CC BY
48
tus for the efficacy of antibiotic treatment. Gut 2000; 46(3):321-6.
37. Graham D.Y., Lew G.M., Malaty H.M. et al. Factors influencing the eradication of Helicobacter pylori with triple therapy. Gastroenterology 1992; 102(2):493-4.
38. McColl K. E., Kennerley P. Proton pump inhibitors -differences emerge in hepatic metabolism Dig Liver DIis 2002; 34(7):461-7.
39. Ishizaki T., Horai Y. Review article: cytochrome P450 and the metabolism of proton pump inhibitors - emphasis on rabeprazole. Aliment Pharmacol Ther 1999; 13(Suppl 3):27-36.
40. Niv Y., Abuksis G. Survey of the opinions, knowledge and practices of surgeons and internists regarding Helicobacter pylori test-and-treat policy. J Clin Gastroenterol 2003; 36(2):139-43.
41. Страчунский Л.С., Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л. и др. Ведение больных язвенной болезнью в амбулаторно-поликлинических условиях: результаты многоцентрового российского фармакоэпидемиологического исследования. Рос журн гастроэнтерол гепатол коло-проктол 2005; 15 (6):16-21.
42. grls.rosminzdrav.ru (Париет рег. №: П N011880/01, Онтайм рег. №: ЛП 000831, Зульбекс рег. №: ЛП-000944, Нексиум рег. №: П N013775/01).
Приложение
Рекомендации по выделению, идентификации и определению чувствительности Helicobacter pylori к антимикробным препаратам
Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ)
Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии
ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России
Р.С. Козлов1, Н.В. Иванчик1, Н.Н.Дехнич2
1 НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России, Смоленск, Россия
2 Кафедра факультетской терапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России, Смоленск, Россия
Guidelines for the Isolation, Identification and Susceptibility Testing of Helicobacter pylori
Interregional Association for Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy (IACMAC) Institute of Antimicrobial Chemotherapy (IAC)
R.S. Kozlov1, N.V. Ivanchik1, N.N. Dekhnich2
1 Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk, Russia
2 Smolensk State Medical Academy, Smolensk, Russia
Получение биопсийного материала для бактериологического исследования
Биопсийный материал для выделения Н. pylori необходимо получать до начала антибиотикоте-рапии либо, при неэффективности предшествующего лечения, до назначения нового режима анти-
Контактный адрес:
Наталья Николаевна Дехнич
Эл. почта: n.dekhnich@antibiotic.ru
биотикотерапии. Перед получением биопсийного материала для посева рекомендовано за 14 дней прекратить прием ингибиторов протонной помпы, препаратов висмута и антибиотиков.
Взятие биопсийного материала слизистой оболочки желудка для бактериологического исследования на Н. pylori не исключает других методов диагностики (например, проведение быстрого уреазного теста или гистологического исследования).
Отрицательный результат быстрого уреазного теста или других методов диагностики Н. pylori не
исключает возможности выделения данного возбудителя бактериологическим методом, в связи с чем в ходе эндоскопического исследования осуществляется взятие двух биопсийных образцов из антрального отдела желудка (на 2-3 см от привратника на передней и задней стенке) и двух из тела желудка (10 см от кардии по большой кривизне).
Хранение и транспортировка материала до первичного посева
Четыре биоптата немедленно помещаются в транспортную пробирку. В случае если предполагаемое время от взятия материала до доставки в микробиологическую лабораторию не превышает 6 ч, используется стерильная плотно закрывающаяся пробирка с 0,1 мл фосфатно-солевого буфера.
Если доставка образцов будет осуществляться в течение 6-48 ч, в качестве транспортной среды используется Portagerm pylori (ВюМепеих, Франция). Хранение и транспортировка образцов осуществляется при температуре +40С в защищенном от света месте.
При необходимости длительного хранения (до 6 мес), биоптаты могут храниться в 20-25% глицериновом бульоне при температуре -70 °C, однако в этом случае жизнеспособность Н. pylori и вероятность положительного результата бактериологического исследования снижаются.
