CC BY
265
УДК 573.6.086.83:577.21:[577.152.311+612.015.1]
Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового поколения: разработка эукариотической системы экспрессии
Д. Г. Илюшин1*, О. М. Эртле1, Т. В. Бобик1, О. Г. Шамборант1, Е. А. Сурина1, В. Д. Кнорре1,
P. Masson 2, И. В. Смирнов1, А. Г. Габибов1, Н. А. Пономаренко1
1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2Centre de Recherches du Service de Sante des Armees, Departement de Toxicologie, La Tronche, France *E-mail: IlyushinDenis@gmail.com Поступила в редакцию 25.04.2012
РЕФЕРАТ Бутирилхолинэстераза (БуХЭ) - сериновая гидролаза [КФ 3.1.1.8], которая характеризуется высокой реакционной способностью стехиометрически связывать разнообразные токсины, ингибирующие ацетилхолинэстеразу, и обнаруживается практически во всех тканях млекопитающих. Это делает бу-тирилхолинэстеразу человека первым кандидатом на роль биологического антидота, действие которого направлено на различные фосфорорганические яды. Получение рекомбинантной БуХЭ в количествах, достаточных для инъекционного введения, затруднено из-за низкой эффективности существующих систем экспрессии. В представленной работе разработана эффективная система экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека на основе клеток линии CHO, а также охарактеризован белок, полученный с использованием этой системы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА биологический антидот, бутирилхолинэстераза, клетки линии CHO, рекомбинантный белок, фосфорорганические токсины.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотный остаток; БуХЭ - бутирилхолинэстераза; ПААГ - полиакриламидный гель; ФОТ - фосфорорганический токсин; СНО - Chinese hamster ovary cells (клетки яичников китайского хомячка Cricetulus griseus); DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла).
ВВЕДЕНИЕ
Бутирилхолинэстераза (БуХЭ) - сериновая гидролаза [КФ 3.1.1.8], обнаруженная практически во всех тканях млекопитающих, в частности в тканях легкого, кишечника, печени и в сыворотке крови [1]. Физиологическая функция БуХЭ не известна, но считается, что она играет важную роль в поддержании и контроле активности нейромедиаторов ацетилхолина в центральной нервной системе и нервно-мышечных окончаниях [2].
БуХЭ обладает способностью стехиометрически связывать разнообразные токсины, ингибирующие ацетилхолинэстеразу. В частности, БуХЭ взаимодействует с такими фосфорорганическими соединениями, как зарин, зоман, газы VХ и VR и некоторыми пестицидами. Эти данные получены в опытах на грызунах [3] и приматах [4]; после внутривенного или внутримышечного введения препарата БуХЭ, выделенной из сыворотки крови человека, у животных обнаруживалась длительная устойчивость к действию нервно-паралитических агентов [5].
За последние 60 лет исследований методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганиче-скими токсинами (ФОТ) активно развивались. Тем не менее все они еще несовершенны. Эти методы позволяют предотвратить смерть пациента, но не позволяют избежать необратимых поражений головного мозга и потери трудоспособности. Альтернативным подходом к медикаментозной терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов [6]. Биологическими антидотами могут быть антитела и ферменты, которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения, до того как они достигнут своей биологической мишени [7]. Из всех антидотов против ФОТ только БуХЭ плазмы крови человека получила статус «New development drug» от FDA в 2006 году.
Бутирилхолинэстераза человека - гликопротеин, состоящий из четырех идентичных субъединиц. Каждая субъединица состоит из 574 а.о. и 9 полисахаридных цепей. Молекулярная масса одной субъе-
диницы БуХЭ составляет 85 кДа, из которых 23.9% приходится на полисахаридные цепи [8]. Существует несколько олигомерных форм БуХЭ: в плазме крови человека 95% БуХЭ представлено тетрамерной формой, остальные 5% приходятся на тримерную, димерную и мономерные формы [9], иногда обнаруживается гетеродимер БуХЭ с сывороточным альбумином [10]. Олигомерные формы БуХЭ обладают одинаковой удельной активностью, однако сильно различаются по фармакодинамическим характеристикам [3].
На сегодняшний день бутирилхолинэстеразу человека выделяют из плазмы крови. Опубликованный в 2005 году протокол очистки рассчитан на обработку 100 л плазмы крови человека за один цикл [4]. По оценке экспертов, для получения 1000 доз БуХЭ потребуется переработать годовой запас плазмы крови США [11]. Кроме того, при использовании донорской плазмы существует вероятность заражения препарата опасными вирусами.
Альтернативным методом является получение рекомбинантного белка. Экспрессия в клетках прокариот - технологически наиболее простой и экономически выгодный метод получения рекомбинантных белков. Однако попытки экспрессии БуХЭ в клетках Escherichia coli не были успешными [12].
Для получения корректно фолдированных и функционально активных рекомбинантных продуктов в последнее время широко используются культивируемые клетки животных, в частности клетки линии CHO. За последние 25 лет получено и одобрено FDA более 20 рекомбинантных белковых препаратов, в том числе альглюкозидаза a (Myozyme) [13], антигемо-филический фактор (ReFacto) [14], фактор свертывания крови IX (BeneFIX) [15], интерферон-Р (Avonex) [16], a-галактозидаза (Fabrazyme) [17], эритропоэтин А (Eprex, Epogen) и др. Для эффективной экспрессии рекомбинантных белков в животных клетках разработан целый ряд технических средств, таких, как роллерные системы, спиннеры и биореакторы, позволяющие обеспечить продукцию целевого белка в количестве нескольких грамм на 1 л культуральной среды [18-20]. Кроме того, эффективность экспрессии достигается использованием сильных промоторов, таких, как промотор гена фактора элонгации 1a (EF-1) [21] или цитомегаловирусный (CMV) промотор [22].
В 2002 году удалось получить рекомбинантную низкогликозилированную БуХЭ в нелимфоидных клетках линии CHO [23]. При продукции в роллерных бутылях выход целевого белка составил 2-5 мг на 1 л ростовой среды, тогда как для обеспечения рентабельности производства требуется достичь уровня продукции не менее 50-100 мг/л ростовой среды.
