CC BY
28
1999, Т. I, № 3-4
Илшуноре.улщия
состояниях, не проявляют, как правило, спонтанной анти-комплементарной активности при внутривенном введении. Однако известно, что нормальный 1цО человека связывает фрагмент СЗЬ, образующийся н процессе активации системы комплемента. Связывание с экзогенным иммуноглобулином приводит к снижению концентрации образующегося СЗЬ, что должно приводить к снижению защитных возможностей системы комплемента.
С целыо выявления возможностей регуляции взаимодействия ДО с фрагментом СЗЬ в наших экспериментах были исследованы функциональные последствия воздействия гомологичного на комплемепт-опосредо-
ванный гемолиз эритроцитов кролика (альтернативный путь активации комплемента— АПК) и сенсибилизированных эритроцитов барана (классический пуп. —КГ 1К).
Исследовано влияние в концентрациях от б до
37,5 мкг/мл на кинетические параметры комплемент-опосредованного гемолиза по АПК и КПК в смешанной сыворотке крови, полученной от здоровых доноров обоего пола в возрасте от 20 до 43 лет. Содержание сыворотки в инкубационной смеси сос тавляло 12,5-25%.
Добавление 1”0 до концентрации от 6 до 37,5 мкг/мл в этих опытах приводило к снижению скорости гемолиза по КПК, в среднем, соответственно на 15-31%. При этом практически не удавалось выявить изменений ^-периода, предшествующего началу гемолиза. При исследовании гемолиза по А11К в присутствии ЭГ'ГА было показано, что добавление ^0 в максимальной из использованных концентраций (37,5 мкг/мл) приводит к снижению скорости гемолиза, в среднем, на 18-20%. Тогда как величина 1а”-периода достигает 120% от исходного значения.
С целыо повышения чувствительности анализа влияния ДО на АПК проведена серия экспериментов, в которых, в качестве источника комплемента, использовался реагент ЛСЗ, полученный путем обработки сыворотки крови монометиламином. Реконструкция комплемента достигалась путем добавления очищенного препарата СЗ к этому реагенту. В этих опытах было установлено, ч то изменение скорости комплемент-опосредовапного гемолиза эритроци тов кролика по АПК может рассматриваться как функция от концентрации ДО лишь до концентраций, не превышающих 10 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации ДО не ведет к снижению скорости гемолиза, но ^-период при этом продолжает увеличиваться. В этих условиях величина 1ац-периода в присутствии ДО в концентрации 0,45 мг/мл достигает270%. В аналогичных экспериментах по анализу влияния на КПК величина 1ац-периода не превышала 135% от исходной.
Искусственное увеличение концентрации фактора СЗ путем введения очищенного СЗ в смешанную сыворотку крови в присутствии приводит к снижению его угнетающего влияния на способность сыворотки вызывать гемолиз эритроцитов как по АПК, так и по КПК и полностью восстанавливает способность сыворотки к комплемент-опосредованному гемолизу. При этом и скорость гемолиза, и величина ^-периода возвращаются к значениям, близким к исходным в отсутствие ДО.
Таким образом, влияние IgG человека в концентрациях, близких к терапевтическим дозам, на активность системы комплемента может быть выявлена при оценке кинетических параметров комилемент-шюередованно-10 гемолиза эритроци тов. Воздействие IgG на систему комплемента прямо связано с содержанием СЗ в исследуемой сыворотке крови.
Антигемолитическая активность С-реашвного белка и фактора некроза опухолей-а в отношении фосфолипаз различного происхождения
Б утюгов А., Назаров П., Любимов Ю.
Институт экспериментальной медицины РА МН, Институт токсикологии, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Некоторые токсические шоковые состояния сопровождаются повышением концентрации в сыворотке различных типов фосфолипаз, что может рассматриваться как важный патогенетический фактор. При подобной патологии ключевую роль в развитии системного иммунного ответа играют провоспалительные ци-токины и реактанты острой фазы воспаления, в числе которых фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) и С-реактив-ный белок (СРБ) опосредуют реакции специфического и неспецифического звена противоинфекционной защиты.
Цели и задачи. Целыо данного исследования было изучение способности человеческого СРБ и рекомбинантного человеческого ФНО-а влиять на гемолитическую активность фосфолимазы С (ФЛ-С) из Cl.perfringens и фосфолииазы АП (PLA1I) из яда Apis nielli/eruL
Материалы и методы. С целыо изучения гемолитических характеристик ФЛ-С и ФЛ-А11 было проведено определение их гемолитического тигра. Лиофилизиро-ванные препараты фосфолипаз растворяли в 0,9% растворе NaCl, затем готовили ряд2-кратпых разведений в объеме 50 мкл, начиная от исходной концентрации 500 мг/мл, к которым добавляли по 20 мкл суспензии эритроцитов человека (ЭЧ). Затем серийные разведения СРБ и ФНО-а инкубировали с минимальными концентрациями ФЛ-С и ФЛАИ, обеспечивавшими 100% гемолиз в течение 30 мин. при 37иС. Учет гемолиза вели спектрофотометрически при длине волны 405 нм.
