧЕНИИ ГОНАРТРОЗА
М.А. Котова, Е.Я. Шевела, Т.Р. Глебова, Н.А. Ница, Г.А. Ахметова, Ю.А. Кожевников, И.В. Меледина, Е.Р. Черных
ФГБНУ НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: стромально-васкулярная фракция, липо-аспират, гиалуроновая кислота, остеоартрит, ВАШ, KOOS.
Остеоартрит (ОА) — наиболее частая форма артрита, характеризующаяся болями и тугоподвижностью суставов, приводящими к ухудшению качества жизни. Современные варианты лечения ОА нацелены на купирование болевого синдрома и повышение вязкости суставов с помощью внутрисуставного введения препаратов гиалуроновой кислоты (ГлК) [1]. Однако длительное применение некоторых из этих препаратов может вызывать серьезные побочные эффекты. Одно из новых направлений в лечении ОА связано с использованием клеточных технологий, в том числе стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировой ткани. Клетки СВФ оказывают
