CC BY
118
КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ
Регенерация мышечной ткани и активация миосателлитоцитов при аутотрансплантации стволовых клеток периферической крови пациентам с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей
М.О. Мавликеев 1, Д.И. Андреева 1, И.М. Газизов 1-2, А А. Гумерова 1, Т.С. Йылмаз 1-2,
М.С. Калигин 1, ГГ. Кундакчян 2, А.В. Максимов 3, Г.О. Певнев 1, М.В. Плотников 3,
А.В. Табанакова 1-2, АА. Трондин 1, АЛ. Киясов 12
1 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», Казань
2 Банк стволовых клеток ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», Казань
3 ГУЗ «Республиканская клиническая больница» М3 РТ, Казань
Regeneration of muscular tissue and activation of myosatellitocytes in autotransplantation of peripheral blood stem cells to patients with chronic obliterating disorders of lower extremity arteries
MO. Mavlikeev 1, D.l. Andreeva 1,I.M. Gazizov 12, A.A. Gumerova 1, TS. Yilmas 12, M.S. Kaligin 1, G.G. Kundakchyan 2 A.V. Maksimov3, G.O. Pevnev1, M.V. Plotnikov3, A.V. Tabanakova 13,A.A. Trondin 1,A.P. Kiasov 12 1 Department of Normal Human Anatomy, Kazan State Medical University, Kazan 3 Bank of Stem Cells, Kazan State Medical University, Kazan
3 Department of Vascular Surgery, Republic Clinical Hospital, Ministry of Health Care, Kazan
Целью нашего исследования было изучение эффективности терапии хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) аутологичными стволовыми клетками периферической крови (СКПК) и выявление лежащих в её основе морфофункциональных механизмов.
30 пациентам с ХОЗАНК была произведена внутримышечная аутотрансплантация СКПК. Производили морфометрический анализ парафиновых срезов биоптатов икроножной мышцы, полученных до начала клеточной терапии и через 3 мес. после трансплантации СКПК, окрашенных иммуногистохимически с антителами к маркерам эндотелия (СП31, СП34, фактор фон Виллебранда), и миогенину — маркеру активированных клеток-сателлитов. Определяли лодыжечноплечевой индекс (ЛПИ), выполняли стандартный тредмил-тест, тетраполярную реографию, дигитальную субтракцион-ную аортоартериографию.
Трансплантация СКПК приводит к увеличению плотности капиллярной сети на 25% (р<0,001). Через 3 мес. после трансплантации мы наблюдали клетки-сателлиты с признаками поздних стадий дифференцировки, слияние миоса-теллитов с образованием мышечных трубочек и новых мышечных волокон.
Показатели ЛПИ увеличились на 12% (0,59+0,04 исходно и 0,ВВ±0,04 на сроке 3 мес., р=0,001). Увеличение дистанции безболевой ходьбы составило 26,5% (с 102,2+11,55 м до 129,4+11,13 м, р<0,001). Время восстановления ЛПИ при выполнении тредмил-теста на сро-
+
+
Аутотрансплантация СКПК ведет к улучшению васкуляри-зации ишемизированной конечности путем неоангиогенеза,
e-mail: [email protected]
The aim of our work was to study the efficiency and mechanisms of autologous stem cells therapy of PAD.
Autologous peripheral blood stem cells (PBSC) were transplanted intramuscularly to 30 patients with PAD. The study was performed on biopsies of gastrocnemius muscle taken before intramuscular injection of PBSC and 3 months after the procedure. The paraffin-embedded slices were stained immunohistochemically with antibodies against endothelium markers — CD31, CD34, von Willebrand factor (vWF) to demonstrate capillary network and to myogenin — marker of activated myosatellites. Ankle-brachial index (ABI) estimation, tredmill test and digital subtraction aortoarteriografy were performed.
We showed that autologous stem cell injection induces increase of capillary density (25%, p<0,001). After autologous transplantation we revealed myosatellites with signs of late differentiation fusing to myotubes and built new muscle fibers.
ABI increased by 12% (0,59+0,04 before and 0,66+0,04 after 3 months, p=0,001), painless walking distance increased ++ p<0,001), ABI restoring time decreased by 32,2% ++ p=0,003).