Помимо непосредственного увеличения уровня продукции рекомбинантной БуХЭ внимание иссле-
дователей сосредоточено также на получении препарата с улучшенными фармакодинамическими характеристиками. Недавно в составе тетрамера бу-тирилхолинэстеразы человека обнаружены пептиды неизвестного происхождения с молекулярной массой от 2072 до 2878 Да и общей аминокислотной последовательностью PSPPLPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPLP. Считается, что эти пептиды играют важную роль в формировании четвертичной структуры БуХЭ, связываясь с С-концевыми доменами ее субъединиц [24]. Показано, что в этой роли может выступать и пролин-богатый N-концевой домен коллагеноподобного белка ColQ - PRAD (proline rich attachment domain): коэкспрессия пептида PRAD, состоящего из 45 а.о., с рекомбинантной БуХЭ в клетках линии CHO приводит к увеличению доли тетрамерной изоформы БуХЭ до 70% [25].
В 2007 году американскому исследователю Huang Y.J. и соавт. удалось создать трансгенных коз, молоко которых содержит рекомбинантную БуХЭ. Показано, что в 1 л молока трансгенных животных обнаруживается от 1 до 5 г активной БуХЭ. Однако полученный таким образом фермент недостаточно гликозилиро-ван, что значительно снижает его фармакологические показатели [26].
В 2010 году группе американских, канадских и израильских ученых удалось экспрессировать БуХЭ в клетках трансгенных растений [27]. После избыточного пэгилирования фармакодинамические характеристики рекомбинантного фермента были сопоставимы с характеристиками БуХЭ плазмы крови человека. К сожалению, применение такого препарата затруднено, поскольку этот способ получения рекомбинантных продуктов в качестве лекарственных средств в настоящее время не разрешен FDA.
Таким образом, на сегодняшний день не существует эффективной и экономически выгодной системы экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека. Создание такой системы экспрессии стало целью данной работы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы и материалы
В работе использовали реактивы фирм «Panreac», «Amresco» и «Sigma» (США); «Merck» (Германия); наборы для выделения плазмидной ДНК, очистки ПЦР-фрагментов, экстракции ДНК из агарозного геля («Qiagen», США); ферменты рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты («Fermentas», Литва); ростовые среды и компоненты ростовых сред («Gib-co», США); векторы pcDNA3.1/Hygro, pBudCE4.1 («Invitrogen», США), pET28a («Novogen», США).
Л
BChE
Б
PRAD
PRAD
Рис. 1. Схематическое изображение экспрессионных конструкций pcDNA/CMV/BChE (A), pBudCE/EF/BChE (Б), pcDNA/CMV/PRAD (В) и pcDNA/EF/PRAD (Г)
В
Плазмиды pGS/BChE и pRc/RSV-rQ45 предоставлены П. Массоном (CRSSA, La Tronche, France) и О. Локридж (UNMC, Omaha, USA).
Бактериальные штаммы
В работе использовали штаммы E. coli DH5a, BL21(DE3) и XL2-Blue («Novagen», США).
Клеточные линии
В работе использовали клеточную линию CHO-K1 («Sigma», США) с применением общих методов ведения линий клеток животных [28]. Клетки выращивали в культуральных флаконах или планшетах в среде DMEM, содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки и 2 мМ L-глутамина, в инкубаторе при 37°С, 5% С02.
Создание экспрессионных конструкций
1) Создание экспрессионной конструкции pcDNA/Hygro/CMV/BChE (рис. 1А).
Плазмида pGS/BchE, несущая фрагмент ДНК, кодирующий БуХЭ человека, была обработана эндонуклеазами рестрикции HindIII и ApaI. Фрагмент ДНК длиной 1914 п.н. был очищен методом электрофореза в 1% агарозном геле с последующей элюцией с помощью набора QIAguick Gel Extraction Kit и лигирован в расщепленный теми же рестриктазами и дефосфорилированный вектор pcDNA3.1/Hygro.
2) Создание экспрессионной конструкции pBudCE/EF/BChE (рис. 1Б).
Для получения данной конструкции вектор pBudcE4.1 модифицировали. Фрагмент ДНК, со-
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для клонирования
Праймер 1 TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC
Праймер 2 GAA GAA GCT TGT ACA ATA TGC ATA GCA AAG TCA CAA TC
Праймер 3 AAG TGG TTC CTT TAA TGC TCC T
Праймер 4 ATA TGC GGC CGC TCA TTC TAA GAC ACT TGA TTA TTT CAG T
Праймер 5 ATA TGC TAG CGA AGA TGA CAT CAT AAT TGC AAC A
Праймер 6 ATA TGC GGC CGC TCA CAG AAA CTT GCC ATC ATA AAC ATG
Праймер 7 ATA TGC TAG CGC TCG GGT TGA AAG AGT TAT TGT
Праймер 8 ATA TGC GGC CGC TCA GCA ACC AGT CAA TTT AGC TAA GTT
ответствующий CMV-промотору, удаляли. Таким образом был создан вектор pBudcE/EF. Плазмиду pGS/BchE обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BglII. Нужный фрагмент ДНК длиной 1832 п.н. очищали, как описано выше, и лигировали в аналогично рестрицированный и дефосфорилирован-ный вектор pBudCE/EF. Положительные клоны с правильной ориентацией фрагментов определяли методом ПЦР с использованием праймеров 1 и 2 (табл. 1).
3) Создание экспрессионной конструкции pcDNA/CMV/PRAD (рис. 1В).
Плазмиду pRc/RSV-rQ45 [29], содержащую последовательность, кодирующую пептид PRAD и FLAG-эпитоп, обрабатывали эндонуклеазами HindIII и XhoI. Фрагмент длиной 252 п.н. очищали методом электрофореза в 10% ПААГ с последующей электроэлюцией и лигировали в вектор pcDNA3.1/Hygro, соответственно расщепленный и дефосфорилированный.
4) Создание экспрессионной конструкции pcDNA/EF/PRAD (рис. 1Г).
Плазмиду pBudCE/EF, содержащую EF-промотор, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BglII. Рестрицированную ДНК достраивали с помощью фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I, а затем реакционную смесь обрабатывали эндонуклеазой NheI. Фрагмент длиной 1223 п.н. очищали методом электрофореза в 1% агарозном геле с последующей электроэлюцией. Плазмиду pcDNA/CMV/PRAD обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HindIII, достраивали с помощью фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I и обрабатывали реакционную смесь эндонуклеазой SpeI. Полученный вектор очищали, как описано выше, дефосфорилировали и лигировали с полученным ранее фрагментом ДНК, соответствующим EF-промотору.
