CC BY
8
УДК 664.8.022.6
КВ. ЗУБКОВА
Херсонський нацюнальний техшчний ушверситет
РЕГУЛЮВАННЯ АМ1НОКИСЛОТНОГО ОБМ1НУ ПЛОД1В ТА ОВОЧ1В ЗА ДОПОМОГОЮ ПОПЕРЕДНЬО1 ОБРОБКИ СИРОВИНИ
Наведено результати дослгджень параметргв ферментативного перетворення певних амтокислот, а саме глутамтовоХ кислоти рослинноХ сировини на у-амтомасляну кислоту (ГАМК) nid д1ею пульсуючого тиску. За отриманими даними автором розроблено технологт овочевих союв i напоХв з niдвищеним вмiстом у-амтомасляноХ кислоти.
Ключовi слова: y-амiномасляна кислота, глутамтова кислота, глутаматдекарбоксилаза, гарбуз,
напоХ.
K.V. ZUBKOVA
Kherson National Technical University
REGULATION OF EXCHANGE AMINO ACID FRUITS AND VEGETABLES THROUGH TREATMENT OF RAW MATERIALS
Abstract
The results of studies of the parameters of enzymatic conversion of certain amino acids, namely glutamic acid to GABA raw materials under pulsating pressure. According to our data the author developed a technology for vegetable juices and drinks with high content of y- aminobutyric acid.
Keywords: gamma aminobutyric acid, glutamic acid, glutamatedecarboxylase, pumpkin, beverages.
Постановка проблеми
При розробщ технологи харчових продукпв враховуються нов1 тенденцп в харчуванш людини. Актуальним е створення нових продукпв з певним напрямом гх бюлопчно! та ф1зюлопчно! ди, ввдомих тд назвою «функцюнальш продукти», яш в1др1зняються вщ традицшних регульованим вмютом ф1зюлопчно-активних речовин. Серед асортименту функцюнальних продукпв найбшьш прийнятними е продукти на основ1 фруктових та овочевих сошв, тому що в них одночасно можуть функцюнувати багато р1зних за класами функцюнальних нутр1ент1в. Функцюнальною складовою таких продукпв можна вважати у-амшомасляну кислоту (ГАМК), яка бере участь у багатьох метабол1чних перетвореннях, 1з яких найб1льше значения мають пов'язан1 з обм1ном дикарбонових амшокислот i глюкози, в регулюванн1 ф1зюлопчного стану нервовоГ системи, впливаючи на актившсть нейронiв i синаптичну передачу в них, обумовлюе гальмiвний ефект, тобто вщграе роль нейромедiатора. У дозах 0,5...2 г на добу ГАМК допомагае покращувати мову i вiдновлювати втрачену пам'ять у людей, що пережили шсульт. Крiм того, було виявлено, що в тих же шлькостях вона зменшуе вмют цукру у кровi, а в дозах 3 г на добу здатна знижувати кров'яний тиск i тдтримувати серцеву дiяльнiсть [1]. Для зниження тривожиостi i дратiвливостi, зазвичай, добре допомагають дози вiд 1 г до 2 г ГАМК на добу. У хворих шизофрешею i хворобою Альцгеймера також виявляеться дефiцит y-амiномасляноi кислоти.
Згiдно дослщжень, мелатонiн пiдвищуе вмiст y-амiномасляноi кислоти i серотину в середньому мозку i гiпоталамусi [2]. Глутамiн i ефiрнi олii валерiани також впливають на збiльшення концентрацii у-амшомасляног кислоти [3].
Основним джерелом ГАМК може бути рослинна сировина, у якш дана амiнокислота знаходиться у вшьному станi. Збiльшити ГГ шльшсть у рослинних тканинах можна шляхом змшення обмiну речовин в сировиш. Таким чином, можна отримати продукти з тдвищеним вмiстом y-амiномасляноi кислоти, без внесення ii ззовнi.
AH^i3 ocTaHHix досл1джень i публiкацiй
Вiдомi способи отримання ГАМК мiкробiологiчним синтезом [4]. Шсля 90 год вирощування штамiв Bact. cadaveris ATCC 9760 i E. coli ATCC 9637 в культивованш рщиш накопичуеться до 4 г/л ГАМК. Продукт з вiдсепарованоi при рН 2,0 культуральноi рщини видiляють методом iонообмiнноi хроматографп на установцi Diaion SKI (тип Н+). Вихiд кристалiчного продукту з культуральноi рiдини складае 35 %. Недолж даного способу - низький вихiд ГАМК i довготривалiсть процесу [5, 6, 7].
