CC BY
30
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.218
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ВЕКТОРОВ РАЗЛИЧНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ЭКСПРЕССИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
^1-ИЗОТИПА
В.В. Аргентова1, *, Т.К. Алиев3, В.А. Топорова4, В.С. Рыбченко2, Д.А. Долгих4, М.П. Кирпичников1
1 Кафедра биоинженерии и 2кафедра биохимии, биологический факультет, Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
3кафедра химической энзимологии, химический факультет, Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3;
4Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Россия, 117997, г. Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10 *e-mail: [email protected]
Терапевтические препараты антител по применению и производству занимают на мировом фармацевтическом рынке второе место после вакцин. Наиболее распространенными терапевтическими антителами являются моноклональные антитела (МАт) IgG-изотипа, продуцируемые в эукариотических клетках СНО. В последнее время значительный интерес вызывает возможность разработки терапевтических препаратов на основе антител IgA-изотипа, способных проявлять широкий спектр эффекторных функций на слизистых оболочках человека. Для исследования уровня экспрессии иммуноглобулинов A (IgA) в клетках млекопитающих был сконструирован набор бипромоторных (CMV, EF1a) векторов, содержащих вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей человеческого антитела FI6v3 против гемагглютинина вируса гриппа А, константные домены IgA1 тяжёлой и лёгкой (каппа-типа) цепей антитела человека. Полученные экспресси-онные векторы отличались друг от друга различной ориентацией промоторов, а также наличием или отсутствием интронов. Два варианта полноразмерных тяжёлых и лёгких цепей были клонированы в экспрессионный вектор в однонаправленной и разнонаправленной ориентациях. Полученными плазмидами трансфицировали клетки CHO-DG44 и HEK-293T. Уровень продукции антител был определён при помощи иммуноферментного анализа для стабильной трансфекции клеток CHO-DG44 и HEK-293T. Результаты экспериментов свидетельствуют о существенном увеличении продукции антител FI6v3-IgA1 при трансфекции эукариотических клеток плазмидой pBiPr-ABIgA1FI6-Iht с интронами в тяжёлой цепи IgA1 и с однонаправленной ориентацией промоторов.
Ключевые слова: бипромоторный вектор, вирус гриппа А, интроны, ориентация промоторов, эукариотическая экспрессия, моноклональные антитела IgA1
В последнее время иммунотерапия с использованием рекомбинантных антител становится всё более распространенной. Методы продукции и очистки антител человека изотипа ^О1 хорошо изучены и широко применяются, однако в последние годы увеличивается внимание и к применению антител изотипа ^А в связи с их высоким потенциалом для терапии инфекционных и опухолевых заболеваний [1].
Хотя функционально IgA сходен с ^О, основной функцией ^А является защита слизистых оболочек дыхательной, пищеварительной и мочеполовой систем. Молекулярная структура мономерного ^А (гетеротетрамер Н^2) близка к строению антител других изотипов [2]. В сыворотке крови антитела изотипа IgA преимущественно мономерны,
однако на слизистых оболочках функционируют как димеры, образующиеся за счёт дисульфидных связей на С-концах тяжёлых цепей, J-цепи и секреторного компонента. Антитела IgA имеют оба сайта М- и О-гликозилирования [3], что накладывает некоторые ограничения на выбор систем для их продукции
Важным представляется тот факт, что именно димерные IgA-антитела выполняют особые эф-фекторные функции, что выгодно отличает их от мономерных форм IgA и ^О.
Антитела IgA связываются с другим набором клеточных рецепторов по сравнению с антителами ^О и поэтому их фармакокинетика выгодно отличается от таковой для ^О [4]. Было показано, что антитела IgA обладают более выраженной спо-
собностью, чем антитела IgG, уменьшать образование вирусных бляшек с гетерологичными подтипами вирусов гриппа. Это подтверждает разницу в антивирусном потенциале IgA и IgG [5]. Ранее было показано, что IgA может очень эффективно нейтрализовать вирусы в вирус-инфицированных секреторных эпителиальных клетках. Поэтому выраженное участие IgA-антител в иммунном ответе может быть особенно важным в случае высокопатогенных штаммов, когда наибольшие осложнения связаны с неконтролируемыми воспалительными реакциями [6, 7].