Transplanted autologous PBSC differentiate into endothelial cells, stimulate microvasculation and activation of myosatellites, which build new muscle fibers. Autologous PBSC transplantation showed high efficiency for treatment of patients with PAD.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
А
а также активации миосателлитов и формированию новых мышечных волокон, что способствует восстановлению функции ишемизированной конечности.
Ключевые слова: хроническая ишемия нижних конечностей, неомиогенез, миогенин, стволовые клетки периферической крови, С034 1, мышечные биопсии, иммуногистохимия.
Key words: chronic lower extremity ischemia/ lower limb ischemia, neoangiogenesis, neomyogenesis, myogenin, peripheral blood stem cells, CD34 1, granulocyte colony-stimulating factor, muscle biopsy, immunohistochemistry.
Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) являются одной из наиболее частых причин снижения качества жизни и инвалидизации трудоспособного населения. Проявления данной группы заболеваний выражаются в прогрессирующем уменьшении просвета артериальных сосудов, что приводит к ишемии мышечной ткани [1 ]. Общая распространенность заболеваний периферических артерий в России варьирует от 3 до 10% общей численности населения [2], во всем мире ХОЗАНК поражены 12—14% популяции, причем заболеваемость возрастает до 20% после 75 лет [3, 4]. Несмотря на прогресс ангиохирургии, существует группа пациентов, для которых возможности хирургических и эндоваскулярных методов коррекции магистрального кровотока ограничены из-за невозможности адекватной реконструкции дистального сосудистого русла. Этим определяется сохраняющийся интерес к непрямым методам реваскуляризации [5].
С 90-х годов прошлого века возможностям терапевтического неоангиогенеза посвящено большое количество работ. Для этой цели применяются факторы роста эндотелия сосудов (\ZEGF) и фибробластов (РОР), ангиогенин (Апд), генно-инженерные конструкции [6, 7]. Практически одновременно в литературе появились публикации об использовании стволовых клеток (СК) для стимуляции неоангиогенеза [8].
В настоящее время существуют экспериментальные работы, в которых показано достоверное увеличение плотности капиллярной сети и развитие кол-латералей в скелетной мышце после введения СК, полученных из различных источников, при её ишемии [9, 10, 11, 12]. К сожалению, клинических исследований, посвященных этой проблеме, мало, и большинство из них носит характер пилотных исследований [13, 14]. Данные работы не располагают достаточной статистической базой и ограничиваются оценкой клинических показателей [13, 15]. Таким образом, морфофункциональные основы терапевтического эффекта трансплантации СК при ХОЗАНК остаются неизученными, а ее эффективность не доказана на клиническом уровне из-за отсутствия статистически значимой выборки.
Важным аспектом механизма регенерации тканей при ХОЗАНК является регенеративный ответ собственно мышечных волокон, который на сегодня практически не изучен. Основная роль в регенерации мышечной ткани принадлежит миосателлитоцитам [16]. Одним из важнейших маркеров активированных миосателли-тоцитов является миогенин. Он является поздним маркером миогенной дифференцировки, сопровождающим выход миобластов из клеточного цикла и их терминальную дифференцировку [17]. Анализ экспрессии миогенина дает возможность оценить темп регенерации мышечных волокон, что в совокупности с данными изучения влияния трансплантации СК на плотность капиллярной сети и результатами функциональных тестов позволяет провести достоверную оценку эффективности клеточной терапии ХОЗАНК.
Таким образом, целью нашего исследования стало изучение эффективности терапии ХОЗАНК аутологичными стволовыми клетками периферической крови (СКПК) и выявление лежащих в её основе морфофункциональных механизмов неоангиогенеза и мышечной регенерации.
Материал и методы
Для изучения морфологических основ терапевтического неоангиогенеза и мышечной регенерации нами был проведен клинический эксперимент по трансплантации аутологичных СКПК 30 пациентам с ХОЗАНК.
Клиническая часть эксперимента выполнена на базе отделения сосудистой хирургии Республиканской клинической больницы Министерства здравоохранения Республики Татарстан. В исследование были включены 30 пациентов (облитерирующий атеросклероз — 27 пациентов, облитерирующий тромбангиит —
3 пациента, средний возраст 51,2+1,5) с хронической ишемией нижних конечностей ПЬ степени (по Fontaine), у которых выполнение шунтирующих операций или ангиопластики было невозможно или их результат был сомнителен из-за окклюзии дистального артериального русла.