5) Создание экспрессионных конструкций pET28-C, pET28-N 1 и pET28-N2 (рис. 3А).
Нуклеотидные последовательности, кодирующие С-концевой фрагмент БуХЭ (322 а.о.), а также два
фрагмента П-концевого пептида БуХЭ - N1 и N2 (133 и 119 а.о. соответственно), получены методом ПЦР. В качестве матрицы использовали плазмиду pGS/BChE. В реакцию брали следующие пары праймеров: фрагмент С - праймеры 3 и 4; фрагмент N1 - праймеры 5 и 6; фрагмент N2 - праймеры 7 и 8 (табл. 1). ПЦР-продукты С, N1 и N2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI и N011 и лигировали аналогичным образом рестрицированный и де-фосфорилированный вектор рЕТ28а с получением экспрессионных конструкций рЕТ28-С, рЕТ28-Ш и pEТ28-N2 соответственно.
Лигазными смесями трансформировали элек-трокомпетентные клетки E. coli штамма DH5a или XL2-Blue. Первичный скрининг клонов проводили при помощи ПЦР с колоний. Плазмиды, выделенные из позитивных клонов, дополнительно оха-рактеризовывали методом рестрикционного анализа. Правильность сборки экспрессионных конструкций и векторов проверяли секвенированием по Сэнгеру. Приготовление электрокомпетентных клеток, трансформацию, обработку рестриктазами, лигирование, ПЦР и электрофорез ДНК проводили по стандартным методикам [30, 31]. Плазмиды выделяли согласно [32].
Экспрессия и очистка рекомбинантных пептидов БуХЭ
Клетки E. соИ штамма BL21(DE3) трансформировали методом электропорации конструкциями рЕТ28-С, рЕТ28-Ш или pEТ28-N2. Пептиды БуХЭ, кодируемые плазмидами, содержали шесть остатков гистидина на С-конце, что позволило выделять их с помощью металлохелатной хроматографии.
Клетки наращивали при 37°С до OD600 = 0.6, после чего индуцировали раствором изопропилтио-Р-Л-галактозида (ИПТГ), добавленным до концентрации 1 мМ. Через 6 ч после индукции клетки центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ре-суспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-
А
ч
о
а
с
1.6
1.4
1.2
>5 *
S 5 “ 0)
« ш 5 а
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Трансфектомы CHO I Контрольные CHO
pBudCE/
/EF/BChE
pGS/
/CMV/BChE
pcDNA/
/CMV/BChE
30
25
ы
-1
фор/мл20
>x *
к
4
о
р
1=
15
10
£ a
5
A3 H7 D10 C2 C4 H8
ы м р о ф > s \ i
m 5 s ,
£ ел
m X ш ^ * ^ нр а
£
р
е
ч
о
u
4M
3M
2M
1M
24 ч 120 ч 144 ч
168 ч
172 ч
Рис. 2. Анализ эффективности временной трансфекции клеток линии СНО экспрессионными конструкциями pBudCE/EF/BChE, pGS/CMV/BChE и pcDNA/CMV/BChE (А). Сравнительный анализ продукции БуХЭ отобранными моноклонами после стабильной трансфекции клеток линии СНО линеаризованной конструкцией pBudCE/EF/BChE (Б). Анализ подбора условий экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека клоном А3 в различных ростовых средах (б). Анализ олигомерного состава рБуХЭ методом Карновского. Разделение БуХЭ осуществляли в 8% ПААГ в неденатурирующих условиях. 1 - Образец плазмы крови человека, 2 - образец очищенной бутирилхолиэстеразы плазмы крови человека, 3 - культуральная среда клона А3, 4 - культуральная среда клона А3 после временной трансфекции конструкцией pcDNA/CMV/PRAD, 5 - культуральная среда клона А3 после временной трансфекции конструкцией pcDNA/EF/PRAD, 6 - культуральная среда клона А3Н9; 4М - тетрамер, 3М - тример, 2М - димер, 1М - мономер (Г)
Б
0
B
2
3
4
5
6
НС1 pH 8.0, 2 мМ EDTA, 0.1% Тритон Х-100, в объеме, равном 0.1 от исходного.
Все рекомбинантные полипептиды БуХЭ экспрессировались в нерастворимой форме. Для получения фракции телец включения в суспензию клеток вносили лизоцим до конечной концентрации 0.1 мг/мл и инкубировали при 30°С и постоянном помешивании в течение 15 мин, после этого к лизату добавляли MgCl2 до концентрации 8 мМ и ДНКазу до 0.1 мг/мл. Лизат клеток центрифуги-
ровали в течение 15 мин при 13000 об/мин. Осадок, содержащий фракцию нерастворимых белков, последовательно отмывали в растворах, содержащих 50 мМ Трис-НС1 pH 8.0, 150 мМ ПаС1, 1% Тритон Х-100; 50 мМ Трис-НС1 pH 8.0, 150 мМ ПаС1, 2 М мочевины и 50 мМ Трис-НС1 pH 8.0, 150 мМ ПаС1, 8 М мочевины. Полученные фракции анализировали методом белкового электрофореза в 15% ПААГ в восстанавливающих условиях. Полипептиды С и N1 обнаруживались во фракции, содержащей 2
М мочевины, полипептид N2 - в нерастворимой фракции белков.
Затем полипептиды C и N1 очищали с помощью металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях на смоле IMAC Sepharose 6FF («GE Healthcare», США) по методике производителя. Элюаты диализовали против воды, полученной на установке mQ («Millipore», США), осадок осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 50% водном растворе этилового спирта до получения мелкодисперсной суспензии.
Полипептид N2 очищали многократной отмывкой нерастворимой фракции раствором, содержащим 50 мМ Трис-HCl pH 8.0, 150 мМ NaCl, 8 M мочевины,
1 мМ Р-меркаптоэтанола. Осадок диализовали против воды, полученной на установке mQ («Millipore», США), осаждали центрифугированием и ресуспен-дировали в 50% водном растворе этилового спирта до получения мелкодисперсной суспензии.