Однако, несмотря на уникальные характеристики и терапевтический потенциал, антитела IgA исследованы не очень подробно. Основными проблемами, затрудняющими работу с ними, являются недостаточная разработанность методов биосинтеза и очистки, а также трудности с получением достаточного количества рекомбинантных антител для исследований in vivo. Если необходимый для клинических исследований уровень антител IgG человека обычно достигается в стандартно разработанных экспрессионных системах клеток млекопитающих, в которых добиваются посттрансляционных модификаций и типов гликозилирования, свойственных антителам человека, то для IgA отсутствует единый подход к конструированию системы их экспрессии. В связи с этим большое практическое значение приобретает оптимизация стандартных методов продукции IgA. К сожалению, большинство предыдущих работ по изучению влияния конструкций векторов на экспрессию в клетках млекопитающих было проведено для IgG. Так, одним из аспектов исследования было изучение регулируемой экспрессии тяжёлой и лёгкой цепей IgG. Трансфекция эукариотических клеток двумя независимыми плазмидами, содержащими одну из цепей, выявила выраженную зависимость экспрессии от сайта интеграции [8], что влияло на соотношение тяжёлой и лёгкой цепей при экспрессии. Известно, что для стабильной экспрессии в клетках CHO экспрессионный вектор должен обеспечивать соотношение "тяжёлая цепь : лёгкая цепь" менее чем 1:2, что делает возможным получение большой фракции клеточных клонов с высоким уровнем экспрессии моноклональных антител [9]. Более эффективным для продукции IgG в клетках млекопитающих оказался вектор, содержащий би-цистронную конструкцию [10, 11]. Был изучен уровень продукции рекомбинантного IgG при различном дизайне экспрессионных векторов при транзиентной и стабильной экспрессии в клетках HEK-293T, CHO-K1(13) и CHO-DG44 [12-15].
Одним из преимуществ использования антител IgA в качестве терапевтического средства против гриппа является их мукозальное применение. Ранее было выделено моноклональное антитело FI6, узнающее гемагглютинин всех 16 серотипов и нейтрализующее группы 1 и 2 вируса гриппа А [16].
Получение терапевтических средств на основе 1^А-антител требует разработки стабильных высокопродуктивных клеточных линий. В связи с этим получение новых оптимизированных конструкций экспрессионных векторов и исследование их влияния на продуктивность рекомбинантных 1&А-ан-тител имеют важное значение. Цель настоящей работы заключалась в усовершенствовании эука-риотического вектора для повышения уровня экспрессии ^А на основе вариабельных доменов антитела FI6 к гемагглютинину вируса гриппа А в клетках млекопитающих. В задачи исследования также входило выяснение влияния наличия ин-тронов в области константного домена тяжёлой цепи на уровень продукции рекомбинантных антител при трансфекции эукариотических клеток соответствующим вектором.
Материалы и методы
Создание экспрессионных плазмид для продукции рекомбинантных антител в клетках млекопитающих. Для получения гена лёгкой цепи антитела FI6v3 [16] с секреторным пептидом антитела F10
[17] с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице плазмиды pOpti-F10L-MluI
[18] получали фрагменты, содержащие последовательности секреторного пептида F10L и константного домена легкой каппа-цепи [17—19]. Аналогично на матрице ранее сконструированной плазмиды pTrc99A-stIIFI6LH [20] получали фрагмент, содержащий последовательность вариабельного домена антитела FI6v3. Последовательности объединяли с помощью метода ПЦР с использованием коротких перекрывающихся последовательностей (80Б-PCR), результирующий фрагмент обрабатывали рестриктазами МИе! и ХИо! и клонировали по данным сайтам в экспрессионный вектор p0pti-F10L-МШ [18], полученный на основе p0ptiVEC™-T0P0® (Invitrogen).
