CC BY
93
Оригинальные исследования
105
ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ ПОСЛЕ ПРЯМОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ VEGF165 ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ ОБЛИТЕРИРУЮЩИМИ
заболеваниями артерий нижних конечностей
М.О. Мавликеев 1, М.В. Плотников 23, А.В. Максимов 23, Г.Р. Гафиятуллина 1, А.И. Муртазин 4,
Ю.Э. Терегулов 2, И.И. Шамсутдинова 2, А.А. Гумерова 1, А.А. Ризванов 1, А.П. Киясов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан, Казань, Россия
3 Казанская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ,
Казань, Россия
4 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Pathohistological assessment of skeletal muscle after direct gene therapy with vegf165 of patients with peripheral arterial diseases
M.O. Mavlikeev1, MV. Plotnikov 2■3, A.V. Maksimov 2■3, G.R. Gafiyatullina 1, A.I. Murtazin 4, U.E. Teregulov2,
I.I. Shamsutdinova 2, A.A. Gumerova 1, A.A. Rizvanov1, A.P. Kiassov1
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 Republic Clinical Hospital of Republic of Tatarstan, Kazan, Russia
3 Kazan State Medical Academy, Kazan, Russia
4 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
Цель исследования — оценка влияния генной терапии плазмидой, несущей ген vegf165, на структуру скелетной мышечной ткани пациентов с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.
Шести пациентам (степень ишемии II6—III по А.В. Покровскому — Фонтейну) произведены согласно инструкции по применению две внутримышечные инъекции плазмиды (препарат «Неоваскулген», РУ ЛП-000671 от 28.09.2011). Проводили стандартный тредмил-тест, измеряли лодыжечно-плечевой индекс. Гистологическое исследование био-птатов мышц пораженной конечности выполнено до и через 3 мес. после выполнения генной терапии.
При сохранном состоянии мышечной ткани терапия vegf165 стимулирует увеличение средней площади поперечного сечения мышечных волокон без значительного ангиогенного эффекта. В случае сниженной капиллярной плотности терапия vegf165 приводит к улучшению кровоснабжения, что способствует регенерации мышц путем пролиферации миосателлитоцитов и увеличения площади поперечного сечения мышечных волокон, а также деградации избытка соединительной ткани. Показано увеличение дистанции безболевой ходьбы в среднем на 31,74% (с 94,96±49,79 м до 139,11±60,78 м, p<0,05) у всех пациентов. Отмечена корреляция данных патогистологического анализа с клиническими результатами.
Ключевые слова: заболевания периферических артерий, генная терапия, сосудистый эндотелиальный фактор роста, регенерация, иммуногистохимия.
The aim was to elucidate impact of gene therapy with plasmid encoding vegf165 on the muscle tissue pathohistology of patients with peripheral arterial diseases.
Twice repeated intramuscular injections of plasmid («Neovaskulgen», RN LP-000671 from 28.09.2011) were performed to 6 patients (ischemia grade IIb—III by Pokrovsky-Fontaine) according to specification. Standart tredmill test, ankle-brachial index estimation were performed. Histological study of injured muscle biopsies taken before and 3 months after injection was performed.
In intact muscles therapy with vegf165 leads to increase of mean cross-sectional muscle fiber area without significant angiogenic effect. In muscles with decreased capillary density this therapy leads to blood supply improvement promoting regeneration of muscles by myosatellites proliferation and increase of mean cross-sectional muscle fiber area and connective tissue degradation. Treadmill test showed painless walking distance increased by 31,74% on average (from 94,96±49,79 m to 139,11±60,78 m, p<0,05) in all patients. There was correlation of pathohistological analysis with clinical data.
Key words: peripheral arterial diseases, gene therapy, vascular endothelial growth factor, regeneration, muscle biopsies, immunohistochemistry.
Хроническим облитерирующим заболеваниям артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) уделяется незаслуженно малое внимание по сравнению, например, с атеросклерозом коронарных артерий. Согласно эпидемиологическим данным, распространенность ХОЗАНК достигает 10% в популяции [1]. Течение ХОЗАНК характеризуется прогрессирующим течением и зачастую приводит к развитию критической ишемии нижних конечностей (КИНК), которая, в свою очередь, является предиктором инвалидиза-ции и смерти [2]. При возникновении КИНК к концу первого года смертность составляет до 25%, а трети пациентов выполняется ампутация на уровне бедра
е-mail: [email protected]
или голени [3]. В большинстве случаев открытые и рентгенэндоваскулярные реваскуляризирующие вмешательства позволяют сохранить конечность. Пациентам, которым выполнение прямой реваскуляризации невозможно, применяются различные методы стимуляции коллатерального кровообращения, зачастую с недоказанной эффективностью.
