CC BY
63
М.В. ПЛОТНИКОВ, А.П. КИЯСОВ, С.Д. МАЯНСКАЯ, М.О. МАВЛИКЕЕВ, И.М. ГАЗИЗОВ, А.А. ГУМЕРОВА, В.П. ТАМАКОВА, Г.В. ЧЕРЕПНЕВ, И.И. ШАМСУТДИНОВА
Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан Казанская государственная медицинская академия
Казанский государственный медицинский университет удк 6І6.13
Клинический опыт применения клеточной терапии у пациентов с заболеванием периферических артерий
I Плотников Михаил Викторович
врач отделения сосудистой хирургии № 1
420068, г. Казань, ул. Оренбургский Тракт, д. 138, тел. (843) 268-69-87, e-mail: [email protected]
Представлены результаты применения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) периферической крови у пациентов с заболеванием периферических артерий (ЗПА). Внутримышечная аутотрансплантация ГСК в пораженную конечность выполнена 30 мужчинам с ЗПА. Для объективизации результатов исследования применялось измерение лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ), тредмил-тест, время восстановления исходного ЛПИ после нагрузки, иммуногистохимия. Зафиксировано достоверное улучшение функционального состояния конечности после аутотрансплантации по данным ЛПИ и тредмил-теста. По данным иммуногистохимического исследования, отмечено увеличение плотности капиллярной сети, активация пролиферации и дифференцировки миосателлитов.
Ключевые слова: заболевания периферических артерий, ангиогенез, неомиогенез, гемопоэтические стволовые клетки периферической крови, СD34+, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, иммуногистохимия.
M.V. PLOTNIKOV, A.P. KIASOV, S.D. MAYANSKAYA, M.O. MAVLIKEEV, I.M. GAZIZOV, A.A. GUMEROVA, V.P. TAMAKOVA, G.V. CHEREPNEV, I.I. SHAMSUTDINOVA
Republican Clinical Hospital of Ministry of Health Care of the Republic of Tatarstan Kazan State Medical Academy Kazan State Medical University
Clinical experience application cell therapy in patients with peripheral arterial disease
The results of application of hematopoietic stem cells (HSCs) in the peripheral blood of patients with peripheral arterial disease (PAD) were presented. Intramuscular autotransplantation of HSCs in the affected limb is made of 30 men with PAD. For the results of the study used objectification measure ankle-brachial index (ABI), treadmill test, the recovery time after the original ABI load, im-munohistochemistry. Significant improvement in functional status after autotransplantation limbs according to ABI and treadmill test was registered. According to the immunohistochemical study was an increase in the density of the capillary network, the activation of proliferation and differentiation miosatellits.
Keywords: peripheral arterial disease, angiogenesis, neomyogenesis, hematopoietic peripheral blood stem cells, CD34+, granulocyte colony stimulating factor, immunohistochemistry.
Заболевания периферических артерий (ЗПА) по-прежнему остаются одной из наиболее частых причин снижения качества жизни, инвалидизации и занимают большую долю в структуре смертности [1]. Общая распространенность заболеваний периферических артерий в популяции, по данным различных
исследований, варьирует в пределах 3-10%, увеличиваясь до 15-20% в возрастной группе старше 70 лет [2].
При возникновении поражений дистального артериального русла и микроциркуляторного звена ангиохирургия и фармакотерапия достигли определенного предела возможностей [3].
Это определяет сохраняющийся интерес к непрямым методам реваскуляризации — десимпатизации, интрамускулярного введения аутокрови, реваскуляризирующей остеоперфорации, артериализации венозного кровотока. Однако недостаточная эффективность данных методов лечения заставляет продолжить поиск альтернативных способов улучшения кровоснабжения. Одним из путей решения данной проблемы является применение клеточных технологий.
В настоящее время известны экспериментальные работы, в которых показано достоверное увеличение плотности капиллярной сети и развитие коллатералей в ишемизированной скелетной мышце после введения различных типов клеток. Положительные результаты этих исследований стали толчком к апробации клеточных технологий в клинике [4].
Цель работы: определить эффективность трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) периферической крови в мышечную ткань у больных с заболеванием периферических артерий (ЗПА).