У всех пациентов было получено информированное согласие на эксперимент. Протокол эксперимента одобрен Республиканским Комитетом по этическим вопросам (Протокол №10 от 23.11.05 г.).
В течение пяти дней пациентам производили подкожные инъекции рекомбинантного препарата грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора, затем проводили процедуру лейкафереза на аппарате MCS + (Haemonetics, USA); получали конечный продукт — лейкоцитарную массу, обогащенную клетками-пред-шественницами гемопоэза, в котором проводили подсчет общего числа лейкоцитов и CD34+ клеток (CD34 — наиболее известный и надежный маркер гемопоэти-ческих СК) методом проточной цитометрии. Средний объем введенного аутотрансплантата составил +
ров — 6,73+2,2x109, из них С034 + клеток — 2,94+2,31 2x107. Жизнеспособных клеток в трансплантате было 99,9%.
Операцию по забору биопсии производили под эпидуральной анестезией. Через кожный разрез на уровне середины голени производили забор икронож-
xx
пункционную инфильтрацию передней и задней группы мышц голени выделенным концентратом клеток в равноудаленных точках равными дозами по 1,5 мл +x
псию забирали под местной инфильтрационной анестезией через 12 нед. после аутотрансплантации.
Для объективизации изменения степени ишемии до и после введения СК определяли лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ), выполняли стандартный тредмил-тест [17], тетраполярную реографию, дигитальную субтракционную аортоартериографию [18].
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Биоптаты после фиксации в 10% нейтральном формалине заливали в парафин, полученные парафиновые срезы (толщина 4—6 мт) для визуализации капилляров подвергали иммуногистохимическому окрашиванию с коммерческими моноклональными антителами к маркерам эндотелия — CD31 (клон 1А10, Novocastra, UK, разведение 1:10), CD34 (клон QBEnd/10, Novocastra, UK, разведение 1:75), vWF (клон F8/86, DAKO, Denmark, разведение 1:25), маркеру миосателлитов — миогенину (клон F5D, DAKO, Denmark, разведение 1:50). В работе использована система визуализации Novolink (Novocastra, UK). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.
После визуализации капилляров на срезах биопсий выбирали по 3 случайных поля зрения. Подсчитывали число капилляров в каждом поле по ранее описанной методике [19]. Срезы, окрашенные с антителами к миогенину, подвергали микроскопированию, оценивали количество и локализацию миогенин-по-зитивных клеток, морфологию миогенин-позитивных клеток и клеток их микроокружения, сопоставляли результаты окрашивания на миогенин с данными окрашивания на эндотелиальные маркеры.
Обработку данных производили с помощью статистического графического пакета Statistica 8. Определяли коэффициент корреляции Пирсона, достоверность проверяли с помощью t-критерия Стьюдента. Полученные данные представляли в виде «среднее значение ± стандартное отклонение».
Результаты
Отмечено улучшение состояния пациентов по данным инструментальных исследований. Показатели ЛПИ увеличились на 12% (0,59+0,04 исходно и 0,66+0,04 на сроке 12 нед., р = 0,001). Увеличение дистанции безболевой ходьбы составило 26,5% ++
Соответственно, время восстановления ЛПИ при выполнении тредмил-теста через 3 мес. после транс-
+
+
Показатели тетраполярной реографии не имели достоверных различий. Исходный реографический
+
+
показателя на стопе также не отразили адекватной
++
(р=0,941)) (рис. 1, 2).