Для получения гена вариабельной области тяжелой цепи FI6v3 с секреторным пептидом F10H на матрице плазмид pTrc99A-stIIFI6LH [20] и pcDNA3.3-H [18] получали фрагменты, содержащие кодирующие последовательности вариабельного домена тяжёлой цепи FI6v3 и секреторного пептида F10H [17], соответственно, после чего состыковали последовательности с помощью метода ПЦР с удлинённым перекрытием (S0E-PCR). Полученный фрагмент обрабатывали рестриктазами NheI и Bsp120I, клонировали в плазмиду pcDNA3.3-H [18] и секвенировали, получая таким образом плазмиду pcDNA3.3-FI6HG1.
На матрице геномной ДНК человека с помощью ПЦР получали фрагменты, содержащие отдельные экзоны IgA1, которые клонировали в pAL-TA (Ев-роген, Россия), и секвенировали. Для получения кодирующей последовательности изотипа IgA1 с помощью ПЦР на матрице полученных клонов отдельно синтезировали последовательности каж-
дого из трёх экзонов IgA1. Полученные фрагменты объединяли с помощью метода ПЦР с удлинённым перекрытием. Одновременно удаляли сайт рестрикции XhoI во втором экзоне гена с помощью сайт-направленного мутагенеза. Результирующий фрагмент обрабатывали рестриктазами SacI и XhoI. Затем полученный фрагмент совместно с фрагментом NheI-Bsp120I из плазмиды pcDNA3.3-FI6HG1 клонировали по сайтам узнавания рестриктаз NheI и XhoI в промежуточный вектор pSK+/hEF1-HTLV-BGH [18], содержащий гибридный промотор hEF1-HTLV и сайт полиаденилирования BGH, получая плазмиду pSK-EF1-FI6HA1-BGH. Фрагмент MluI-MluI из плазмиды pSK-EF1-FI6HA1-BGH, содержащий ген тяжёлой цепи антитела FI6 изотипа IgA1 c секреторным пептидом F10, был поставлен под контроль промотора hEF1-HTLV и содержал сайт полиаденилирования BGH. В результате данного клонирования были получены две разные конструкции, отличающиеся по типу ориентаций — с однонаправленной (pBiPr-ABIgA1FI6-ht,) и разнонаправленной (pBi-Pr-ABIgA1FI6-hh) транскрипцией генов тяжёлой и лёгкой цепей антитела. Далее в тексте однонаправленная ориентация промоторов (ht) обозначается как "голова-хвост", а разнонаправленная (hh) — "голова-голова". Схематическое изображение плазмид приведено на рис. 1 А, Б.
Кодирующую последовательность константных доменов гена IgA, состоящую из экзонов, разделённых двумя интронами, получали в два этапа. На первом этапе, используя геномную ДНК человека в качестве матрицы, получали два фрагмента с помощью ПЦР с праймерами для удаления сайта рестрикции XhoI во втором экзоне IgA1 и праймерами, ограничивающими нуклеотид-ную последовательность константных доменов IgA1, которые клонировали в pAL-TA (Евроген, Россия) и секвенировали. На втором этапе на матрице клонов с помощью ПЦР с теми же праймерами получали два фрагмента с одновременным удалением сайта рестрикции XhoI во втором экзоне гена, фрагменты объединяли с использованием метода ПЦР с удлинённым перекрытием. Клонирование проводили аналогично схеме для кодирующей последовательности IgA1 без интронов (см. выше). В результате также было получено две разные конструкции, отличающиеся по типу ориентации — с однонаправленной (pBiPr-ABIgA1FI6-Iht) и разнонаправленной (pBiPr-ABIgA1FI6-Ihh) транскрипцией генов тяжёлой и лёгкой це-
Ж гЖ
iM
< ш
Q)
ПРИ
ПРИ
НРП
а к
S н
1 ftg й ч
й S
w ?