Иммунизация мышей полноразмерной БуХЭ плазмы крови человека
Мыши линии BALB/c были получены из питомника Harlan (Великобритания) и содержались в виварии Филиала Института биоорганической химии РАН в г. Пущине в стерильных условиях, минимизирующих контакт иммунной системы с внешними антигенами (Specific Pathogen-Free-статус). Возраст мышей варьировал от 6 до 8 нед. Иммунизацию проводили, вводя каждой мыши 100 мкг БуХЭ в полном адъюванте Фрейнда дважды с недельным интервалом. Бу-стирование иммунизированных мышей проводили интраперитонеально за 3 дня до отбора спленоцитов, вводя мышам по 50 мкг БуХЭ в фосфатно-солевом буфере (PBS).
Получение моноклональных антител мыши
Моноклональные антитела получали по стандартным методикам с использованием клеточных гибридом и асцитов [33, 34]. Моноклональные антитела очищали с помощью аффинной хроматографии на смоле HiTrap Protein-A («GE Healthcare», США) согласно методике производителя. Биотинилирование антител проводили с помощью NHS-биотина («GE Healthcare», США) по методике производителя.
Иммунизация кроликов рекомбинантными полипептидами БуХЭ
Иммунизацию кроликов проводили на базе вивария ИБХ РАН. Рекомбинантные полипептиды N1 и N2 БуХЭ вводили подкожно по следующей схеме: первая инъекция - суспензия пептида в полном адъюванте Фрейнда; вторая инъекция (через 28 дней) -суспензия пептида в неполном адъюванте Фрейнда;
третья инъекция (через 14 дней) - суспензия пептида в неполном адъюванте Фрейнда. Каждому животному вводили по 200 мкг пептида в каждой инъекции. Через 7 дней после иммунизации из ушной вены каждого животного отбирали 10 мл крови и получали сыворотку крови. Титр антител определяли методом непрямого ИФА.
Иммуноферментный анализ методом ELISA
В работе использовали различные варианты имму-ноферментного анализа с применением стандартных протоколов тестирования [33, 34].
1) Непрямой ИФА использовали для определения титра антител. С этой целью на 96-луночные планшеты MaxiSorp («Nunc», США) сорбировали очищенную БуХЭ плазмы крови человека, и далее вносили моноклональные антитела к БуХЭ в различных разведениях, или на планшетах сорбировали пептиды БуХЭ человека, и затем вносили моноклональные антитела или поликлональные сыворотки кроликов в различных разведениях; комплекс детектировали с помощью антивидовых антител козы, конъюгированных с пероксидазой хрена.
2) Конкурентный ИФА использовали для поиска пары моноклональных антител к БуХЭ человека. Для этого на 96-луночные планшеты MaxiSorp («Nunc», США) сорбировали БуХЭ плазмы крови человека, а затем инкубировали с моноклональными антителами к БуХЭ в различных разведениях в присутствии 10 нг/мл биотинилированного моноклонального антитела 4С6D8. Взаимодействие детектировали с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. Стартовая концентрация исследуемых антител составляла 100 нг/мл.
3) «Сандвич» ИФА проводили для определения концентрации БуХЭ. На 96-луночные планшеты MaxiSorp («Nunc», США) сорбировали моноклональные антитела 4C6D8 и инкубировали с образцами БуХЭ, денатурированными при различных условиях (рис. 3Б). Взаимодействие детектировали при помощи поликлональной сыворотки кроликов к полипептиду N1 БуХЭ (титр 1 : 1000). Проявляли с помощью антивидовых антител козы, конъюгированных с пе-роксидазой хрена.
Трансфекция эукариотических клеток методом липофекции
Перед проведением трансфекции плазмидные ДНК, предварительно линеаризованные эндонуклеазой рестрикции PvuI или BglII (в случае конструкции pcDNA/EF/PRAD), дополнительно очищали от примесей и солей. Липофекцию проводили с использованием Lipofectamine™Reagent и Plus™Reagent («Invitro-gen», США) согласно рекомендации производителя.
A
2.0
1.8
1.6
1.4
ш
0
1 1.2 I
0
3 1.0 с
о
□3C6D8
□ 1A1F1
□ 1B4F4
□ 1B4D12
□ 1A1F7
□ 4C6D8
□ 1A1D11
0.8 0.6 0.4 0.2 0_
100 150 200 250
Концентрация БуХЭ, нг/мл
§ 15 мин, 95оС § 0.05% SDS, 30 мин, 37оС
51% Тритон X-100, 30 мин, 37Со ^50 мМ NaOH, 30 мин, 37оС Неденатурированная БуХЭ
ЧБиа-
m n
а а
Б
N
В
Рис. 3. Фрагменты, кодирующие С-концевой, N1- и №-полипептиды БуХЭ, и экспрессионные конструкции pET28-C, pET28-N1, pET28-N2 (А). Анализ взаимодействия моноклональных антител с полноразмерной БуХЭ методом конкурентного ИФА. На оси абсцисс указан обратный десятичный логарифм разведения исследуемых антител (стартовая концентрация 100 нг/мл); концентрация биотинилированного антитела 4C6D8 оставалась неизменной и составляла 10 нг/мл. Проявляли конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена (Б). Анализ способов денатурации антигена для определения концентрации бутирилхолинэстеразы методом «сандвич» ELISA на примере моноклонального антитела 4C6D8. Методика ИФА описана в разделе «Экспериментальная часть» (б). Сравнительный анализ содержания бутирилхолинэстеразы в образцах из различных источников методами «сандвич» ELISA и Эллмана (Г)
Экспрессия рекомбинантной БуХЭ клетками линии CHO
Клетки выращивали в среде DMEM, содержащей 2% бычьей фетальной сыворотки и 2 мM L-глутамина, в инкубаторе при 37°С, 5% С02 во флаконах (25 см2). По достижению клетками 50-70% конфлюентности отбирали кондиционную ростовую среду и промывали клетки равным объемом стерильного 1 XPBS, после чего добавляли равный объем безбелковой ростовой среды Peprotech («Peprotech», США), EX-Cell («Sigma», США) или ProCHO4 («Lonza», Швейцария). Далее клетки инкубировали в безбел-ковой ростовой среде в течение 5 сут при 37°С и 5% С02. Каждые 24 ч отбирали пробу среды для определения содержания активной формы БуХЭ методом Эллмана.