Материалы и методы
Клиническая часть исследования выполнена на базе отделения сосудистой хирургии РКБ МЗ РТ. В исследование были включены пациенты с хронической ишемией нижних конечностей IIБ степени (по А.В. Покровскому), у которых выполнение прямой реваскуляризации (шунтирующих операций или ангиопластики) невозможно или результат их сомнителен из-за окклюзии подколенно-берцового сегмента. Трансплантация аутологичных ГСК периферической крови проведена 30 больным с ЗПА (мужчины в возрасте 27-60 лет, средний возраст 51,2±1,5). Структура заболеваний: облитерирующий атеросклероз — 27, облитерирующий тромбангиит — 3 пациента. Восемь пациентов ранее перенесли аорто-бедренные реконструкции, один — пластику глубокой артерии бедра (срок 7-10 месяцев) — все шунты проходимы. У 8 пациентов ранее было выполнено бедренно-подколенное шунтирование (в одном случае — двукратное), все шунты на момент включения в исследования были окклюзированы. Три пациента перенесли поясничную симпатэктомию. Гемодинамически значимое поражение артерий обеих конечностей имелось у 7 из 30 пациентов (лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ) на контралатеральной конечности 0,83±0,08). Результаты контролировали при помощи функциональных проб и иммуногистохимического анализа мышц пораженной конечности до и после введения ГСК.
У всех пациентов было получено информированное согласие на исследование. Протокол исследования одобрен Республиканским комитетом по этическим вопросам (Протокол №10 от 23.11.05 г).
Определены следующие критерии включения: проходимость аорто-бедренного сегмента и глубокой артерии бедра, возраст до 60 лет (включительно), хроническая артериальная недостаточность IIБ степени (по А.В. Покровскому), длительность заболевания и/или время от последнего реконструктивного вмешательства более 6 месяцев при отсутствии эффекта от консервативной терапии, окклюзия подколенной и/или берцовых артерий. Таким образом, в исследование были включены пациенты с инфраингвинальными поражениями, у которых прямая реваскуляризация была невозможна или имела сомнительный прогноз из-за окклюзии подколенно-берцового сегмента.
Критерии исключения — наличие критической ишемии как состояния, требующего активной консервативной, реконструктивной или органоуносящей тактики, противопоказания к применению препарата Нейпоген (рекомбинантный О-СвР),
тяжелая сердечно-сосудистая недостаточность, нарушение сознания, онкозаболевания, вирусные гепатиты и инфекция ВИЧ.
Стимуляцию и мобилизацию ГСК в периферическую кровь выполняли препаратом рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Нейпоген®) в течение 5 дней в суточной дозе 1 млн.ед./кг массы тела. На 6-й день производили процедуру лейкафереза на многофункциональном клеточном сепараторе крови MCS+ (Haemonatics Corporation, USA) с получением суспензии мононуклеаров, обогащенной ГСК. Около половины объема полученного от каждого пациента клеточного продукта отбирали для замораживания и хранения. Подсчет абсолютного числа жизнеспособных ГСК с фенотипом CD45dimCD34+SSClow выполняли в лаборатории клинической иммунологии РКБ по протоколу ISHAGE на проточном цитометре Facs Calibur (BD, USA) c применением набора Stem-Kit® Reagents (# IM3630, Beckman Coulter, France) по инструкции производителя. Использовали комбинацию моноклональных антител CD45-FITC/CD34-PE и краситель 7-аминоактиномицин D (7-AAD) для идентификации нежизнеспособных клеток. Операцию по забору биоптата проводили под спинномозговой анестезией. Кожный разрез выполняли на уровне середины голени, выделяли медиальную часть икроножной мышцы, производили забор мышцы размерами 0,5х0,5х0,5 см. После обеспечения гемостаза и послойного ушивания раны выполнялась пункци-онная инфильтрация передней и задней группы мышцы голени выделенным концентратом клеток в равноудаленных точках одинаковыми объемами. На 2-е сутки после манипуляции пациенты выписывались из стационара.
Средний объем введенного аутотрансплантата составил 43,5±1,6 мл; медиана количества имплантированных мононуклеаров — 6,95 х 109 (5-95 перцентиль: 3,89 х 109 — 9,87 х 109), из них жизнеспособных имплантированных ГСК — 23,7 х 106 (5-95 перцентиль: 9,75 х 106 — 97,0 х 106). Жизнеспособных клеток (по критерию непроницаемости клеточной мембраны для 7-AAD) в трансплантате не менее 98%.
Повторный забор биоптата производили под местной ин-фильтрационной анестезией через 12 недель после аутотрансплантации. Весь период наблюдения пациенты получали ацетилсалициловую кислоту в дозе 100 мг.