Применение генно-терапевтических препаратов, стимулирующих неоангиогенез в ишемизированных тканях, в настоящее время относят к МБ классу доказательности [4]. В России зарегистрирован генный препарат «Неоваскулген», содержащий в качестве действующего вещества плазмиду, обеспечива-
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
106
Оригинальные исследования
ющую экспрессию гена сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF165). Безопасность и клиническая эффективность препарата доказана в ряде исследований [5, 6]. При этом морфологические основы эффективности терапии данным препаратом в клинике остаются неустановленными. В связи с этим нами впервые изучено влияние генной терапии в клинике на морфологические показатели состояния мышечной ткани у пациентов с ХОЗАНК.
Цель работы: оценить влияние прямой генной терапии vegf165 на структуру пораженной мышцы у пациентов с ХОЗАНК.
Материал и методы
В исследовании приняло участие 6 пациентов с ХОЗАНК. Средний возраст пациентов составил 56,3±1,7 года. У всех пациентов была диагностирована ИБ или III стадия (без трофических изменений) хронической артериальной недостаточности по А.В. Покровскому — Фонтейну, диапазон дистанции безболевой ходьбы — 94,96±49,79 м, лодыжечноплечевой индекс (ЛПИ) — 0,43±0,13. У всех пациентов был обнаружен облитерирующий атеросклероз, у одного — сахарный диабет. Один пациент ранее перенес аорто-бедренную реконструкцию (шунт проходим, но перемежающаяся хромота сохранилась), 3 пациента — инфраингвинальные реконструкции (все шунты окклюзированы).
Клиническая оценка функционального состояния кровоснабжения конечности проведена до введения препарата и через 3 мес. путём измерения ЛПИ и стандартного тредмил-теста.
В условиях операционной (отделение сосудистой хирургии ГАУЗ РКБ МЗ Республики Татарстан) под инфильтрационным обезболиванием через кожный разрез на уровне середины голени производили биопсию икроножной мышцы. После ушивания раны выполняли инфильтрацию мышц голени препаратом «Неоваскулген» (РУ ЛП-000671 от 28.09.2011 г.) в дозе 1,2 мг в равноудаленных точках равными дозами, повторная инъекция была произведена через 14 сут. тем же способом. Повторная биопсия указанной области была произведена через 12 нед. после повторной инъекции препарата. У всех пациентов получено информированное согласие на забор био-птатов мышцы.
Биоптаты заливали в парафин по стандартной методике и изготавливали срезы толщиной 4—6 мкм. Поперечные срезы мышечной ткани окрашивали по Массону для выявления соединительной ткани и проведения морфометрического анализа; выполняли иммуногистохимические исследования с использованием коммерческих моноклональных антител к CD34 для визуализации капилляров (клон QBEnd/10, Novocastra, Великобритания, 1:75), к ядерному антигену пролиферирующих клеток для выявления пролиферативной активности клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA, клон PC10, Dako, Дания, 1:200), к миогенину для визуализации активированных миосателлитоцитов (клон F5D, Dako, Дания, 1:50). На срезах, окрашенных по Массону, в трех случайных полях зрения определяли площадь соединительной ткани и ее отношение к общей площади среза в процентах с помощью графического пакета ImageJ (NIH, открытая лицензия). По результатам окрашивания с антителами к CD34 определяли
количество капилляров, соотношение числа капилляров и мышечных волокон (плотность капилляров). Экспрессию PCNA оценивали полуколичественно с учётом локализации PCNA-позитивных ядер. Экспрессию миогенина также оценивали полуколичественно, обращая внимание на локализацию и характер экспрессии (цитоплазматическая, ядерная). Статистическая обработка количественных показателей выполнена с помощью программного пакета STATISTICA, оценка достоверности различий проведена с помощью критерия Вилкоксона.