Вiдомi способи отримання ГАМК шляхом ензиматичного декарбоксилування L-глутамiновоi кислоти, де в якосп каталiзатора реакцii застосовують клiтини мiкроорганiзмiв, що мiстять L-глутаматдекарбоксилазу [8], а також iммобiлiзована GAD [9].
Недолшом цих способiв е низька глутаматдекарбоксилазна активнiсть клiтин i додаткова процедура видшення i очищення GAD для iммобiлiзацii.
Також icHye cnoci6 отримання ГАМК декарбоксилуванням L-глутамшовох кислоти клiтинами бактерш Arthrobacter simplex [10]. Недолiком даного способу e невелике накопичення бюмаси, довгий перiод росту i висок витрати бiомаcи на отримання ГАМК (0,43 г сухо! бiомаcи на 1 г продукту) внаслвдок низько! глутаматдекарбоксилазно1 активноcтi штаму, що використовуеться.
Задачею даних доcлiджень, виконаних автором, е розробка способу виробництва овочевих сошв та напо!в, що мicтять б№ш висок1 концентраци ГАМК, нiж початкова сировина, за ввдносно простими технолопчними схемами без використання зовнiшнiх добавок глутамшово! кислоти [11].
Формулювання мети дослщження
Метою дослвдження е встановлення механiзмy, умов та параметрiв змши метаболiзмy глутамшово1 кислоти, пiд дieю глутаматдекарбоксилази, з утворенням ГАМК у рослиннш cировинi, шд впливом зовшштх факторiв, i розробка технологи сошв та напо1в з шдвищеним вмютом у-амшомасляно1 кислоти.
Викладання основного матер1алу дослiдження
В оcновi дихання лежить ряд закономiрноcтей: перебiг реакци окиснення, ввдновлення, декарбоксилування, дезамiнyвання та шш. Кожна з цих реакцiй каталiзyeтьcя cпецифiчним ферментом. 1снуе генетичний зв'язок м1ж аеробних i анаеробним типами дихання. Анаеробне дихання у фруктах та овочах може бути викликане нестачею кисню, надлишком вуглекислого газу, пошкодженням тканин i рядом шших причин. При цьому в рiзних умовах накопичуються рiзнi промiжнi продукта обм^ речовин. Головною причиною виникнення анаеробного дихання е нестача кисню в тканинах. При витримщ плодiв в атмоcферi з низьким вмютом кисню посилюеться процес анаеробного дихання, в результата у тканинах накопичуеться недоокиcнюванi продукти - ацетальдегiд i етиловий спирт.
В умовах обробки овочiв пульсуючим тиском накопичення ацетальдегiдy та етилового спирту спостержалось у незначних шлькостях. Вiльнi амiнокиcлоти п1ддаються процесам дезамiнyвання та декарбоксилування. При декарбоксилуванш амiнокиcлоти утворюють амiни i вуглекислий газ. Продукти, що утворюються при декарбоксилуванш амшокислот, часто мають фiзiологiчнy дш, а у випадку з декарбоксилуванням дикарбонових кислот утворюються новi амшокислоти. Особливо iнтенcивно процеси декарбоксилування ввдбуваються у роcлиннiй тканинi. Так, з аспарагшово1 кислоти утворюеться аланш, з глутамшово1 - ГАМК.
Захисш реакци рослин на несприятливий вплив набувають адаптивний характер при можливосп координацп !х за допомогою рiзних систем регулювання. При гшокси та аноксп ферментна регyляцiя контролюеться комплентарною перебудовою обмiнy речовин, що необхвдш для утворення достатньо1 для життeдiяльноcтi кiлькоcтi АТФ та iнтермедiатiв, генерування й окислення вiдновлених кофакторiв, детоксикаци продyктiв анаеробного метаболiзмy. Було встановлено, що активнicть ряду ферментiв змiнюeтьcя при дИ на плоди факторiв зовнiшнього середовища, а саме, в умовах кисневого дефiцитy. У залежносп вiд часу гшоксично1 ди та складу газового середовища змшюються ввдповщт реакци рослинного органiзмy. Щд впливом вщносно короткочасного впливу анаеробних умов у плодах спостернаються значнi порушення у вуглеводному обмiнi, що вщображаеться на вмicтi органiчних кислот. Через нестачу енергп в анаеробних умовах знижуеться швидк1сть синтезу бiлка, i потреба в амiнокиcлотах зменшуеться, що вважаться головною причиною збiльшення концентраци вiльних амiнокиcлот у клiтинах.