Биоптаты после фиксации в 10% нейтральном формалине заливали в парафин, полученные парафиновые срезы (толщина 4-6 |jm) для визуализации капилляров подвергали им-муногистохимическому окрашиванию с коммерческими моноклональными антителами к маркерам эндотелия — CD31 (клон 1А10, Novocastra, UK, разведение 1:10), CD34 (клон QBEnd/10, Novocastra, UK, разведение 1:75), vWF (клон F8/86, DAKO, Denmark, разведение 1:25), маркеру миосателлитов — миоге-нину (клон F5D, DAKO, Denmark, разведение 1:50). В работе использована система визуализации Novolink (Novocastra, UK). Ядра клеток докрашивали гематоксилином. После визуализации капилляров на срезах биопсий выбирали по 3 случайных поля зрения, где подсчитывали число капилляров в каждом поле. Срезы, окрашенные с антителами к миогенину, подвергали микроскопированию, оценивали количество и локализацию миогенин-позитивных клеток, морфологию миогенин-позитивных клеток и клеток их микроокружения, сопоставляли результаты окрашивания на миогенин с данными окрашивания на эндотелиальные маркеры.
Для объективизации степени ишемии конечности определяли лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ, соотношение систолических давлений в области лодыжки и плеча, в норме ЛПИ от 0,9 до 1,2), выполняли тредмил-тест (нагрузочный диагностический метод с использованием дозированной ходьбы по бегущей дорожке) по методике И.И. Затевахина, тетраполярную рео-
графию и аортоартериографию. В утвержденный протокол исследования также входили стандартный клинический и биохимический анализ крови, липидограмма и гемостазиограмма.
Использовали статистические пакеты STATGRAPHICS CenturionXVI и STATISTICA 6. Распределение значений переменных проверяли на нормальность в тесте Колмогорова — Смирнова — Лиллиефорса. Достоверность отличий вычисляли в непараметрическом тесте Вилкоксона для двух зависимых переменных (группы до и после аутотрансплантации ГСК). Наличие корреляций между переменными тестировали при помощи регрессионного анализа и коэффициентов Спирмена.
Результаты
Осложнений при стимуляции и мобилизации аутологичных клеток, заборе биопсии и интрамускулярном введении клеточной суспензии не наблюдали. Нейпоген эффективно активировал лейкопоэз (рис. 1). Субъективное улучшение, выражающееся в увеличении дистанции или исчезновении ограничения безболевой ходьбы в привычном для себя темпе, отметили 27 из 30 пациентов. Причем положительный эффект больные начинали ощущать уже через 2-3 недели. Не отметили субъективного улучшения 2 пациента. В одном случае констатировано ухудшение, связанное со стенозированием дистального анастомоза аорто-бедренного шунта, по поводу которого выполнена хирургическая коррекция. Отдаленные результаты изучены на сроке 3, 6 и 12 месяцев.
Рисунок 1.
Результат стимуляции и мобилизации ГСК в периферическую кровь препаратом рекомбинантного грануло-цитарного колониестимулирующего фактора (Нейпоген®) в течение 5 дней в суточной дозе 1 млн ед./кг массы тела
Рисунок 2.
Динамика изменения лодыжечно-плечевого индекса
ЛОДЫЖЕЧНО-ПЛЕЧЕВОЙ ИНДЕКС
с
с;
0,85
0,80
0,75
0,70
0,65
0,60
0,55
0,50
0,45
Р=0,00075 Jj =0,00269 Г- Р=ООС 296
0,68'
0,677) 0,67 0
0,580 1
| Р>0,0Е
0 3 6 12
ВРЕМЯ, МЕС.
■ Median ; 25%-75%
Рисунок 3.
Динамика изменения дистанции безболевой ходьбы по результатам тредмил-теста
ДИСТАНЦИЯ БЕЗБОЛЕВОЙ ХОДЬБЫ
л
180
ш
- 140
(К
^ 120 О
Ч 100
О.
Р=0,00013 Р=0,01124 Р=0,02771
136 131
124|
86 I
0 3 6 12
ВРЕМЯ, МЕС.
- Median ■ 25%-75%
Рисунок 4.