ä и
К н
'S ^S Л се
й hlS
се се Ч и
Р" Z
Кд Я Н
се д. - а з
а З^ЯЧ
К <
о 5 ^¡ч . _
Я МйД ы
МЧ^ РЧ
^Зйсе „j
S й
л U !
о о ' Н о !
Й - ! л ¡^ -
« о I
nss к Эй ¡а s
> л
W о & % <
s ft
чй I
^ . - л
о . .- к о « < g g
пей антитела. Схематическое изображение плазмид приведено на рис. 1 В, Г.
Получение препаратов плазмидной ДНК для трансфекции. Плазмидную ДНК нарабатывали в клетках E. coli штамма Nova Blue (DE3) (Novagen, США) и выделяли с помощью набора "Plasmid Miniprep" (Евроген, Россия). Концентрацию полученной плазмиды определяли спектрофотометри-чески по поглощению при длине волны 260 нм на приборе "Implen NanoPhotometer® P200" (Implen GmbH, Германия). Чистоту и линейность плазмиды определяли с помощью электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле (рис. 2). Плазмидную ДНК линеаризовали с помощью рестриктазы Ple19I (НПО "СибЭнзим", Россия).
Рис. 2. Электрофореграмма линеаризованных экспрессион-ных плазмид. 1 — маркер молекулярных масс (O'GeneRuler 1kb DNA ladder Fermentas, 250 bp — 10kb), 2 — плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-hh, 3 - плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-Iht, 4 - плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-Ihh, 5 - плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-ht
Трансфекция. Клетки CHO-DG44 (dhfr-) (Thermo Fisher Scientific, США) выращивали с использованием стандартной среды IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco, США) c использованием 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HI FBS, Gibco, США), а клетки HEK-293T -на среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, США) c использованием 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HI FBS, Gibco, США) в СО2-инкубаторе при 96%-ной влажности, 37°С и 8% СО2.
Для стабильной трансфекции исходные клетки, достигшие >90% сомкнутого монослоя, высевали в количестве 400 000 клеток/лунку. Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводилось с использованием 0,04%-ного раствора три-панового синего (Gibco, США) в камере Горяева. Клетки выращивали в 6-луночных планшетах (Greiner Bio-One, Германия) по достижению ими 80-90% сомкнутого монослоя. Трансфекцию исходных клеток проводили с применением трансфицирующего реагента Lipofectamine-3000 Transfection Kit (Invit-rogen, США) по стандартному протоколу, представленному производителем. Клетки, в которые добавляли реагент Lipofectamine-3000 при отсутствии плазмидной ДНК, являлись отрицательным контролем на каждом планшете. Трансфекция проводилась четырьмя вариантами плазмид: pBiPr-ABIgA1FI6-hh, pBiPr-ABIgA1FI6-Iht, pBiPr-ABIgA1FI6-Ihh, pBiPr-ABIgA1FI6-ht (рис. 1).
После проведения трансфекции клетки инкубировали в течение 72 ч. Во временные интервалы 24, 48 и 72 ч (для определения наиболее эффективного времени после трансфекции) были взяты пробы для иммуноферментного анализа (ИФА).
Иммуноферментный анализ. Экспрессию IgA определяли методом непрямого ИФА. На 96-лу-ночные планшеты в качестве антигена наносились моноклональные антитела мыши к каппа-домену лёгкой цепи иммуноглобулинов человека (Биа-лекса, Россия) в количестве 0,5 мкг/лунку. При проведении анализа использовали Anti-Human IgA (a-chain specific) (Sigma, США), коньюгированные с пероксидазой хрена. В качестве стандарта использовали IgA из сыворотки человека (Sigma, США).