Ефективним адаптацшним механiзмом служить перебудова амшокислотного обмiнy, що направлена у бж утворення так званих «стресових» амшокислот, одшею з яких е ГАМК, що запасаеться тканинами рослин в несприятливих умовах у великих кшькостях без пошкодження клiтин i виступае як легкомобiлiзована форма сукцинату при вщновленш нормального дихання завдяки блокуванню li yтилiзацil через реакцil циклу трикарбонових кислот.
Синтез ГАМК вщбуваеться шляхом а-декарбоксилування глутамату, що кататзуе кальцiй/кальцiймодyлiн-залежна глутаматдекарбоксилаза з достатньо низьким оптимумом рН (5,9). Глутаматдекарбоксилаза рiзноl фруктово-овочево1 сировини фyнкцiонye в рiзних кислотно-лужних умовах з рН отимумом в1д 3,0 до 6,0 (морква, гарбуз, томати, буряк тощо). Для з'ясування оптимального показника рН глутаматдекарбоксилази проводили и видiлення з плодiв, що мають рiзнi показники рН соку. Мюцем локалiзацil ГАМК може бути вакуоль, де знайдено значну кiлькicть окремих амiнокиcлот.
Проведенi дослвдження видiленого ферменту глутаматдекабоксилази встановили, що рН у межах 5,4...6,0 сприяють видiленню ферменту з максимальною активнютю (рис.1). П1двищення активноcтi глутаматдекарбоксилази спостертаеться i при показниках рН вщ 3,0 до 5,4.
Оск1льки овочевi соки та напо1 мають активну киcлотнicть 3,9.4,5, то дана активнють глутаматдекарбоксилази е задовiльною для того, щоб каталiзyвати перетворення глyтамiновоl кислоти до ГАМК. Для вибору оптимальних умов, що сприяють тдвищенню вмюту ГАМК в сировиш при обробщ пульсуючим тиском було доcлiджено вплив температури та часу витримки сировини (рис. 2, 3).
Рис. 1. Вплив рН середовища на актившсть глутаматдекарбоксилази гарбузового соку
13 20 22 24 26 28 30 Температура, °С
Рис. 2. Вплив температури витримки сировини
на актившсть глутаматдекарбоксилази гарбузового соку, при дй" пульсуючого тиску (24 цикли, 70 i 101,3 кПа)
О ..................
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 35 ТрШШСБВЩИШ!. ГОД
Рис. 3. Вплив тривалост витримки сировини на актившсть глутаматдекарбоксилази гарбузового соку, при дй" пульсуючого тиску (70 i 101,3 кПа)
Оптимальна температура, що сприяе тдвищенню акгивносп глутаматдекарбоксилази - 23.. .24 °С. Найб№ша актившсть глутаматдекарбоксилази спостерталась при чергуванш аеробних i анаеробних умов витримки сировини протягом 24 годин.
Експериментально дослщжено вплив ввдносно! вологостi повiтря в камерi попередньо! обробки при вакуумуванш на технологiчнi показники отриманого соку. З шдвищенням температури швидше накопичуеться вуглекислий газ, який краще розчиняеться в соку, нiж кисень. Щдвищення концентраци вуглекислого газу в овочах проявляе себе як регулятор обмшу речовин, який впливае на оскисно-вiдновнi системи, у тому числ на окиснi ферменти. Установлено, що газовий склад атмосфери овочiв залежить вiд тривалостi 1х витримки в розрвдженш атмосферi та температури, при якш проводять дослвдження.
Зпдно закону Генр^ граничне насичення тим чи шшим газом визначаеться величиною паршального тиску, i залежить ввд температури. Понижения тиску при вакуумуванш призводить до
порушення рiвноважного стану, i розчинш гази видiляються у виглядi мшробульбашок. До цих процесiв додаеться генерування парово! фази, а iнтенсивнiсть утворення газово! та парово! фаз визначаеться глибиною входження рвдко! фази в метастабшьний стан. Таким чином, у процеа вакуумування з сировини видаляються не тiльки гази, але й волога.