Первичный посев
Перед посевом биопсийный материал помещается в 0,5 мл стерильного физиологического раствора и гомогенизируется в пробирке типа эппендорф при помощи стерильной микробиологической петли в течение 1 мин или электрическим гомогенизатором при 10 тыс. об/мин в течение 10-20 с. Затем по
2 капли гомогенизированного раствора помещают на поверхность чашек с неселективной (кровяной агар: основа агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5% бараньей или лошадиной крови) и селективной (Pylori agar, BioMerioux, Франция) питательными средами. Посев производится сплошным газоном с помощью шпателя Дригальского или бактериологической петли.
Чашки с посевами немедленно помещают в анаэростат-контейнер (GENbox, ВюМепеих,
Таблица 1. Идентификация Н. pylori
Франция), где с помощью коммерческих газогене-рирующих пакетов (GENbox microaer, ВюМепеих, Франция, или Campy Pak, Becton Dickinson, США) создается микроаэрофильная атмосфера (О2 -11%, СО2 - 9%, N2 - 80%). Также для создания микроаэрофильной атмосферы может применяться прибор «Аноксомат» (Advanced Instruments, Великобритания).
Посевы инкубируются в термостате при температуре 35-37°С и влажности 95%. Учет результатов посева проводится через 4 сут. На кровяном и Pylori агаре на 3-5-е сутки при первичном посеве, а так же на 2-3-и сутки при пересевах чистой культуры, Н. pylori формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, похожие на «капли росы» колонии диаметром 1-3 мм. В случае отсутствия признаков роста, инкубация продляется до 10 суток.
Идентификация H. pylori
Идентификация на основе фенотипических и биохимических свойств. При получении роста колоний по морфологии сходных с Н. pylori проводится их предварительная идентификация, которая включает в себя окраску мазка по Граму и 3 биохимических теста - уреазный, каталазный и оксидаз-ный (табл. 1).
Идентификация с применением время-пролётной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Для идентификации Н. pylori может использоваться профилирование рибосомальных белков с использованием метода MALDI-TOF MS (при этом необходима специфическая пробоподготовка исследуемой культуры в соответствии с рекомендациями производителя).
Идентификация с применением молекуляр-но-генетических методов. Существуют коммерческие тест-системы на основе технологии амплификации нуклеиновых кислот, прежде всего - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Данный метод является особенно перспективным для прямого выявления ДНК/РНК Н. pylori, а также отдельных генетических детерминант вирулентности и резистентности не только в выделенной культуре микроорганизма, но и непосредственно в клиническом материале.
Окраска по Граму Характер роста на селективной среде Уреаза Каталаза Оксидаза
Грамотрицательные При культивировании в микроаэрофильной атмосфе- +++ + +
извитые S-образные ре, повышенной влажности при 35-37 °C на Pylori agar палочки через 3-5 сут образуются мелкие, круглые, гладкие, про-
зрачные как «капли росы» колонии диаметром 1-3 мм
Таблица 2. Методы определения чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам
Микроразведения в бульоне
Разведения в агаре
Etest® (bioMerieux, Франция)
MIC Test Strip (Liofilchem, Италия)
Среда Катионсбалансирован-
ный бульон Мюллера-Хинтон + 5% лизи-рованная лошадиная кровь и 20 мг/л /3-NAD
Катионсбалансирован-ный агар Мюллера-Хинтон + 5% дефибри-нированная лошадиная кровь и 20 мг/л в-NAD
Катионсбалансирован-ный агар Мюллера-Хинтон1 + 5% лошадиная или баранья кровь (>2 нед.)