Результаты и обсуждение
Для экспрессии рекомбинантного IgА были сконструированы экспрессионные бипромоторные плазмиды: pBiPr-ABIgA1FI6-hh, pBiPr-ABIgA1FI6-ht, pBiPr-ABIgA1FI6-Ihh, pBiPr-ABIgA1FI6-Iht. В ходе конструирования ген лёгкой цепи был поставлен под контроль промотора CMV и сигнала полиаде-нилирования TKpA, ген тяжёлой цепи — под контроль рекомбинантного промотора HEF1-HTLV и сигнала полиаденилирования BGH. Присутствие лидерных пептидов на N-концевых частях лёгкой и тяжёлой цепей позволяло осуществлять секрецию иммуноглобулина непосредственно в культу-
ральную среду. В ходе клонирования тяжёлой цепи в экспрессионный вектор по сайту М1и1 были получены два типа ориентации (рис. 1): с однонаправленной (Ы) и разнонаправленной (ИИ) транскрипцией. Для осуществления селекции трансфицированных клеток в средах без гипоксантина и тимидина экс-прессионный вектор содержал ген дигидрофолат-редуктазы (ДГФР). Данный ген располагался на мРНК лёгкой цепи на расстоянии 650 п.н. от гена лёгкой цепи по ходу транскрипции. Трансляция гена ДГФР обеспечивалась с помощью ЖЕ8-элемента, который располагался против хода транскрипции гена ДГФР.
Наряду с влиянием ориентации промоторов было также изучено влияние интронов в константном домене на экспрессию антител. Для сравнения полученных плазмидных конструкций были использованы два вида эукариотических клеток: СНО-DG44 — как наиболее часто используемые при получении терапевтических антител, а также клетки человека линии НЕК-293Т. Использование НЕК-293Т было обусловлено тем, что процесс гликози-лирования в клетках человека отличен от такового в клетках китайского хомячка. Так, было показано, что клетки СНО продуцируют гликан преимущественно трёхветвистой структуры, тогда как сывороточный ^А человека обладает в основном двухветвистой структурой, что приводит к разнице в продуцировании IgA [15].
Результаты ИФА для проб, отобранных через 24, 48 и 72 ч (рис. 3), показали преимущество экспрессии в клетках НЕК-293Т по сравнению с экспрессией в CHO-DG44 в случае трансфекции серией плазмид, не содержащих интроны в константных регионах IgA1. При этом, если при трансфекции плазмидой с ориентацией направления транскрипции "голова-голова" разница между двумя типами клеток была незначительна, для ориентации "голова-хвост" уровень экспрессии в клетках НЕК-293Т оказался в 2 раза большим, чем в клетках CHO-DG44. Однако наилучший уровень экспрессии антител был получен при трансфекции плазмидой с ориентацией направления транскрипции "голова-хвост" как для CHO-DG44, так и для НЕК-293Т. Результаты по экспрессии антител, полученные при трансфекции плазмидами, содержащими интроны в области константных доменов ^А1, также продемонстрировали, что максимальный уровень достигается для варианта "голова-хвост" при экспрес-
Рис. 3. Концентрация антител IgA1 в культуральной среде после трансфекции клеток CHO-DG44 и НЕК-293Т различными конструкциями плазмид через 24, 48 и 72 ч. Определение концентрации антител IgA1 в культуральной среде осуществляли методом ИФА
сии в обеих клеточных линиях. При этом, если уровень экспрессии антител при трансфекции плаз-мидой с разнонаправленной ориентацией в клетках китайского хомячка составил 5,5 мг/л, то для варианта с однонаправленной транскрипцией — 17 мг/л. Таким образом, уровень экспрессии антител во втором случае был выше в 3 раза.
Результаты экспериментов показали, что для обоих типов клеток наблюдаются одинаковые закономерности влияния направления промоторов и наличия интронов на уровень биосинтеза антител изотипа IgA1. При этом максимальные результаты продемонстрировал вариант трансфекции экспрессионной плазмидой, содержащей интроны и однонаправленную ориентацию транскрипции.