Результаты
Все пациенты отметили улучшение, выражающееся в увеличении дистанции безболевой ходьбы, потеплении конечности и нормализации сна (купирования болей у пациентов с ХОЗАНК III стадии) уже через 2 нед. после введения препарата. Дистанция безболевой ходьбы по результатам тредмил-теста увеличилась у всех пациентов. Прирост дистанции к 3-му месяцу наблюдения составил в среднем 31,74% (с 94,96±49,79 м до 139,11±60,78 м, p<0,05).
При изучении обзорных препаратов первичных биоптатов в некоторых образцах было отмечено большее содержание соединительной ткани и больший разброс в диаметре и форме мышечных волокон, что позволило разделить пациентов на 2 группы. В первой группе (2 пациента) в первичных биоптатах наблюдается достаточно высокая плотность капилляров (2,17±0,46), относительно невысокий уровень фиброза (11,85±6,83%) и пролиферации (не более 25% позитивных ядер, локализованных в основном в стенке сосудов). У данных пациентов в повторных биоптатах плотность капилляров изменилась незначительно (с 2,17±0,46 до 1,98±0,79, p = 0,68) (рис. 1, 2), площадь соединительной ткани также осталась неизменной (11,85±6,83% против 9,51±3,37%, p = 0,75) (рис. 3, 4). При этом отмечено увеличение средней площади поперечного сечения мышечных волокон с 1459,7±1034,5 мкм2 до 2259,5±1331,75 мкм2, p<0,05 (рис. 4, 5) и количества PCNA-позитивных ядер в мышечных волокнах (до 75% от общего числа ядер), что может являться признаком гипертрофии мышечных волокон (рис. 6). Это предположение также подтверждается появлением в повторных биоптатах молодых мышечных волокон с миогенин-пози-тивными ядрами, тогда как в первичных биоптатах обнаруживаются лишь единичные клетки с цитоплазматическим паттерном окрашивания на миоге-нин между мышечными волокнами (рис. 7). Также у данных пациентов на фоне увеличения дистанции ходьбы не отмечалось прироста ЛПИ (0,69 у первого пациента и 0,41 у второго до введения препарата, 0,69 и 0,4 соответственно через 3 мес.).
Во второй группе (4 пациента) в первичных био-птатах наблюдается сниженная по сравнению с первой группой капиллярная плотность (1,40±0,36), более высокая площадь соединительной ткани (17,18±5,87%), которая была представлена прослойками между отдельными мышечными волокнами, а в отдельных случаях выявлено замещение целых мышечных волокон соединительной тканью. При этом обращает на себя внимание значительная вариабельность формы и размеров мышечных волокон, пустоты, соответствующие по форме и размерам
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
107
мышечным волокнам. В повторных биоптатах установлено значительное увеличение плотности капиллярной сети с 1,40±0,36 до 3,03±0,82, p<0,05 (рис. 1, 2), снижение площади соединительной ткани с 17,18±5,87% до 12,62 5,2%, p<0,05 (рис. 3,
4), увеличение средней площади поперечного сечения мышечных волокон с 1282,42±857,37 мкм2 до 2323,46±1237,58 мкм2, p<0,05 (рис. 4, 5). Мышечные волокна в повторных биоптатах были более мономорфны по форме и размерам. Уровень пролиферации в каждом случае был различен (от единичных PCNA-позитивных ядер до 25—50% позитивных ядер), но не отличался существенно в биоптатах до и после терапии (рис. 6). Окрашивание с антителами к миогенину не выявило значительных различий в биоптатах до и после терапии, в обоих случаях выявлялись единичные миогенин-позитив-ные интерстициальные клетки (рис. 7). У данных пациентов наблюдалось достоверное увеличение ЛПИ более чем на 0,1 (с 0,37±0,04 до 0,49±0,07, p<0,05).
г1 и
Е *
? о
со 2 I- -О о I о т т а)
II
о ш
II
|1
Е Р
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50 1,00 0,50
1 группа I 2 группа 1 группа I 2 группа 0 мес. 3 мес.
Срок наблюдения
— Среднее □ 25%-75% X Мин-Макс
Рис. 1. Соотношение числа капилляров и числа мышечных волокон в биоптатах пациентов до терапии и через 3 мес. после терапии. Достоверное увеличение капиллярной плотности во 2 группе (p<0,05)
Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD34 (А, Б — 1 группа, В, Г — 2 группа):
А, В — скелетная мышечная ткань до терапии; Б, Г — через 3 мес. после терапии. Докраска: гематоксилин. Ув. х.200
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
108
Оригинальные исследования
Срок наблюдения
— Среднее □ 25%-75% X Мин-Макс
Рис. 3.