Определение содержания активной формы фермента БуХЭ человека методом Эллмана [35]
Культуральную жидкость (50 мкл) смешивали со 100 мкл стерильного 1 XPBS, 100 мкл полученного раствора переносили в лунку 9б-луночного планшета. В качестве контроля для построения калибровочной кривой использовали БуХЭ из плазмы крови человека («Sigma», США). Перед началом измерения в лунки с образцами и контролями вносили 100 мкл раствора 50 мкM дитионитробензойной кислоты и 100 мкM бутирилтиохолинйодида в 1 XPBS. Измерения проводили на приборе TECAN GENios при длине волны 405 нм.
Очистка рекомбинантной БуХЭ человека из ростовой среды
Ростовую среду от клеток линии CHO центрифугировали при 800 g в течение 5 мин для удаления клеток, а затем при 3500 g в течение 15 мин для удаления клеточного дебриса. Супернатант фильтровали через мембраны Millipore HPWH с диаметром пор 0.22 мкм для удаления остатков примесей. Очищенный супернатант 3 раза концентрировали на мембранах Pellicon PLCTK30 («Mil-lipore», США) с последующим разведением буфером нанесения (50 hM калий-фосфатный буфер рН 7.2, 1 mM EDTA). Полученный концентрат среды наносили на аффинную смолу Procainamide-Sep-harose 4B [4] в режиме рециркуляции на скорости 0.5 мл/мин в течение ночи при +4°С. Рекомбинантную БуХЭ элюировали со смолы градиентом NaCl (0-500 mM) 15 объемами колонки при скорости потока 0.5 мл/мин. Полученную фракцию белка концентрировали на мембранах Centricon 10 («Milli-pore»), после чего дополнительно очищали методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200 («GE Healthcare»).
Определение содержания изоформ БуХЭ методом Карновского [36]
Электрофоретическое разделение белков в нативных условиях проводили по стандартной методике Лэммли [31] с незначительными модификациями. Для приготовления геля использовали водный стоковый раствор с соотношением акриламид-N,N,N,,N,-метилен-бисакриламид = 29 : 1. Концентрирующий (верхний) 4% гель готовили в 0.125 M Трис-HCl, pH б.9. Разделяющий (нижний) 8% гель готовили в 0.125 M Трис-HCl, pH 8.8. Электрофоретическое разделение проводили в буфере, содержащем 50 mM глицина,
5 mM Трис-HCl pH 8.0. Пробы наносили в буфере, содержащем 10% глицерин, 0.2 M Трис-HCl pH 7.5. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 8-10 мА на одну пластину геля, а в разделяющем геле - при 15-20 мА. После разделения белков в неденатурирующем ПААГ пластину с гелем переносили в раствор, содержащий 125 mM NaOH, 125 mM малеиновой кислоты, 11.б mM цитрата натрия, 10 mM CuSO4, 550 мкM гексацианоферрата(ІІІ) калия и 2 mM бутирилтиохолинйодида. Гель инкубировали в растворе в течение 3-8 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
Определение кинетических констант рекомбинантной БуХЭ методом Эллмана
Для определения кинетических констант использовали модифицированную реакцию Эллмана. Известное количество БуХЭ вносили в раствор, содержащий 1 mM дитионитробензойную кислоту в 0.1 M калий-фосфатном буфере pH 7.2, концентрация бутирилтиохолинйодида варьировала от 10 мкM до 1 mM. Количество активных центров БуХЭ определяли титрованием с диизопропилфторфосфатом (ДФФ). Реакцию проводили при 25°С, оптическое поглощение измеряли при 412 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Разработка системы экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека
Целью нашей работы было создание эффективной системы экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека. Поскольку препарат БуХЭ планируется использовать в качестве средства профилактики и терапии отравлений ФОТ, мы выбрали клетки линии СНО как хорошо изученную и одобренную FDA систему экспрессии рекомбинантных белков.
Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию БуХЭ, клетки линии CHO были трансфицированы методом ли-пофекции кольцевой плазмидной ДНК конструкций pGS/BChE [37], pcDNA/CMV/BChE (рис. 1А)
и pBudCE/EF/BChE (рис. 1Б), несущих ген бутирил-холинэстеразы человека под контролем различных промоторов. Через 48 и 72 ч после липофекции образцы культуральной среды отбирали для определения содержания активной формы БуХЭ методом Эллмана. В качестве контроля использовали кондиционные среды клеток линии CHO, выращенных в тех же условиях, что и трансфектомы. Из результатов, представленных на рис. 2А, видно, что уровень экспрессии конструкций pGS/CMV/BChE и pcDNA/CMV/BChE был сопоставимым и составил около 0.2 мкг/мл, тогда как у pBudCE/EF/BChE он оказался почти на порядок выше (1.45 мкг/мл). Таким образом, конструкция pBudCE/EF/BChE, содержащая ген БуХЭ под контролем промотора EF-1 (фактор элонгации 1), оказалась наиболее перспективной.
Плазмидную ДНК конструкции pBudCE/EF/BChE линеаризовали и трансфицировали методом липо-фекции в клетки линии CHO для получения стабильно экспрессирующего клона. Через 72 ч после липо-фекции клетки рассевали на 24-луночные планшеты из расчета 1 : 12 для получения стабильных транс-фектом. Селекцию проводили с использованием зе-оцина, который добавляли в ростовую среду в концентрации б00 мкг/мл. После селекции и анализа клетки рассевали на 9б-луночные планшеты для получения моноклонов. Продукцию активной формы БуХЭ на всех этапах определяли по методу Эллма-на. После сравнительного анализа экспрессии БуХЭ в одинаковых условиях наиболее перспективными моноклонами (рис. 2Б), а также проверки стабильности продукции БуХЭ этими клонами на протяжении пяти поколений пересеванием на 25 см2 флаконах, для дальнейшей работы отобрали клон АЗ. Следующим шагом стала адаптация этого клона к продукции БуХЭ на специальных безбелковых средах.