Результаты. Полученные результаты показали, что СРБ ингибирует гемолитическую активность фосфолипаз, с константой ингибирования К-233 мкг/мл и 132,3 мкг/мл для ФЛ-АН и ФЛ-С соответственно. ФНО-а продемонстрировал способность влиять на гемолитическую активность ФЛ-АП, однако его эффект находился в зависимости от концентрации: усиление лизиса (ЭЧ) наблюдалось в диапазоне от450 Ед/мл и выше, в то время как подавление гемолитической активности ФЛ-АП происходило при более низких концентрациях ФНО-а. Было проведено изучение кинетических и лигандиых характе-
ристик ингибирования активности ФЛ в отношении ЭЧ. По результатам исследований, обнаруженную активность СРБ по отношению кФЛ-С иФЛ-АП можно отнести к варианту неконкурентного ингибирования, так как скорость реакции (У^) изменяется в том же направлении, что и константа Михаэлиса (Км). Ингибирующая активность СРБ в отношении ФЛ-С в значительной степени связана с создаваемым им дефицитом ионов Са’\ тогда как ингибирующий эффект лектина в отношении ФЛ-АИ не зависит от связывания им ионов Са*\а опосредован иным механизмом. Фосфорилхолин не отменяет антигемолитическую активность СРБ ни в отношении ФЛ-С, ни в отношении ФЛ-АИ.
Заключение. Получены данные о влиянии СРБ и ФНО-а на гемолитическую активность фосфолипаз различного происхождения, причем ингибирование фосфолипаз С-реактивным белком происходит неодинаково для ФЛАИ и ФЛ-С, неконкурентно, протекает по Са*'-зависимо-му типу для ФЛ-АИ, а также без вовлечения во взаимодействие фосфорилхолинсвязывающего домена СРБ.
Действие ультрафиолета С на лимфоциты и нейтрофилы периферической крови человека
Винокуров М.Г., Николаева Н.Н., Косякова Н.И., Печатников В. А.
Институт биофизики клетки РАН г.Пуи{ино, Московская область, Россия
В настоящее время большое внимание уделяется изучению действия различных физико-химических факторов на важнейшие клеточные и гуморальные звенья иммунной системы. Особый интерес представляет ультрафиолетовое излучение диапазона С (УФС), которое широко применяется в медицине около 70 лет в качестве универсального метода лечения.
С другой стороны, известно, что УФС обладает серьезным генотоксическим действием и является индуктором апоптоза иммунокомпетентных клеток. Механизм его воздействия до сих не ясен и требует изучения, что позволит разработать более точные рекомендации к его применению в терапевтической практике и диагностике.
Методом проточной цитометрии исследовалось действие УФС на лимфоциты и нейтрофилы перифериче-кой крови человека в широком диапазоне доз (2Дж/м2 — 1000 Дж/м2).
Воздействие ультрафиолета С (10 Дж/м2) на предварительно (за 72 часа до облучения) активированные ФГА лимфоциты периферической крови незначительно подавляло пролиферативный ответ, в то время как у лимфоцитов, стимулированных сразу после облучения, вызывало задержку пролиферативного ответа на48 часов. В диапазоне доз (2Дж/м: —1000 Дж/м2) УФС вызывает увеличение апоптозной гибели культивируемых нейт-рофилов по сравнению с величиной спонтанного апоптоза в контроле.
Полученные результаты могут иметь важное значение при подборе условий применения и оценке эффективности использования УФС в медицинских целях.
Модифицирующее действие Ро1уА-Ро1уи и Ро1у1-Ро1уС на респираторный взрыв нейтрофилов
Габдулхакова А. Г.1, Губанов С.И.2, Сафронова В. Г.', Феофанов С. А.1
1Институт биофизики клетки РАН;
''Филиал Института биоорганической хилши им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова г. Пущино, Россия
Основная функция полиморфноядерных нейтральных лейкоцитов (нейтрофилов) быстрое обезвреживание вторгшихся микроорганизмов. Активные формы кислорода, продуцируемые нейтрофилами при активации, играют основную роль в их бактерицидности и цитотоксичности. Известно, что двуспиральные, двуцепочечные комплексы гомополирибонуклеотидов — такие, как Ро1уА-Ро1уи (РАРи) и Ро1у1-Ро1уС (Р1РС) — оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, включающее, например, активацию системы интерферонов, активацию цитотоксичности натуральных киллеров, антителозависимую цитотоксичность. Нами впервые показано, что РАР1) и Р1РС могут модифицировать функциональную активность нейтрофилов. Методом хемилюминесцентного анализа с использованием люминола исследовано действие РАРи и Р1РС на продукцию активных форм кислорода перитонеальными вызванными нейтрофилами мышей линии МЫШ. Получено: 1) РАРи (40 мкг/мл) и Р1РС (100 и 200 мкг/мл) сами не влияли на уровень хемилюминес-ценции; 2) преинкубация клеток с обоими веществами приводила к модификации последующего ответа на активацию 5 и 50 мкМ хемотаксического пептида Ы-формил-метионил-лейцил-фенилаланина (ФМЛФ) и 1 мкМ фор-болового эфира (ФМА), активатора протеинкиназы С; 3) положительный эффект обоих веществ на вызванный ФМА ответ нейтрофилов усиливался при преинкубации до 30 мин., при преинкубации более 1 часа ответ возвращался к контрольному уровню; 4) ответ на 5 мкМ ФМЛФ оба вещества практически не изменяли за 30 мин. преинкубации с ними, за исключением 200 мкг/мл Р1РС, когда ответ усиливался на23±9%, преинкубация с обоими веществами в течение I часа значительно подавляла ответ; 5) оба вещества усиливали ответ на 50 мкМ ФМЛФ; однако Р1РС был более эффективным, и его эффект слабо зависел от времени, что может быть обусловлено его большей стабильностью в растворе, чем у РАРи. Считается, что в активации респираторного взрыва нейтрофилов через высоко- и низкоаффинные рецепторы ФМЛФ участвуют разные системы внутриклеточной сигнализации. Возможно, что различия в действии РАРи и Р1РС на рецепторный ответ нейтрофилов связаны с модификацией путей активации респираторного взрыва нейтрофилов.