Соотношение площади соединительной ткани и общей площади срезов биоптатов (в %) до терапии и через 3 мес. после терапии. Достоверное снижение площади соединительной ткани во 2 группе (p<0,05)
Рис. 4. Скелетная мышечная ткань биоптатов от пациентов (А, Б — 1 группа, В, Г — 2 группа):
А, В — до терапии; Б, Г — через 3 мес. после терапии.
Уменьшение доли соединительной ткани во 2 группе, увеличение диаметра мышечных волокон в 1 и 2 группах. Окраска: по Массону. Ув. х200
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
109
Срок наблюдения
— Среднее □ 25%-75% I Мин-Макс
Рис. 5.
Площадь поперечного сечения мышечных волокон (в мкм2) в биоптатах пациентов до терапии и через 3 мес. Наблюдается достоверное увеличение площади поперечного сечения в 1 и 2 группах (p<0,05)
Рис. 6. Иммуногистохимическая реакция с антителами к PCNA (А, Б — 1 группа, В, Г — 2 группа): А, В — скелетная мышечная ткань до терапии; Б, Г — через 3 мес. после терапии.
Увеличение числа PCNA-позитивных ядер в 1 группе.
Докраска гематоксилин. Ув. х400
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
110
Оригинальные исследования
Рис. 7. Иммуногистохимическая реакция с антителами к миогенину (А, Б — 1 группа, В, Г — 2 группа): А, В — скелетная мышечная ткань до терапии; Б, Г — через 3 мес. после терапии.
Докраска: гематоксилин. Ув. х400
Обсуждение
Проведенное исследование позволило получить новые сведения о морфологических изменениях, происходящих в пораженной хронической ишемией мышце в результате прямой генной терапии плазмидой, несущей ген vegf165.
Установлено, что степень и характер изменений структуры мышечной ткани под воздействием современного гентерапевтического лечения зависят от исходного состояния мышечной ткани. При сравнительно сохранном (1-я группа) исходном состоянии мышечной ткани (высокий уровень плотности капилляров, незначительный уровень фиброза) генная терапия не привела к значительным изменениям этих показателей. При этом отмечено увеличение уровня пролиферации и средней площади поперечного сечения мышечных волокон, что может свидетельствовать о регенерации мышечной ткани путём пролиферации миосателлитоцитов и гипертрофии мышечных волокон [7]. Это также подтверждается появлением молодых мышечных волокон с миоге-нин-позитивными ядрами, что было показано ранее
[8]. Установленное отсутствие роста плотности капиллярной сети и улучшения функциональных параметров кровоснабжения может свидетельствовать об ином, не связанном с ангиогенезом, механизме
улучшения функции конечности. Ранее было показано, что VEGF стимулирует дифференцировку мышечных предшественников в культуре и способствует их гипертрофии [9], а также индуцирует компенсаторную гипертрофию сердечной мышцы после инфаркта миокарда [10], однако конкретные молекулярные механизмы данных эффектов остаются неизученными. Показано антиапоптотическое действие VEGF на мышечные клетки [11].
Значительные сдвиги морфологической картины наблюдаются в ситуации, когда исходно у пациентов наблюдается интенсивная дегенерация мышечной ткани и ее замещение соединительной тканью на фоне сниженной плотности капилляров (2-я группа). В этом случае генная терапия приводит к значительному увеличению плотности капилляров, снижению площади соединительной ткани и увеличению средней площади поперечного сечения мышечных волокон, а также к нормализации гистологической картины в целом. Можно предположить, что повышенная экспрессия VEGF способствует пролиферации эндотелия, а улучшение кровоснабжения, также подтверждаемое положительной динамикой ЛПИ, стимулирует регенерацию мышечных волокон путем пролиферации миосателлитоцитов и гипертрофии зрелых мышечных волокон, исходно находившихся
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
111
в состоянии атрофии (принципиальная возможность восстановления мышцы после атрофии показана в экспериментах по иммобилизации конечностей [12], но данные по атрофии, связанной с ХОЗАНК отсутствуют). При этом значительный интерес представляет механизм, приводящий к снижению площади соединительной ткани после генной терапии vegf165. Известно, что VEGF участвует в ангиогенезе не только стимулируя пролиферацию и миграцию эндотелия, но и привлекая макрофаги, экспрессирующие рецепторы к нему. Эти клетки, в свою очередь, увеличивают сосудистую проницаемость, способствуют вазодилятации и экспрессируют протеазы, необходимые для разрушения межклеточного матрикса и роста капилляров [13]. Возможно, именно привлеченные макрофаги способствуют деградации соединительной ткани вокруг мышечных волокон.