Работа выполнена при финансовой поддержке субсидии (Соглашение № 14.607.21.0060), выделяемой Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках реализации федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы" (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI60714X0060).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Beyer T., Lohse S., Berger S, Peipp M., Valerius T, Dechant M. Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies // J. Immunol. Methods. 2009. Vol. 346. N 1-2. P. 26-37.
2. Woof J.M., Kerr M.A. The function of immunoglobulin A in immunity // J. Pathol. 2006. Vol. 208. N 2. P. 270-282.
3. Woof J.M., Russell M.W. Structure and function relationships in IgA // Mucosal Immunol. 2011. Vol. 4. N 6. P. 590-597.
4. Lohse S., Derer S., Beyer T., Klauz K., Peipp M., Leu-sen J.H.W., Van de Winkel J.G.J, Dechant M., Valerius T. Recombinant dimeric IgA epidermal growth factor receptor mediate effective tumor cell killing // J. Immunol. 2011. Vol. 18. N 6. P.3770—3778.
5. Muramatsu M., Yoshida R., Miamoto H., Tomabechi D., Masahiro K. Heterosubtypic antiviral activity of hemaggluti-nin-specific antibodies induced by intranasal immunization
with inactivated influenza viruses in mice // PLoS One. 2013. Vol. 8. N 8. e71534.
6. Van Riet E, Ainai A, Suzuki T, Hasegawa H. Mucosal IgA responses in influenza virus infections; thoughts for vaccine design // Vaccine. 2012. Vol. 30. N 40. P. 5893-5959.
7. Blutt S.E., Miller A.D., Salmon L, Metzger D.W., Conner M.E. IgA is important for clearance and critical for protection from rotavirus infection // Mucosal Immunol. 2012. Vol. 5. N 6. P. 712-719.
8. Corti D., Voss J., Gamblin S. J., et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binding to group1 and group2 influenza A hemagglutinin // Science. 2011. Vol. 33. N 6044. P. 850-856.
9. Wurm F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells // Nat. Biotechnol. 2004. Vol. 22. N.11. P. 1393-1398.
10. Schlatter S, Stansfield S.H., Dinnis D.M., Racher A.J., Birch J.R., James D.C. On the optimal ratio of heavy to light chain genes for efficient recombinant antibody production by CHO cells // Biotechnol. Prog. 2005. Vol. 21. N.1. P. 122-133.
11. Jostock T, Vanhove M., Brepoels E, van Gool R., Daukandt M., Wehnert A., van Hegelsom R., Dransfield D., Sexton D., Devlin M., Ley A., Hoogenboom H.R., Müllberg J. Rapid generation of functional human IgG antibodies derived from Fab on-phage display libraries //J. Immunol. Methods. 2004. Vol. 289. N. 1-2. P. 65-80.
12. Li J., Menzel C., Meier D.,Zhang C., Dübel S., Jostock T. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies // J. Immunol. Methods. 2007. Vol. 318. N 1-2. P. 113-124.
13. Chusainow J, Yang Y.S., Yeo J. H.M., Toh P.C., AsvadiP., Wong N.S., Yap M.G. A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines: What makes a stable high producer? // Biotechnol. Bioeng. 2009. Vol. 102. N 4. P. 1182-1194.
14. Van Craenenbroeck K., Vanhoenacker P., Haegeman G. Episomal vectors for gene expression in mammalian cells // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. N 18. P. 5665-5678.
15. Bout A., Halford D., Jones A. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells. Patent EP1508576A1, 2005.
16. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binding to group1 and group2 influenza A hemagglutinin // Science.2011. Vol. 333. N 6044. P. 850-856.
17. Radko B.V., Boitchenko V.E., Nedospasov S.A., Ko-robko V.G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor // Russ. J. Immunol. 2002. Vol. 7. N 4. P. 371-374.