Был протестирован ряд сред, включая Pepro-tech («Peprotech»), EX-Cell («Sigma») и ProCHO4 («Lonza», Швецария). Для подбора условий экспрессии клетки клона A3 предварительно наращивали в среде DMEM, содержащей 2% бычьей фетальной сыворотки (FBS). По достижению клетками 70-90% конфлюентности среду заменяли на одну из тестируемых безбелковых сред и инкубировали в ней клетки на протяжении нескольких суток. Инкубация в средах Peprotech и EX-Cell приводила к гибели клеток на 1-2 сут. Эти среды были признаны неподходящими для данного моноклона. При инкубации клеток в среде ProCHO4 наблюдался значительный прирост продукции рБуХЭ к 9б ч инкубации (4 сут) (рис. 2В). Падение активности рБуХЭ на 5-е сут, вероятно, обусловлено протеолитической активностью вследствие гибели клеток.
Анализ олигомерного состава рБуХЭ, продуцируемой клоном А3/СНО, по методу Карновского (рис. 2Г, 3) показал, что рБуХЭ в основном представлена в форме мономера, а содержание тетра-мерной формы невелико. С фармакологической точки зрения именно тетрамер БуХЭ представляет интерес, поскольку время полувыведения тетрамера из организма составляет 3-4 дня, а мономера - несколько часов [4]. Ранее было показано, что при коэкспрессии БуХЭ и пептида PRAD - домена коллагеноподобного белка Со^ - количество тетрамеризованного продукта увеличивается [37]. Кроме того, добавление в ростовую среду химически синтезированного пептида, входящего в состав БуХЭ, также способствует тетрамеризации рекомбинантного белка [24]. Пептиды PRAD и пролин-богатый пептид БуХЭ очень похожи по структуре и, следовательно, могут обладать близкими свойствами. Однако синтез пептидов, содержащих несколько остатков пролина подряд, сложен, имеет невысокий выход и невыгоден в условиях биотехнологического производства, поэтому мы решили использовать коэкспрессию БуХЭ и пептида РГАБ под контролем различных промоторов. Для этого экспрессионные конструкции pcDNA/СMV/PRAD (рис. 1В) и pcDNA/EF/PRAD (рис. 1Г), несущие PRAD под контролем EF- или СMV-промотора, трансфицировали методом липофекции в клетки клона А3. Через 72 ч после трансфекции количество тетрамерной формы БуХЭ в среде контролировали электрофоретически по методу Карнов-ского. По результатам анализа (рис. 2Г, 4, 5) были выбраны клетки клона А3, трансфицированные плазмидой pcDNA3.1/EF/PRAD. Использование EF-промотора в данном случае позволяет получать клетки, продуцирующие большее количество тетрамерной формы БуХЭ. Экспрессионную конструкцию pcDNA/EF/PRAD линеаризовали эндонуклеазой рестрикции BgШ и трансфицировали методом липофекции в клетки клона А3 для получения стабильных клонов-продуцентов. Селекцию проводили, добавляя в ростовую среду 1.5 мг/мл гигромицина Б и 600 мкг/мл зеоцина. После селекции и анализа клетки рассевали на 96-луночные планшеты для получения моноклонов. Продукцию изоформ БуХЭ моноклонами определяли по методу Карновского, и по результатам тестирования был отобран клон А3Н9. После оптимизации условий экспрессии в ростовой среде РгоСН04 («^ома») по ранее описанной схеме удалось получить стабильно продуцирующий клон А3Н9, характерной особенностью которого является продукция тетра-мерной и димерной форм БуХЭ при полном отсутствии мономера (рис. 2Г, 6).
Таблица 2. Очистка рекомбинантной БуХЭ из ростовой среды
Стадия выделения Общая активность БуХЭ, ед. акт. Выход, % Общее количество БуХЭ, мг Удельная активность, ед. акт./мг
Ростовая среда 915 100 2.03 451
Концентрат среды 890 97 1.9б 454
Элюат со стадии аффинной хроматографии 825 90 1.81 45б
Гель-фильтрация, фракция 21 мин б50 71.5 1.41 4б1
Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка
В ходе работы оценку эффективности трансфекции и отбор клонов клеток линии CHO, продуцирующих рекомбинантную БуХЭ, проводили по функциональной активности фермента, с применением методик Эллмана [35] и Карновского [36]. В основе этих методик лежит способность БуХЭ гидролизовать бутирилтиохолин, что делает их неприменимыми в случаях, когда БуХЭ неактивна или ингибирована [38, 39].
Известно, что высокий уровень экспрессии рекомбинантных продуктов в клетках эукариот иногда сопровождается снижением их удельной активности, т.е. появлением некоторой доли неактивного белка. Часто это связано с тем, что собственная система посттрансляционных модификаций клетки не справляется с объемом продуцируемого белка, поэтому появляются неактивные продукты с неправильным фолдингом, неотщепленным пропептидом и другими дефектами. Подобные проблемы удается разрешить при коэкспрессии продукта с необходимыми шапе-ронами или ферментами, вовлеченными в посттран-сляционные модификации [40-44]. В связи с этим представлялось интересным оценить удельную активность нашего фермента при экспрессии.
Таким образом, перед нами возникла необходимость разработать систему прямой оценки содержания БуХЭ в образцах. Эту систему планировалось применять для характеристики рекомбинантной БуХЭ, количественного выявления неактивной БуХЭ в ростовой среде, а также для определения удельной активности фермента в процессе выделения и хроматографической очистки. Для определения концентрации белка в образцах наиболее простым и информативным является метод ИФА в формате «сандвич» ELISA. Анализ коммерчески доступных антител к БуХЭ человека показал, что на сегодняшний день не существует пары неконкурирующих моноклональных антител с возможностью применения в ИФА по типу «сандвич».