Щоб дослiдити вплив ввдносно! вологостi повiтря в камерi попередньо! обробки цiлих плодiв на вихвд та характеристики соку визначали його основш технологiчнi показники. Для цього овочi витримували в розрiдженiй атмосферi (70 кПа) при вiдноснiй вологосп в камерi 71 %, 80 % та 95 % протягом 10, 20 та 60 хв.
При ввдноснш вологостi повiтря (71 % та 80 %) у процеа вакуумування мае мюце усушка, що призводить до пiдвищення масово! частки сухих речовин у соку ввд 0,1 до 0,5 %, що складае 2,7.4,5 % ввд загального вмiсту. Це повинно впливати на вихвд соку.
Збiльшення тривалосп вакуумування овочiв до 60 хв при ввдноснш вологостi 71 % не суттево змiнюе вихвд соку, що пояснюеться адаптацiйними процесами в цитоплазматичних мембранах та усушкою овочiв у процесi обробки.
Масова частка сухих розчинних речовин при вакуумуванш протягом 10.60 хв при ввдноснш вологосп 95 % не змшювалась ввдносно контролю.
Так1 дослiдження дають пiдстави вважати, що витримка овочiв у розрiдженiй атмосферi при високш вiдноснiй вологостi не впливае на змши сухих речовин. Цим шдтверджуеться той факт, що за даних умов вiдсутнiй процес усушки.
Для вивчення впливу дп пульсуючого вакууму (вакуум, що порушуеться через рiвнi промiжки часу) на змiну метаболiзму сировини дослвджували змiну вмiсту ГАМК в овочах залежно вiд числа порушень вакууму. Для цього пвдготовлеш овочi розмiщували в камерi, де кожну годину змiнювали тиск з 70 кПа на 101,3 кПа, температура протягом всього дослiдження була сталою 24 °С (рис. 4).
Юльшсть порушень вакууму значно впливае на змши вмюту ГАМК (рис. 5). Вгам перепадiв тиску протягом 8 год зб№шують вмiст ГАМК у 4 рази, подальшi перепади тиску до 24 годин з пею ж перюдичшстю призводять до збшьшення вмiсту ГАМК у 8 разiв (на прикладi гарбузового соку).
Шсля витримки сировини у заданих умовах вмiст ГАМК не змшюеться, а отже збiльшувати час витримки не рацiонально.
К
1-ч
т
О
'I
В
0 0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 1921 23 Тривалють витримки, год
1
1 ■ ■ 1 ■ 1 ■ ■ 1 1 ■
1 1 1 1 1 I 1 I 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 3 5 7 9 11 13 15 17 1921 23
Трившлсть витримки, год
Рис. 4. Циклiчна змша тиску в залежност вiд тривалостi витримки сировини
Рис. 5. Змша вмкту ГАМК у гарбузовому сощ в залежност в1д тривалостi витримки при циклiчнiй змiнi тиску
Запропонований споаб витримки сировини при багатократнiй змш циклiв пiдвищення i пониження тиску дозволяе отримати готовi продукти (соки, напо! тощо) з пiдвищеним вмютом ГАМК, оск1льки в сировинi йдуть процеси перетворення вiльних амiнокислот, а саме глутамiнова кислота, яка становить бiля 40 % ввд загального вмюту вiльних амiнокислот в сировиш, пiд дiею ферменту глутаматдекарбоксилази утворюе ГАМК та вуглекислий газ.
Доведено, що перепади тиску мають дiевiший вплив на збiльшення вмiсту ГАМК у сировиш, шж постiйний знижений тиск, оск1льки при витримцi сировини при постшному зниженому тиску починаеться накопичення ацетальдегiду та етилового спирту.
Вмют ГАМК значно збiльшився у тканинах плодiв при дi! дефщиту кисню. Оптимальний час обробки становить 24 години, осюльки саме за цей час накопичуеться максимальна шльшсть ГАМК та ще не починаеться спиртове бродiння. Таким чином, захисш реакцil плодiв на несприятливi умови набувають адаптивного характеру при можливосп координацi! !х за допомогою рiзних систем регуляцi! дефiциту кисню.