На контрольных артериограммах отмечено появление коллатеральных сосудов, отсутствующих на первичных снимках, однако оценить степень их развития не позволяет отсутствие достоверных статистических критериев.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов биоптатов на эндотелиальные маркеры (CD31, CD34, vWF) позволило выявить как капиллярную сеть, так и крупные сосуды. В ранних исследованиях показано, что иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD34 позволяет наиболее полно визуализировать капиллярную сеть [20], что может быть связано с тем, что CD34 — маркер прогениторных клеток, в том числе клеток-предшественниц эндотелия [21 ], и, следовательно, позволяет выявить капилляры на более ранней стадии развития. Поэтому анализ данных о плотности капиллярной сети производили по результатам окрашивания с антителами к CD34.
ml
3 до лечения С после лечения
ЛПИ РИ, голень РИ, стопа
* - р а 0,001, ** - р а 0^9, *** - р а 0,941
Рис. 1. Измерение лодыжечно-плечевого индекса [ЛПИ] до и через 3 мес. после введения СК показывает его увеличение в среднем на 12% [0,59±0,04 исходно и 0,66±0,04 на сроке 12 нед, р = 0,001).
Показатели тетраполярной реографии не имели достоверных различий: исходный реографический индекс [РИ] на голени составил 0,27±0,03, на сроке 3 нед. 0,26±0,03 [р = 0,559], на стопе 0,29±0,04 до и 0,3±0,04 через 3 нед. после введения СК [р = 0,941)
800
700
600
S00
400
300
200
100
0
J до лечения “I после лечения
Дистанция безболевой Время восстановления ходьбы, м ЛПИ
* - р'0,001, ** - р а 0,003
Рис. 2. Измерение дистанции безболевой ходьбы и время восстановления исходного ЛПИ по результатам тредмил-теста до и через 3 мес. после введения СК выявило положительную динамику в виде увеличения дистанции безболевой ходьбы на 26,5%
[с 102£±11,55 м до 129,4±11,13 м [р<0,001)). Соответственно, время восстановления ЛПИ при выполнении тредмил-теста на сроке 3 мес. снизилось на 32,2% [с 627,3±66,9 до 425,0±58,2 с, р = 0,003
Результаты иммуногистохимического окрашивания биоптатов с антителами к С034 показали увеличение плотности капиллярной сети на сроке 3 месяца на 25,0% (соотношение «число капилляров/число мышечных волокон» возрастает с 1,6+0,15 до 2,0+0,12; р<0,001) (рис. 3, 4А, Б).
В биоптатах мышечной ткани, полученных до введения стволовых клеток и окрашенных с антителами к миогенину, мы наблюдали единичные миогенин-позитивные клетки с локализацией, характерной для миосателлитоцитов (под сарколеммой мышечных волокон) (рис. 5). Через 3 мес. после проведенной терапии мы обнаружили увеличение числа миогенин-позитивных клеток. Кроме того, мы наблюдали появление клеток с миогенин-позитивными ядрами (рис. 6), слияние миосателлитоцитов с образованием многоядерных мышечных трубочек (рис. 7), формирование юных мышечных волокон с малым диаметром, центрально расположенным ядром, а иногда и слабо позитивное окрашивание на миогенин (рис. 8, 9).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 4, 2010
І І І І І
Соотношение
2 д «количество капилляров/ количество мышечных волокон»
2
1,5
0,5
До лечения
После лечения
' - р<0,001
Рис. 3. Подсчет количества капилляров и мышечных волокон на срезах биопсий до и через 3 мес. после введения СК, окрашенных с антителами к СОЭ4, показал увеличение плотности капиллярной сети с среднем на 25,0% [с 1,6±0,15 до 2,0±0,12; р< 0,001)
Рис. 4. Биопсия пациента с ХОЗАНК до [А] и через 12 нед. после [Б) аутотрансплантации СК периферической крови. У в. х200. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к СП34 выявляет увеличение плотности капиллярной сети в среднем на 25,0%
[с 1,6±0,15 до 2,0Ю, 12; р< 0,001)
Рис. 5. Биопсия пациента с ХОЗАНК до аутотрансплантации СК периферической крови. Иммуногистохимическое окрашивание на миогенин позволяет выявить миогенин-позитивные клетки с локализацией, характерной для клеток-сателлитов [под сарколеммой мышечных волокон)
Рис. 6. Биопсия пациента с ХОЗАНК через 3 мес. после аутотрансплантации СК периферической крови. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к миогенину выявляет миосателлиты с миогенин-позитивными ядрами в стадии поздней дифференцировки. Ув. х400
Рис. 7. Биопсия пациента с ХОЗАНК через 3 мес. после аутотрансплантации СК периферической крови. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к миогенину позволяет выявить вытянутые клетки-сателлиты, образующие цепочечные скопления [образование мышечных трубочек). Ув. х400
Рис. 8. Биопсия пациента с ХОЗАНК после аутотрансплантации СК периферической крови. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к миогенину выявляет молодые мышечные волокна с миогенин-позитивными ядрами и слабо позитивной цитоплазмой, продольное расположение. Ув. х400
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Рис. 9. Биопсия после аутотрансплантации СК периферической крови. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к миогенину выявляет молодое мышечное волокно с миогенин-позитивными ядрами и меньшим по сравнению со зрелыми мышечными волокнами диаметром, поперечное расположение. Ув. х400
Обсуждение
Первое сообщение о клиническом исследовании терапии ХОЗАНК с применением СК, было выполнено Е. ТаЁе!зЫ-Уиуата, Н. МаЬзиЬага, Т. МигоИага с соавт. в 2002 г. [14]. В настоящее время имеется целый ряд клинических работ, свидетельствующих о положительном эффекте применения СК при ишемии конечностей [4, 22].