Последовательности, соответствующие Си N-концевым фрагментам БуХЭ (рис. 3А): С (322 а.о.), N1 и N2 (133 и 119 а.о.), были наработаны в прокариотической системе экспрессии и очищены. Моноклональные антитела 3C6D8, 1A1F1, 1B4F4, 1B4D12, 1A1F7, 4C6D8 и 1A1D11 к полноразмерной БуХЭ человека были получены по стандартной методике [33]. Методом конкурентного ИФА было показано, что все антитела взаимодействуют с С-концевым участком БуХЭ, причем конкурируют друг с другом (рис. 3Б). Вестерн-гибридизация с фрагментами БуХЭ подтвердила результаты ELISA (данные не приведены). Для преодоления возникшей проблемы были получены поликлональные сыворотки кроликов с использованием в качестве антигенов рекомбинантных по-липептидных фрагментов N1 и N2 БуХЭ. Методом ИФА в сыворотках выявлен одинаковый титр антител к обоим N-концевым фрагментам БуХЭ, однако с полноразмерной БуХЭ лучше связывались антитела к полипептиду N1. Несмотря на высокий уровень специфического взаимодействия антител с БуХЭ в непрямом ИФА, максимальный уровень сигнала в формате «сандвич» ELISA не превышал 0.6 ОЕ. Мы предположили, что частичная денатурация антигена увеличит доступность эпитопов и повысит тем самым чувствительность метода. Из опробованных методов денатурации БуХЭ (нагревание, добавление детергентов, щелочи) наиболее эффективной оказалась инкубация в течение 15 мин при 95оС (рис. 3В). По результатам анализов из панели моноклональных антител выбрали антитело 4C6D8, проявившее максимальную чувствительность в комбинации с поликлональными кроличьими антителами к N1-полипептиду.
В итоге был разработан количественный метод определения содержания БуХЭ в образцах культуральной среды, очищенных препаратах, а также в плазме крови человека. Сравнение определенной этим методом концентрации БуХЭ в образцах, с результатами, полученными по методике Эллмана, показало, что ферментативной активностью облада-
Таблица 3. Кинетические константы гидролиза бути-рилтиохолинйодида рекомбинантной БуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека
ют более 95% БуХЭ, экспрессируемой клоном А3Н9 в ростовую среду (рис. 3Г).
Выделение и функциональный анализ очищенного препарата рБуХЭ
Для изучения функциональной активности рБуХЭ очистили из ростовой среды. Разработанный протокол очистки включал стадии ультрафильтрации, концентрирования, аффинной очистки и гель-фильтрации. На каждой стадии очистки отбирали образец, в котором анализировали содержание активной формы БуХЭ методом Эллмана и оценивали количество белка методом ELISA. Данные анализа представлены в табл. 2. Конечный выход белка, полученного с чистотой 95% (по данным электрофореза), составил около 70%.
Кинетические параметры очищенного препарата рекомбинантной БуХЭ определяли в диапазоне концентраций субстрата от 10 до 1000 мкМ при концентрации фермента 5 нМ. На основании этих данных рассчитывали индивидуальные кинетические параметры реакции гидролиза (табл. 3). Сравнение кинетических констант рБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что величины Км одинаковы в пределах ошибки расчетов и составляют 25 и 23 мкМ [37] соответственно, а константы k2 (49200 и 39900 мин-1 соответственно) лишь незначительно различаются, что, по-видимому, связано со способами определения концентрации активных центров изучаемых ферментов. Известно также, что для бу-тирилхолинэстеразы, полученной из плазмы крови человека, характерна активация субстратом в реакциях с соединениями холинового ряда. Аналогичный эффект наблюдается и в случае гидролиза бутирилхолинйодида рекомбинантной БуХЭ при концентрациях субстрата больше 500 мкМ. Это
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Jbilo O., L'Hermite Y., Talesa V., Toutant J.P., Chatonnet A. // Eur. J. Biochem. 1994. V. 225. P. 115-124.
позволило рассчитать константу Kss и параметр b. Для рекомбинантной БуХЭ параметр b отличался от литературного значения 2.5 ± 0.1 [37] в пределах ошибки и составил 2.4 ± 0.27. Таким образом, можно сделать вывод, что полученная рекомбинантная БуХЭ функционально активна, и организация активного центра одинакова у рекомбинантного и природного фермента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований удалось разработать эффективную систему экспрессии активной бутирилхолинэстеразы человека в клетках линии СНО. Использование промотора EF-1 позволило значительно увеличить продукцию рекомбинантного белка клетками - с 3-5 до 40 мг/л. Рассчитанные кинетические константы свидетельствуют
об интактности активного центра фермента. Анализ изоформ рБуХЭ в ростовой среде показал, что фермент продуцируется преимущественно в форме димера и тетрамера.
Разработанная методика ИФА позволила количественно оценить содержание БуХЭ в образцах культуральной среды, очищенных препаратах, а также в плазме крови человека. Сравнение величин концентрации БуХЭ в образцах с данными, полученными по методике Эллмана, показало, что более 95% БуХЭ, экспрессируемой клоном А3Н9 в ростовую среду, является активной, и в процессе очистки препарата удельная активность рБуХЭ не снижается.
На следующем этапе работы предполагается дальнейшее улучшение фармакодинамических характеристик рекомбинантного фермента с помощью химических модификаций, таких, как, например, пе-гилирование [45] или сиалирование [46].
Авторы выражают благодарность проф. Оксане Локридж (Oksana Lockridge, UNMC, Omaha, USA) за предоставленные для работы конструкции pGS/CMV/BChE и pRc/RSV-rQ45.
Работа поддержана РФФИ (грант № 10-04-00673-а), ФЦП (государственный контракт № 2046.2012.4) научной школы «Химические основы биокатализа», Программой Президиума РАН № 24 «Нанотехнологии и наноматериалы» и Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научнотехнической сфере - программа «УМНИК».
2. Mesulam M. // Neuroscience. 2002. V. 110. P 627-639.
3. Saxena A., Sun W., Fedorko J.M., Koplovitz I., Doctor B.P. // Biochem. Pharmacol. 2011. V. 81. P 164-169.
Константа рБуХЭ БуХЭ плазмы крови [37]
KM, мкМ 25 ± 1 23 ± 2
k , мин-1 49200 ± 800 39900 ±1800
K , мкМ ss’ 250 ± 30 140 ± 20
b 2.4 ± 0.2 2.5 ± 0.1
4. Lockridge O., Schopfer L.M., Winger G., Woods J.H. // J. Med. Chem. Biol. Radiol. Def. 2005. V. 3. P. 1-23.
5. Raveh L. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997. V. 145. P. 43-53.
6. Masson P., Rochu D. // Acta Naturae. 2009. V. 1. № 1. P. 68-78.
7. Masson P., Nachon F., Broomfield C.A., Lenz D.E., Verdier L., Schopfer L.M., Lockridge O. // Chem. Biol. Interact. 2008.