Следует отметить, что в оценке степени ишемии по клиническим данным, значениям ЛПИ и дистанции безболевой ходьбы у больных наблюдались существенные отличия, тогда как результаты исследования исходных биоптатов позволили разделить пациентов на группы. Более того, первоначальные отличия патогистологической картины у двух групп пациентов, очевидно, обусловили разный терапевти-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Fowkes G.R., Rudan D., Rudan I. et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. The Lancet 2013; 382: 1329-40.
2. Muluk S.C., Muluk V.S., Kelley M.E. et al. Outcome events in patients with claudication: A 15-year study in 2777 patients. J. Vasc. Surg. 2001; 33: 251-258.
3. Hirsch A.T., Haskal Z.J., Hertzer N.R. et al. ACC/AHA 2005 Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (Lower Extremity, Renal, Mesenteric, and Abdominal Aortic): A Collaborative Report from the American Association for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (Writing Committee to Develop Guidelines for the Management of Patients With Peripheral Arterial Disease) J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 1-192.
4. Национальные рекомендации по ведению пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей. М., 2013: 35.
5. Швальб П.Г., Гавриленко А.В., Калинин Р.Е. и др. Эффективность и безопасность применения препарата «Неоваскул-ген» в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (Ilb-III фаза клинических испытаний) Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI (3): 76-83.
6. Червяков Ю.В., Староверов И.Н., Нерсесян Е.Г и др. Терапевтический ангиогенез в лечении больных с хроническими облитерирующими заболеваний артерий нижних конечностей. Ближайшие
ческий эффект (как морфологический, так и клинический) проведенной генной терапии. В этой связи мы считаем, что более широкое использование в клинической диагностике морфологического и иммуногистохимического анализа биоптатов мышечной ткани, сопоставление гистологической картины и клинических показателей пациентов с ХОЗАНК позволят понять и объяснить противоречивые результаты клинических исследований эффективности генных и клеточных технологий для стимуляции неоангиогенеза при ХОЗАНК, а в конечном итоге - более точно определять показания к применению терапевтического ангиогенеза и прогнозировать дальнейшее течения заболевания.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа поддержана грантом Российского научного фонда (№ 14-15-00916).
и отдаленные результаты. Ангиология и сосудистая хирургия 2012; 3: 19-27.
7. Ishido M., Kami K., Masuhara M. Localization of MyoD, myogenin and cell cycle regulatory factors in hypertrophying rat skeletal muscles. Acta Physiol. Scand. 2004; 180 (3): 281-9
8. Мавликеев М.О., Андреева Д.И., Газизов И.М. с соавт. Регенерация мышечной ткани и активация миосателлитоцитов при аутотрансплантации стволовых клеток периферической крови пациентам с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; V (4): 79-84.
9. Bryan B.A., Walshe T.E., Mitchell D.C. et al. Coordinated vascular endothelial growth factor expression and signaling during skeletal myogenic differentiation. Mol. Biol. Cell 2008; 19 (3): 9941006.
10. Zentilin L., Puligadda U., Lionetti V. et al. Cardiomyocyte VEGFR-1 activation by VEGF-B induces compensatory hypertrophy and preserves cardiac function after myocardial infarction. FASEB J. 2010; 24 (5):1467-78
11. Arsic N., Zacchigna S., Zentilin L. et al. Vascular endothelial growth factor stimulates skeletal muscle regeneration in vivo. Mol. Ther. 2004; 10 (5): 844-54.
12. Brooks N.E., Myburgh K.H. Skeletal muscle wasting with disuse atrophy is multi-dimensional: the response and interaction of myonuclei, satellite cells and signaling pathways. Front Physiol. 2014; 17(5): 99.
13. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы. Кардиологический вестник 2007; II (2): 5-14.
Поступила: 13.08.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