Во всех публикациях сообщается о достоверном улучшении показателей, предположительно, за счет неоангиогенеза [13, 14]. Так, в пилотном исследовании Е. ТаЁе!зЫ-Уиуата с соавт. (2002) [14] было отмечено увеличение ЛПИ в среднем на 20% через
4 нед. и на 31% (р<0,0001) через 24 недели после внутримышечного введения мононуклеаров костного мозга, времени безболевой ходьбы в среднем с 1,3 мин до 3,6 и 3,7 мин соответственно (р<0,0001). Сходные результаты получены в исследовании У. Н!даэИ! с соавт. (2004) [13].
Мы также зарегистрировали увеличение ЛПИ на 12% через 3 мес. (р=0,001), дистанция безболевой ходьбы по результатам тредмил-теста увеличилась на 26,5% (р<0,001).
Каковы патогенетические основы терапевтического эффекта трансплантации СК? На сегодняшний день опубликованы экспериментальные работы, в которых показано наличие неоангиогенеза после введения СК, и оно доказывается морфологически с помощью им-муногистохимического и иммунофлюоресцентного анализа плотности капиллярной сети, выявления роста сосудов по данным артериограмм [9, 10, 12, 23]. Нами впервые были выполнены иммуногистохимичес-кие исследования биопсийного материала в условиях клинического эксперимента по аутотрансплантации
скпк.
В результате исследования было установлено увеличение плотности капиллярной сети скелетной мышцы на 25,0% через 3 месяца после внутримышечного введения СК (р<0,001). Ранее рост соотношения количества капилляров и мышечных волокон был показан в вышеупомянутой работе Е. ТаЁе!зЫ-Уиуата
с соавт. (2002) [14], на аутопсиях мышечной ткани пациента с унилатеральной ишемией (2,3+0,6 против 0,74+0,31). Однако механизмы, через которые опосредовано стимулирующее влияние СК на нео-ангиогенез в пораженных конечностях, остаются неизвестными.
Современные теории описывают три возможных пути участия стволовых клеток в регенерации тканей: прямая дифференцировка в клетки регенерирующей ткани, слияние с клетками-резидентами данной ткани и стимуляция их регенерации путем паракринной секреции ростовых и трофических факторов [24]. На основании экспрессии антигенов донора в тканях реципиента на моделях хронической ишемии скелетных мышц показана способность стволовых клеток к дифференцировке в эндотелий и гладкомышечные клетки [9, 10]. Однако другие авторы считают возможной лишь секрецию ростовых факторов и цито-кинов трансплантированными стволовыми клетками человека, которые группируются вокруг сосудов без дифференцировки в ангиогенном направлении [23]. Изучение вопроса о механизме влияния трансплантированных СК на процессы неоангиогенеза у человека in vivo затрудняет отсутствие методов безопасного мечения клеток, которые позволили бы визуализировать трансплантированные аутологичные клетки в тканях человека.