18. Алиев Т.К., Балабашин Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Панина А.А., Топорова В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия эукариотических клеток — продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела. Патент № 2555533, Россия, 23.05.2013.
19. Balabashin D., Kovalenko E., Toporova V., Aliev T., Panina A., Svirshchevskaya E., Dolgikh D., Kirpichnikov M. Production of anti tnf-a antibodies in eukaryotic cells using different combinations of vectors carrying heavy and light chains // Cytotechnology. 2015. Vol. 67. N 5. P. 761-772.
20. Aliev T.K., Dement'yeva I.G., Bokov M.N., Pozdnya-kova L.P., Sveshnikov P.G., Toporova V.A., Rybchenko V.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Development and properties of recombinant proteins based on the broadly neutralizing antibody to influenza A virus // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016. Vol.71. N 2. P. 87-92.
Поступила в редакцию 12.12.2016 Принята к печати 02.03.2017
MOLECULAR BIOLOGY
STUDIES OF THE INFLUENCE OF DIFFERENT EUKARYOTIC VECTORS' DESIGN ON THE EXPRESSION OF RECOMBINANT ANTIBODY IgA1 ISOTYPE
V.V. Argentova1, *, T.K. Aliev3, V.A. Toporova4, V.S. Rybchenko2, D.A. Dolgikh4, M.P.Kirpichnikov1
1 Department of Bioengineering and 2Department of Biochemistry, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, Russia;
3 Department of Chemical Enzymology, School of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—3, Moscow, 119234, Russia;
4 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,
Russian Academy of Sciences, Miklukho-Maklaya ul. 16/10, GSP-7, Moscow, 117997,
Russia
*e-mail:[email protected]
Production and application of therapeutic monoclonal antibodies take second place in the global pharmaceutical market after vaccines. Nowadays the IgG1 is one of the prevailing monoclonal antibodies type for the therapeutic use that are produced in CHO cells. Recently the possibility of developing therapeutic drugs based on antibodies of IgA-isotype has demonstrated a broad range of effector functions on human mucous membranes, which has caused a significant interest in this research field. In our research about level of IgA1 antibody expression in mammal cells, we designed a set of bipromoter (CMV, EF1a) vectors containing variable regions of heavy chain (VH) and light chain (VL) genes from human monoclonal antibody FI6v3 against influenza A virus, constant regions IgA1 of heavy and light chains of human antibody (with or without introns). The vectors differed in mutual orientation of promoters and presence or lack of introns. Two versions of the full-length light and heavy chains were cloned in eukaryotic expressing vector in "head-head"/ "head-tail" orientations and then transfected into HEK-293T and CHO/dhfr-
cells. The level of antibody production was determined using ELISA test for transfection of CHO DG44 and HEK-293T cell culture. The results of the experiments showed a significant increase in the production of FI6v3-IgA1 antibodies when eukaryotic cells were transfected with a plas-mid pBiPr-ABIgA1FI6-Iht containing introns in constant regions of IgA1 and with orientation of transcription in the "head-tail" direction.
Key words: Bi-promoter vector, influenza A virus, introns, promoters of different orientation, eukaryotic expression, monoclonal antibody IgA1
Сведения об авторах
Аргентова Виктория Витальевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91; e-mail: [email protected]
Алиев Теймур Кантамирович — науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ. Тел.: 8-495-330-66-38; e-mail: [email protected]
Топорова Виктория Александровна — мл. науч. сотр. Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Тел.: 8-495-330-66-38; e-mail: [email protected]
Рыбченко Владислав Сергеевич — студент биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-330-66-38; e-mail: [email protected]
Долгих Дмитрий Александрович — докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-80-11; e-mail: [email protected]
Кирпичников Михаил Петрович — академик РАН, проф., докт. биол. наук, зав. кафедрой биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-76; e-mail: [email protected]