Динамика изменения времени восстановления лодыжечно-плечевого индекса после нагрузочной ходьбы
Достоверную положительную динамику на отдаленных сроках исследования продемонстрировали следующие функциональные параметры периферического кровотока:
1. ЛПИ: до трансплантации ГСК — 0,58; через 3 мес. — 0,68; через 6 мес. — 0,69; через 12 мес. — 0,67 (рис. 2);
2. дистанция безболевой ходьбы: до трансплантации ГСК — 86 м, через 3 мес. — 124 м, через 6 мес. — 136 м, через 12 мес. — 138 м (рис. 3);
3. время восстановления исходного ЛПИ после дозированной нагрузки: до трансплантации ГСК — 540 сек., через 3 мес. — 470 сек., через 6 мес. — 518 сек., через 12 мес. — 519 сек. (рис. 4).
ВРЕМЯ, МЕС.
Исследование методом тетраполярной реографии (реогра-фический индекс на голени и стопе) не выявило достоверной динамики значений индекса на всех сроках наблюдения после трансплантации. На контрольных артериографиях отмечено появление коллатеральной сети, отсутствующей на первичных снимках, однако оценить степень их развития не позволяет отсутствие достоверных статистических критериев.
По результатам иммуногистохимического окрашивания на предварительном этапе работы нами был выбран маркер эндотелия, наиболее подходящий для визуализации капилляров на парафиновых срезах мышечной ткани. По данным окрашивания срезов биопсий на эндотелиальные маркеры (СР31, СР34, vWF) было установлено, что экспрессия СР31 и vWF представлена в эндотелии крупных сосудов и отдельных капилляров и, в целом, очень вариабельна. Окрашивание антителами к СР34 было стабильным и позволяло выявить как все капилляры, так и крупные сосуды. Поэтому плотность капиллярной сети оценивали по экспрессии СР34.
Иммуногистохимический анализ биоптатов выявил увеличение плотности капиллярной сети на сроке 3 месяца на 22,4% (индекс К/М — соотношение «капилляры/мышечное волокно» — возрастает после аутотрансплантации с 1,52 до 1,86; р=0,0005) (рис. 5).
При регрессионном анализе переменных обнаружена положительная достоверная корреляция средней силы между числом трансплантированных ГСК и индексом К/М, и получена модель, задаваемая следующим уравнением: К/М=1/(2,20363—
0,0973314*1п(ГСК)), (рис. 6).
юных мышечных волокон с малым диаметром и центрально расположенным ядром, а иногда и слабо позитивное окрашивание на миогенин.
Рисунок 6. Статистическая модель зависимости плотности капиллярной сети мышечной ткани от абсолютного числа трансплантированных ГСК
Рисунок 5. Соотношение «капилляры/мышечное волокно» до трансплантации и на сроке 3 месяца
Корреляционный анализ, выполненный методами непараметрической статистики (вычисление коэффициента Спирмена), установил ряд значимых корреляций между переменными (табл. 1).
В биоптатах мышечной ткани, полученных до введения стволовых клеток и окрашенных с антителами к миогенину, мы наблюдали единичные миогенин-позитивные клетки с локализацией, характерной для клеток-сателлитов (под сарколеммой мышечных волокон). Через 3 месяца после проведенной терапии мы обнаружили увеличение числа миогенин-позитивных клеток. Кроме того, мы наблюдали появление клеток с миогенин-позитивными ядрами, слияние миосателлитов с образованием многоядерных мышечных трубочек, формирование
Обсуждение
Первое сообщение о масштабном клиническом исследовании (п=47) стволовых клеток было выполнено Та1е1зЫ Уиуата Е. и др. в 2002 году [4]. Авторы доказали эффективность трансплантации ядросодержащих клеток костного мозга при ишемии конечности в сравнении с трансплантацией периферической крови и плацебо. При этом положительный эффект сохранялся в течение 24 недель наблюдения.
В настоящее время имеется целый ряд клинических работ, свидетельствующих о положительном эффекте применения стволовых клеток, полученных из различных источников, при ишемии конечностей. Оценка эффективности трансплантации стволовых клеток в ранее выполненных исследованиях выполнялась с помощью стандартных функциональных проб (ЛПИ, транскутанное определение кислорода, тредмил-тест) и по динамике заживления трофических расстройств. Также предпринимались попытки объективизации при помощи ангиографии. Во всех отчетах сообщается о достоверном улучшении показателей, по-видимому, за счет неоангиогенеза.