Було встановлено, що актившсть глутаматдекарбоксилази зб№шуеться при дi! на овочi факторiв зовнiшнього середовища, а саме в умовах дефщиту кисню.
Висновки
1. На 0CH0Bi аналггачних та експериментальних дослщжень розроблено технолопю овочевих сошв i напо!в з пвдвищеним вмiстом у-амшомасляно! кислоти.
2. Дослвджено кинетику ферментативного перетворення глутамшово! кислоти до у-амшомасляно! кислоти тд дieю глутаматдекарбоксилази, видшено! з гарбуза, моркви, томатiв i буряка.
3. Визначено оптимальш параметри витримки сировини в умовах пульсуючого тиску, що сприяють збiльшенню вмiсту у-амшомасляно! кислоти у готовому продукт!
4. Визначено фiзико-хiмiчнi та органолептичнi показники якосп овочевих сок1в i напо!в, виготовлених за розробленими технолопями при збертанш
Список використаноТ лiтератури
1. Ковалев, Г. В. Препараты ГАМК и ее аналогов в эксперименте и клинике [Текст] / Г.В. Ковалев // Фармакология и клиника у-аминомасляной кислоты и ее аналогов: тр. ВГМИ. - Волгоград, 1979. -Т. XXXI. - С. 11-25.
2. Andersen P. Pathway of postsynaptic inhibition in the hippocampus [Text] / P.Andersen, J.C. Eccles, Y. Loyning // J. Neurophysiol. - 1964. - Vol.27. - P. 608-619.
3. Семьянов А.В. ГАМК-эргическое торможение в ЦНС: типы ГАМК-рецепторов и механизмы тонического ГАМК-опосредованного тормозного действия [Текст] / А.В. Семьянов // Нейрофизиология. - 2002. - №.1, Т.34 - С. 82-92.
4. Глутаматдекарбоксилаза из Escherichia coli: експрессия гена gad A, очистка и свойства GADa [Текст] / А.А. Шульга, Е.Л. Дарий, Ф.Т. Курбанов и др. // Молекуляр. биология. - 1999. - №4. -С.560-566.
5. Сухарева Б.С. Глутаматдекарбоксилаза: макромолекулярная структура и каталитические свойства [Текст] / Б.С.Сухарева // Физико-химические проблемы ферментативного катализа / ред. Ю.М. Торчинский. - М., 1984. - С. 185-210.
6. Христофоров Р.Р. Реакции декарбоксилирования и побочного трансаминирования при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы из Escherichia coli с аналогами субстрата, модифицированными по атомам C3 и C4 [Текст] / Р.Р. Христофоров, Б.С. Сухарева, Х.Б. Диксон // Биохимия. - 1996. - Т.61. - С.464-471.
7. Preparation of y-aminobutyric acid using E. coli cells with high activity of glutamate decarboxylase [Text] / R.R Khristoforov, B.S. Sukhareva, H.B. Dixon et al. // Bioch. Molec.Biol. Intern. - 1995. - Vol. 36. - P. 77-85.
8. Губарев Е.М. Способ получения у-аминомасляной кислоты [Текст] / Е.М. Губарев // Биохимия. -1960. - Т. 25, № 2. - С. 261-263.
9. Chessler, S.D. Alternative splicing of GAD67 results in the synthesis of a third from of glutamic-acid decarboxylase in human islets and other non-neceral tissues [Text] / S. Chessler, A. Lernmark // J. Biol.Chem. - 2000. - Vol. 7. - P. 5188-5192.
10. Способ получения у-аминомасляной кислоты [Текст] / Р.П. Янушевичуте, А.-А.Б. Паулюконис, Б.С. Сухарева; ВНИИ приклад. энзимологии, ин-т молекул.биологии АН СССР. -№2819151/23-04; заявл. 17.09.79; опубл. 30.09.82, Бюл. №12.
11. Зубкова К.В. Розробка технологи овочевих сошв i напо!в з шдвищеним вмютом у-амшомасляно! кислоти [Текст]: автореф. дис. ...канд. техн. наук: 05.18.13 - технолопя консервованих i охолоджених харчових продукпв / Зубкова Катерина Вггалй'вна; ОНАПТ. - Одеса, 2013. - 20 с.
