CC BY
18Регуляция интенсивности респираторного взрыва в нейтрофилах слабым магнитным полем. Экспериментальные подходы к анализу роли воды и водно-солевых растворов
В.В. Новиков, Е.В. Яблокова, Е.Е. Фесенко
Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»
Представляет интерес экспериментальное исследование молекулярных механизмов действия различных магнитных условий (комбинированные магнитные поля, гипомаг-нитные условия) на хорошо изученных экспериментальных объектах. Один из которых - респираторный взрыв в нейтрофилах, который оказался чувствителен к вариациям параметров магнитных условий, предшествующих этому процессу [1]. Множество потенциальных мишеней для действия магнитного поля (свободные радикалы, протоны, молекулярный кислород, ионы железа и кальция) участвуют в респираторном взрыве в нейтрофилах, что позволяет спланировать и провести дифференциальные эксперименты по выяснению механизмов влияния этого фактора. В наших работах был зарегистрирован праймирующий эффект (предактивация респираторного взрыва в нейтрофилах) слабых комбинированных постоянного (42 мкТл) и коллинеарного ему низкочастотного переменного (сумма частот 1; 4,4 и 16,5 Гц; амплитуда 0,86 мкТл) магнитных полей (КМП), который проявлялся как более выраженное усиление хемилюминесценции суспензии нейтрофилов, после их предварительной обработки КМП в течение часа, в ответ на введение бактериального пептида Ы-формил-Ме^еи-РИе или форболового эфира форбол-12-меристат-13-ацетата в присутствии люминола [1]. Было показано лишь небольшое усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) в нейтрофилах после действия КМП. Не было выявлено взаимосвязи этого увеличения интенсивности ПОЛ с процессом функциональной предактивации нейтрофилов в результате действия КМП, так как ингибитор ПОЛ - ио-нол, не снижал в этом случае индекс прайминга нейтрофилов. Также не снижала индекс прайминга предварительная добавка перехватчика синглетного кислорода - гистидина или перехватчика гидроксильных радикалов - диметилсульфоксида. Было показано, что низкие концентрации (~1 тМ) хелатора внутриклеточного кальция БДРТД АМ блокируют эффект слабых КМП. Одним из ключевых моментов механизма предактивации нейтрофилов в слабом КМП является выраженная зависимость величины этого эффекта от концентрации атмосферных газов [2]. Было показано, что предварительная мягкая частичная дегазация суспензии нейтрофилов при давлении атмосферных газов 640 мм.рт. ст. приводит к существенному (4х кратному) снижению клеточного ответа на КМП, и практически не отражается на способности клеток генерировать респираторный взрыв в ответ на активатор (пептид Ы-формил-Ме^еи-РИе) в контроле (частично дегазированная суспензия нейтрофилов). Это позволило нам предположить, что молекулярный кислород может являться одним из вероятных акцепторов слабого КМП в исследуемой тест-системе (водно-солевой суспензии нейтрофилов), и, что сам водный раствор способен в связи с этим изменять свои свойства в результате действия КМП. Для экспериментального анализа такой возможности были предприняты специальные серии опытов.
Эксперименты проводились с относительно слабыми магнитными полями с величинами, сопоставимыми и менее геомагнитного поля (<80 мкТл). В них была использована специальная, необходимая для корректного выполнения таких работ, исследовательская аппаратура - установка для формирования гипомагнитных условий, которая позволяла получить высокую степень ослабления геомагнитного поля - до 10000 раз (остаточное постоянное поле не превышает 10 нТл), и существенно ослабляла переменные техногенные помехи. Эта установка состояла из трех, вставленных соосно один в другой, цилиндрических магнитных экранов из пермаллоя (толщиной 1 мм), закрытых крышками с отверстиями для подводки измерительной и термостабилизирующей аппаратуры. Определение остаточных полей в установке проводили прямым измерением с помощью феррозондо-вого магнитометра Mag - 03 MS 100 (Bartington, UK). Для формирования экспериментальных слабых однородных комбинированных коллинеарных постоянного и переменного магнитных полей внутри этой системы был установлен специальный индуктор (соленоид), который может быть подключен к источнику постоянного тока - для формирования постоянного поля и к источнику переменных низкочастотных магнитных сигналов - для формирования переменной компоненты поля. Размеры установки (диаметр 36 см, длинна 98 см) позволяли поместить одновременно в зону однородного слабого магнитного поля достаточное для опытов число экспериментальных образцов.
Образцы воды, до введения люминола и формилированного пептида, но предварительно проинкубированные в условиях КМП, проверяли на их способность осуществлять предактивацию (прайминг) или деактивацию нейтрофилов. На этом этапе для приготовления стандартной среды Хенкса для культивирования нейтрофилов смешивали 8 объемных частей экспериментальных образцов воды, предварительно обработанныой КМП, с 1 объемной частью концентрированного раствора Хенкса. Нейтрофилы с добавками были инкубированы при 37±0,1°С в течение 40 минут в концентрации 1 млн/мл по 0,225 мл. После инкубации нейтрофилов в среде, содержащей исследуемые экспериментальные образцы, была измерена интенсивность хемилюминесценции образцов после добавки в них раствора люминола (Enzo Life Sciences, США) в концентрации 0,35 мМ. В суспензию нейтрофилов помимо люминола был добавлен активатор генерации активных форм кислорода: хемотаксический формилированный пептид Ы-формил-Met-Leu-Phe (fMLF) (Sigma, США) в концентрации 1 мкМ. Для регистрации хемилюминесценции был использован хемилюминометр Lum-1200 (ООО ДИСофт, Россия). Для анализа и представления результатов применялась программа «PowerGraph». Такому же биологическому анализу подвергали образцы, полученные методом последовательных разведений и интенсивного встряхивания из исходных образцов воды. При этом интенсивное встряхивание проводили в двух вариантах: в обычных условиях и в гипомагнитном поле.
Результаты опытов показали, что вода, подвергнутая физическому воздействию в виде определенных режимов КМП, изменяет свои свойства (увеличивает на 20-40% интенсивность хемилюминесценции суспензии нейтрофилов относительно контрольных образцов), также изменяет ее свойства следующая затем процедура последовательного разведения и интенсивного встряхивания (увеличивает на 20-60% интенсивность хемилюминесценции суспензии нейтрофилов относительно контрольных образцов). Это в целом свидетельствует о применимости разрабатываемого нами экспериментального подхода к анализу роли водной среды в рецепции внешних физических воздействий, результат которых может сохраняться на протяжении длительного времени.
[1] В.В. Новиков, Е.В. Яблокова, Е.Е. Фесенко. Праймирование респираторного взрыва у нейтрофилов ¡пу^го при действии слабых комбинированных постоянного и низкочастотного переменного магнитных полей, Биофизика, 61(3), стр. 510-515, (2016).
[2] В.В. Новиков, Е.В. Яблокова, Е.Е. Фесенко. Роль кислорода в прайминге нейтрофилов при действии слабого магнитного поля, Биофизика, 63(2), стр. 277-281, (2018).