Катионсбалансирован-ный агар Мюллера-Хинтон + 5% баранья кровь
Инокулюм >48-часовую культуру, разведенную в 3-5 мл стерильного физиологического раствора до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по МакФарланду с непосредственной последующей инокуляцией
>48-часовую культуру, разведенную в 3-5 мл стерильного физиологического раствора до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по МакФарланду с непосредственной последующей инокуляцией
>72-часовую культуру суспендировать в бульоне (Мюллера-Хинтон или др.) с добавлением 5% сыворотки крови. Довести до мутности 3 по МакФарланду. На 1 чашку диаметром 90 мм поместить 1 полоску Etest.
>72-часовую культуру суспендировать в бульоне (Мюллера-Хинтон или др.) с добавлением 5% сыворотки крови. Довести до мутности 3 по МакФарланду. На 1 чашку диаметром 90 мм поместить 1 полоску MIC Test Strip.
Инкубация
Температура 35-37 °С. Температура 35-37 °С. Температура 35 °С. Температура 35±2 °С.
Атмосфера микроаэро- Атмосфера микроаэро- Атмосфера микроаэро- Атмосфера микроаэро-
фильная2. фильная2. фильная2. фильная2.
Длительность >72 ч Длительность >72 ч Длительность >72 ч Длительность >72 ч
(до появления хорошо (до появления хорошо (до появления хоро- (до появления хоро-
видимого роста) видимого роста) шо видимого эллипса шо видимого эллипса
вокруг полоски Etest). вокруг полоски MIC Test Strip).
Учет результата
За значение МПК принимается наименьшая концентрация антибиотика, при которой наблюдается значимое снижение мутности
Колонии H. pylori мелкие, прозрачные и трудноразличимые. Поэтому при определении значения МПК используйте увеличительное стекло или смотрите на поверхность чашки под углом.
Для бактерицидных препаратов (амоксициллин, левофлоксацин, метро-нидазол, рифампицин) значение МПК соответствует полному отсутствию роста микроорганизма, включая микроколонии, «пылевидный» рост и отдельные колонии.
Для бактериостатических препаратов (кларитромицин, тетрациклин) при «размытой» зоне подавления роста учитывайте 80% от края зоны ингиби-рования роста.
1 Рекомендован агар Мюллера-Хинтон производства «Becton Dickinson» (США) ввиду наиболее высокой стабильности качества между различными партиями среды.
2 Для метронидазола первые 24 ч инкубации в анаэробных условиях, затем >48 ч - в микроаэрофильных условиях.
Таблица 3. Критерии оценки чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам, (EUCAST, v.4.0).
Препарат Референсные значения МПК (мг/л) для контрольного штамма H. pylori ATCC 43504 -(NCTC 11637) МПК, мг/л
Чувствительный1, < Резистентный1, >
Амоксициллин 0,015-0,12 0,12 0,12
Кларитромицин 0,015-0,12 0,25 0,5
Левофлоксацин _2 1,0 1,0
Тетрациклин 0,12-1 1,0 1
Метронидазол 64-256 8, 8,0
Рифампицин -2 1,0 1,0
1 данные критерии не являются клиническими, а представляют собой эпидемиологические пограничные значения, разделяющие штаммы с природной чувствительностью и штаммы со сниженной чувствительностью.
2 референсные значения МПК для данного контрольного штамма отсутствуют.
Хранение штаммов
Выделенные штаммы хранятся в пробирках с триптиказо-соевым бульоном с добавлением 30% стерильного глицерина при температуре -70 °С.
Определение чувствительности
В соответствии с рекомендациями Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing - EUCAST) исследование чувствительности H. pylori проводится путем определением минимальных подавляющих концентраций (МПК) либо методами разведения в бульоне или агаре, либо с использованием коммер-
ческих тестов (в соответствие с рекомендациями производителя). Методы определения МПК антимикробных препаратов для H. pylori приведены в табл. 2.
Рекомендуется определять чувствительность H. pylori к амоксициллину, кларитромицину, тетрациклину, метронидазолу, а также, при необходимости, к левофлоксацину и рифампицину. При тестировании используются двойные серийные разведения химически чистых субстанций антибиотиков.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам, а также референсные значения МПК для контрольного штамма представлены в табл. 3.