V. 175. P. 273-280.
8. Lockridge O., Bartels C.F., Vaughan T.A., Wong C.K., Norton S.E., Johnson L.L. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 549-557.
9. Lenz D.E., Yeung D., Smith J.R., Sweeney R.E., Lumley L.A., Cerasoli D.M. // Toxicology. 2007. V. 233. P. 31-39.
10. Masson P., Carletti E., Nachon F. // Protein Pept. Lett. 2009.
V. 16. P. 1215-1224.
11. Geyer B.C., Kannan L., Cherni I., Woods R.R., Soreq H., Mor T.S. // Plant Biotechnol. J. 2010. V. 8. P. 873-886.
12. Masson P., Adkins S., Pham-Trong P., Lockridge O. // Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions. Expression and refoldin of functional human butyrylcholinesterase in E. coli. N.Y.: Plenum Press, 1992.
13. Kishnani P.S., Corzo D., Nicolino M., Byrne B., Mandel H., Hwu W.L., Leslie N., Levine J., Spencer C., McDonald M., et al. // Neurology. 2007. V. 68. P. 99-109.
14. Schwartz R.S., Abildgaard C.F., Aledort L.M., Arkin S., Bloom A.L., Brackmann H.H., Brettler D.B., Fukui H., Hilgartner M.W., Inwood M.J. // N. Engl. J. Med. 1990. V. 323.
P. 1800-1805.
15. White G.C., Beebe A., Nielsen B. // Thromb. Haemost. 1997.
V. 78. P. 261-265.
16. Jacobs L.D., Cookfair D.L., Rudick R.A., Herndon R.M., Richert J.R., Salazar A.M., Fischer J.S., Goodkin D.E., Granger C.V., Simon J.H., et al. // Ann. Neurol. 1996. V. 39. P. 285-294.
17. Barngrover D. // J. Biotechnol. 2002. V. 95. P. 280-282.
18. Tabuchi H., Sugiyama T., Tanaka S., Tainaka S. //
Biotechnol. Bioeng. 2010. V. 107. P. 998-1003.
19. Porter A.J., Dickson A.J., Racher A.J. // Biotechnol. Progr. 2010. V. 26. P. 1446-1454.
20. Strnad J., Brinc M., Spudic V., Jelnikar N., Mirnik L.,
Carman B., Kravanja Z. // Biotechnol. Progr. 2010. V. 26.
P. 653-663.
21. Mizushima S., Nagata S. // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18.
P. 5322.
22. Boshart M., Weber F., Jahn G., Dorsch-Hasler K., Fleckenstein B., Schaffner W. // Cell. 1985. V. 41. P. 521-530.
23. Nachon F., Nicolet Y., Viguie N., Masson P., Fontecilla-Camps J.C., Lockridge O. // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 630-637.
24. Li H., Schopfer L.M., Masson P., Lockridge O. // Biochem. J. 2008. V. 411. P. 425-432.
25. Altamirano C.V., Lockridge O. // Biochemistry. 1999. V. 38.
P. 13414-13422.
26. Huang Y.-J., Huang Y., Baldassarre H., Wang B., Lazaris A., Leduc M., Bilodeau A.S., Bellemare A., Cote M., Herskovits P., Touati M., Turcotte C., Valeanu L., et al. //Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2007. V. 104. P. 13603-13608.
27. Geyer B.C., Kannan L., Garnaud P.-E., Broomfield C.A., Cadieux C.L., Cherni I., Hodgins S.M., Kasten S.A., Kelley K., Kilbourne J., Oliver Z.P., Otto T.C., Puffenberger I., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 20251-20256.
28. Freshney R.I. Culture of animal cells. Oxford, N.Y.: Wiley-Blackwell, 2005. P. 642.
29. Duysen E.G., Bartels C.F., Lockridge O. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. V. 302. P. 751-758.
30. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor. N.Y.; Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001.
31. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. N.Y.; Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.
32. Schlesinger N., Baker D.G., Schumacher H.R. // J. Rheumatol. 1997. V. 24. P. 1018-1019.
33. Harlow E., Harlow E., Lane D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. N.Y.; Cold Spring Harbor Lab. Press, 1988.
34. Ausubel F.M. // Current Protocols. 2002. Unit 2.7.
35. Ellman G.L., Courtney K.D., Anders V., Feather-Stone R.M. // Biochem. Pharmacol. 1961. V. 7. P. 88-95.
36. Karnovsky M.J., Roots L. // J. Histochem. Cytochem. 1964.
V. 12. P. 219-221.
37. Xie W., Altamirano C.V., Bartels C.F., Speirs R.J., Cashman J.R., Lockridge O. // Mol. Pharmacol. 1999. V. 55. P. 83-91.
38. Bartels C.F., Jensen F.S., Lockridge O., van der Spek A.F., Rubinstein H.M., Lubrano T., La Du B.N. // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 50. P. 1086-1103.
39. Wang Y., Boeck A.T., Duysen E.G., van Keuren M., Saunders T.L., Lockridge O. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004. V. 196.
P. 356-366.
40. Preininger A., Schlokat U., Mohr G., Himmelspach M., Stichler V., Kyd-Rebenburg A., Plaimauer B., Turecek P.L., Schwarz H.P., Wernhart W., Fischer B.E., Dorner F. // Cytotechnology. 1999. V. 30. P. 1-15.
41. Wajih N., Hutson S.M., Owen J., Wallin R. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 31603-31607.
42. Josse L., Smales C.M., Tuite M.F. // Biotechnol. Bioeng. 2010. V. 105. P. 556-566.
43. Meleady P., Henry M., Gammell P., Doolan P., Sinacore M., Melville M., Francullo L., Leonard M., Charlebois T., Clynes M. // Proteomics. 2008. V. 8. P. 2611-2624.
44. Roncarati R., Seredenina T., Jow B., Jow F., Papini S., Kramer A., Bothmann H., Dunlop J., Terstappen G.S. // Assay Drug Dev. Technol. 2008. V. 6. P. 181-193.
45. Chilukuri N., Sun W., Naik R.S., Parikh K., Tang L., Doctor B.P., Saxena A. // Chem. Biol. Interact. 2008. V. 175. P. 255-260.
46. Jain S., Hreczuk-Hirst D.H., McCormack B., Mital M., Epene-tos A., Laing P., Gregoriadis G. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1622. P. 42-49.