Несмотря на то, что большинство клинических работ по применению стволовых клеток для стимуляции ангиогенеза были проведены у пациентов с критической ишемией, мы сочли неэтичным включение этой группы больных в наше исследование, учитывая недостаточную доказательную базу, имеющуюся на сегодняшний день. Поэтому апробация метода была проведена на больных, не имеющих показаний к традиционным хирургическим (реконструктивным или органоуносящим) методам лечения (ХАН IIБ степени с отсутствием дистального воспринимающего русла).
В рамках настоящего исследования мы не предусматривали наличие контрольной группы. Прогноз сохранения конечности при ЗПА определяется в целом как благоприятный, однако имеются данные, что прогрессивное снижение ЛПИ составляет в среднем 0,014 в год, уменьшение дистанции безболе-вой ходьбы — 9,2 ярда (8,41 метра) в год, а кумулятивный 10-летний риск развития ишемических язв и ишемических бо-
лей покоя — у 23 и 30% пациентов соответственно [9]. Компенсация же достигается прежде всего развитием коллатерального кровообращения. Имеются также работы, в которых показаны преимущества клеточной терапии как перед группой с плацебо [4], так и при изолированном введении гранулоцитарного стимулирующего фактора [5].
Необходимо отметить, что наблюдаемый положительный эффект аутотрансплатации ГСК возникает достаточно быстро: объективно он верифицируется через 3 месяца, а субъективное улучшение наступает через 2-3 недели. Это предполагает возможность применения в дальнейшем данного метода лечения у пациентов с критической ишемией.
Имеются экспериментальные работы, в которых наличие неоангиогенеза после введения стволовых клеток доказывается морфологически, однако в клинических условиях гистохимическая оценка ГСК-стимулированного неоангиогенеза выполнена нами впервые. При этом выявлено увеличение плотности капиллярной сети скелетной мышцы на 22,4% через 3 месяца после интрамускулярного введения ГСК (p=0,00054). После аутотрансплантации ГСК величина индекса К/М (зависимая переменная) положительно коррелировала с абсолютным числом ГСК в клеточном трансплантате (независимая переменная). Полученное уравнение регрессии позволяет ориентировочно прогнозировать величину индекса К/М в зависимости от числа трансплантированных ГСК. Из распределения данных на графике (рис. 6) также следует, что для достижения значений К/М>2 в большинстве случаев требуется трансплантация не менее 3х107 ГСК (минимальное «целевое значение»). Эффективность нейпоген-индуцированной стимуляции лейкопоэза отрицательно коррелирует с исходным временем восстановления ЛПИ, что может подразумевать меньшую эффективность мобилизации ГСК на поздних стадиях ЗПА и заставляет задуматься о показаниях к клеточной терапии на более ранних этапах.
Современные теории описывают три возможных пути участия стволовых клеток в регенерации тканей: прямая диф-ференцировка в клетки регенерирующей ткани, слияние с клетками-резидентами данной ткани и стимуляция их регенерации путем паракринной секреции ростовых и трофических факторов [6]. Изучение вопроса о механизме влияния трансплантированных СК на процессы неоангиогенеза у человека in vivo затрудняет отсутствие методов безопасного мечения клеток, которые позволили бы визуализировать трансплантированные аутологичные клетки в тканях человека.
Интересно, однако, что при трансплантации CD34+ клеток пуповинной крови человека в ишемизированные конечности мышей помимо неоангиогенеза было отмечено также увели-
* отношение числа лейкоцитов/мкл крови после курса нейпогена к исходному уровню
чение числа регенерирующих мышечных волокон и сделано предположение о миогенной дифференцировке введенных клеток. Для проверки данного предположения нами впервые иммуногистохимическими методами было проведено изучение популяции клеток-сателлитов в биопсийном материале больных ЗПА после трансплантации им аутологичных СК.
Миосателлиты идентифицированы и описаны в 1961 г. Alexander Mauro [7]. Одним из важнейших маркеров миоса-теллитов является миогенин (myogenin, MYOG, Myf4) — ген и одноименный белок (продукт экспрессии гена), который является фактором транскрипции, индуцирующим выход клеток-сателлитов из клеточного цикла посредством активации ингибиторов онкогенеза p21 и p53. В стадии пролиферации мио-сателлитов миогенин обнаруживается в цитоплазме, однако на стадии начала слияния миосателлитов наблюдается его присутствие в ядре. Период обнаружения миогенина в ядре совпадает с моментом терминальной дифференцировкой миоса-теллитов и синтезом белков контрактильного аппарата мышечного волокна (тяжелые цепи миозина, десмин) и дальнейшим образованием мышечных трубочек и юных мышечных волокон. Мыши, дефицитные по миогенину, умирают при рождении из-за дефицита дифференцировки миобластов и практически полного отсутствия мышечных волокон, что доказывает решающую роль данного фактора в миогенезе.