Интересно, однако, что при трансплантации CD34+ клеток пуповинной крови человека в ишемизированные конечности мышей [12] помимо неоангиогенеза было отмечено также увеличение числа регенерирующих мышечных волокон и сделано предположение о миогенной дифференцировке введенных клеток. Для проверки данного предположения нами впервые им-муногистохимическими методами было проведено изучение популяции миосателлитоцитов в биопсийном материале больных ХОЗАНК после трансплантации им аутологичных СК.
Миосателлитоциты идентифицированы и описаны в 1961 г. Alexander Mauro [25]. Одним из важнейших их маркеров является миогенин (myogenin, MYOG, Myf4) — ген и одноименный белок (продукт экспрессии гена), который является фактором транскрипции, индуцирующим выход миосателлитоцитов из клеточного цикла посредством активации ингибиторов онкогенеза р21 и р53. В стадии пролиферации миосателлитоцитов миогенин обнаруживается в цитоплазме, однако на стадии начала слияния клеток наблюдается его присутствие в ядре [26]. Период обнаружения миогенина в ядре совпадает с моментом терминальной дифференцировки миосателлитоцитов и синтезом белков контрактильного аппарата мышечного волокна (тяжелые цепи миозина, десмин) и дальнейшим образованием мышечных трубочек и юных мышечных волокон [27]. Мыши, дефицитные по миогенину, умирают при рождении из-за нарушения дифференцировки миобластов и практически полного отсутствия мышечных волокон, что доказывает решающую роль данного фактора в миогенезе [28].
В нашем исследовании мы показали увеличение в результате трансплантации количества клеток с миогенин-позитивной цитоплазмой, что может быть связано с активацией процесса регенерации в мышечной ткани на фоне улучшения кровоснабжения в результате роста капиллярной сети, секреции факторов роста эндотелия, которые могут приводить
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
к пролиферации и активации миосателлитоцитов [29].
Факт усиленной регенерации мышечной ткани подтверждает обнаружение миосателлитоцитов с ми-огенин-позитивным ядром, что является признаком поздней стадии их дифференцировки [26]. Как показано в нашем исследовании, данные клетки в дальнейшем сливаются с образованием многоядерных мышечных трубочек и формируют юные мышечные волокона с характерной для них морфологией [30].
Таким образом, мы подтвердили гипотезу об активации пролиферации и дифференцировки миоса-теллитов на фоне увеличения плотности капиллярной сети. Данные факты могут служить основой для нового направления в лечении заболеваний мышц — терапии, направленной на коррекцию микроокружения миосателлитоцитов. При этом возможна как прямая дифференцировка введенных СК в миосателлиты и зрелые мышечные волокна, так и стимуляция регенерации мышечных волокон реципиента под влиянием ростовых факторов, секретируемых СК.
Заключение
Аутотрансплантация СКПК приводит к улучшению васкуляризации ишемизированной конечности путем стимуляции развития микроциркуляторного русла, вероятно, за счет прямой дифференцировки СКПК в эндотелиоциты, слияния этих клеток с эндотелиоци-тами, а также стимуляции роста капилляров секре-тируемыми паракринными факторами.
Увеличение плотности капиллярной сети приводит к активации пролиферации и дифференцировки миосателлитоцитов, их слиянию с образованием мышечных трубочек и юных мышечных волокон. Можно предположить, что введенные СК могут дифференцироваться в миосателлитоциты, нельзя исключить также их слияния со зрелыми поврежденными мышечными волокнами реципиента или паракринного стимулирующего влияния.
В совокупности неоангиогенез и происходящая на его фоне регенерация мышечных волокон с участием активированных миосателлитоцитов приводят к улучшению клинических показателей.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Leng С., Lee A.J., Fowkers F.G. et al. Incidence, natural history and cardiovascular events in symptomatic and asymptomatic peripheral arterial disease in the general population. Int. J. Epidemiol. 1996; 25: 1172—8.
2. Рекомендации Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов. Диагностика и лечение больных с заболеваниями периферических артерий. М.: 2DD7; 8.
3. American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistics—2DD4. Dallas; 2DD4.
4. Hiatt W.R., Hirsch A.T., Regensteiner J.G. et al. Clinical trials for claudication. Assessment of exercise performance, functional status, and clinical end points. Vascular Clinical Trialists. Circulation 1995; 92 [III] : 614-21.
5. Казанчан П.О., Попов В.А., Дебелый (О.В. и соавт. Хирургическая реваскуляризация при критической ишемии. Ангиология и сосудистая хирургия. 2DDD; 3: 32—5.
6. Гавриленко А.В., Воронов Д.А., Константинов Б.А. и др. Сочетание реконструктивных операций с генно-инженерными технологиями стимуляции ангиогенеза: современная стратегия улучшения отдаленных результатов лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. Ангиология и сосудистая хирургия. 2008; 14(41: 49-53.
7. Yia-Hetulla S., Martin J. Cardiovascular gene therapy. Lancet 2000; 355: 213-22.
8. Lachmann N.. Nikol S. Therapeutic angiogenesis for peripheral artery disease: stem cell therapy. Vasa 2007; 36CIV): 241—51.
9. Al-Khaldi A., Al-Sabti H., Galipeau J. et al. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model. Ann. Thorac. Surg. 2003; 75: 204-9.
10. Cho S-W., Moon S-H., Lee S-H. et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell-derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation 2007; 116: 2409-19.
11. Gopinath S.D., Rando T.A. Stem cell review series: aging of the skeletal muscle stem cell niche. Aging Cell 2008; 7CIV]: 590—8.
12.Pesce М., Orlandi A., lachininoto M.G. et al. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues. Circ. Res. 2003; 93:e51—e62.
13. Higashi Y., Kimura М., Нага К. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia. Circulation 2004; 109: 1215—8.
14. Tateishi-Yuyama E., Matsubara H., Murohara T. et al. Therapeutic angiogenesis using cell transplantation [TACT] study investigators. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. Lancet 2002; 360: 427—35.
15. Kudo F.A., Nishibe T., Nlishibe M. et al. Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells [CD34 1 ] for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Inter. Ang. 2003; 220V]: 344-8.
16. Grounds M.D., White J.D., Rosenthal N. et al. The role of stem cells in skeletal and cardiac muscle repair. J. Histochem. Cytochem. 2002; 50: 589-610.
17. Gardner A.W., Skinner J.S., Cantwell B.W. et al. Progressive vs single-stage treadmill tests for evaluation of claudication. Med. Sci. Sports Exerc. 1991; 23: 402—8.
18. Espinola-Klein C., Savvidis S. Peripheral arterial disease: epidemiology, symptoms and diagnosis. Internist [Berl) 2009; 50CVIII): 919-26.
19. Zoladz J.A., Semik D., Zawadowska B. et al. Capillary density and capillary-to-fibre ratio in vastus lateralis muscle of untrained and trained men. Folia. Histochem. Cytobiol. 2005; 4301: 11—17.
20. Norrby K., Ridell B. Tumour-type-specific capillary endothelial cell stainability in malignant B-cell lymphomas using antibodies against CD31, CD34 and Factor VIII. APMIS 2003; 111:483-9.
21. Asahara T., Murohara T., Sullivan A. et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964-7.
22. Alobaid N.. Alnaeb M.E., Sales K.M. et al. Endothelial progenitor cells and their potential clinical applications in peripheral arterial disease. Endothelium 2005; 12CV-VI]: 243-50.
23. Iba 0., Matsubara H., Nozawa Y. et al. Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circulation 2002; 106: 2019—25.
24. Gardner R. Stem cells and regenerative medicine: Principles, prospects and problems. C. R. Biol. 2007; 330: 465—73.
25. Mauro A. Satellite cells of skeletal muscle fibres. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961; 9: 493-5.
26. Ferri P., Barbieri E., Burattini S. et al. Expression and subcellular localization of myogenic regulatory factors during the differentiation of skeletal muscle C2C12 myoblasts. J. Cell. Biochem. 2009; 108CVI): 1302-17.
27. Blais A., Tsikitis M., Acosta-Alvear D. et al. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes. Dev. 2005; 19CV): 553—69.
28. Hasty P., Bradley A., Morris J.H. et al. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature 1993; 364(64371: 501-6.
29. Schmalbruch H., Hellhammer U. The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cells. Anat. Rec. 1977; 189:169-175.
30. Blaveri K., Heslop L., Yu D.S. et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Dev. Dyn. 1999; 216:244-256.
Поступила 27.08.2010
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