В нашем исследовании мы показали увеличение в результате трансплантации количества клеток с миогенин-позитивной цитоплазмой, что может быть связано с активацией процесса регенерации в мышечной ткани на фоне улучшения кровоснабжения в результате роста капиллярной сети, секреции факторов роста эндотелия, которые могут приводить к пролиферации и активации сателлитов.
Факт усиленной регенерации мышечной ткани подтверждает обнаружение клеток-сателлитов с миогенин-позитивным ядром, что является признаком поздней стадии дифференцировки миосателлитов. Как выявлено в нашем исследовании, данные клетки в дальнейшем сливаются с образованием многоядерных мышечных трубочек и формируют юные мышечные волокна с характерной для них морфологией.
Таким образом, в нашем исследовании мы подтвердили гипотезу об активации пролиферации и дифференцировки миосателлитов на фоне увеличения плотности капиллярной сети. Данные факты могут служить основой для нового направления в лечении заболеваний мышц — терапии, направленной на коррекцию микроокружения клеток-сателлитов. При этом возможна как прямая дифференцировка введенных ГСК в миосателлиты и зрелые мышечные волокна, так и стимуляция регенерации мышечных волокон реципиента под влиянием ростовых факторов, секретируемых ГСК.
Аутотрансплантация ГСК периферической крови приводит к улучшению васкуляризации ишемизированной конечности через стимуляцию развития микроциркуляторного русла. Указанные изменения происходят, по-видимому, за счет диффе-ренцировки трансплантированных ГСК в эндотелиоциты. Также нельзя исключить возможность продукции введенными ГСК ангиогенных факторов (кислый и щелочной факторы роста фибробластов aFGF и bFGF, эндотелиальный фактор роста сосудов VEGF, ангиопоэтин-1), стимулирующих рост капилляров.
В настоящее время имеется несколько методик клеточной терапии при ЗПА. Различие заключается прежде всего в источнике получения трансплантационного материала. Чаще всего используется костный мозг (КМ). Основным недостатком этого метода является инвазивная процедура — трепанация губчатой кости с возникающими рисками контаминации и анестезиологического пособия. Получаемый пунктат отличается
Таблица 1.
Результаты непараметрического корреляционного анализа
Переменные Коэффициент Спирмена р
К/М(3 ) vs (3мес) ГСК( б ) (абс. число в трансплантате) 0,524523 0,025434
ЛПИ,, . vs (3 мес) время восстановления г (3 мес) -0,51В615 0,009419
Лейкоцитарный индекс стимуляции(0 мес)* vs время восстановления (0 мес) -0,4В475В 0,030294
большой гетерогенностью клеточного материала, а его количество ограничено. Примененная нами технология стимуляции и мобилизации ГСК в периферическую кровь с последующей процедурой лейкафереза, несмотря на недостатки, связанные с некоторым удорожанием методики (в связи с необходимостью использования О-СвР), позволяет получить более однородный клеточный состав аутотрансплантата, причем в достаточно большом количестве. В исследованиях авторов, использующих в качестве источника трансплантационного материала КМ, количество имплантируемых мононуклеаров составляло не более 4,6х109 [4]. В нашем исследовании полученный при 3-часовом сеансе лейкафереза клеточный материал делился на две равные порции, одну из которых имплантировали (6,87х109±0,39х109 мононуклеаров, М±т), а другую подвергали криоконсервации. В последующем этот материал может быть использован для введения в гомо— или контралатеральную конечность. Кроме того, дальнейшее изучение клеточных технологий, а также появление правовой базы, делает возможным создание «банка стволовых клеток» не только для аутологичной, но и для аллотрансплантации.
Предполагается, что общее количество ГСК и их способность к дифференцировке снижается с возрастом [8]. В связи с этим возрастной предел для пациентов, включенных в исследование, составил 60 лет. Однако, нами не было выявлено корреляции между возрастом, процентным содержанием и абсолютным числом ГСК в трансплантате, что позволяет увеличить возрастной ценз при отборе пациентов.
Заключение
Аутотрансплантация ГСК периферической крови приводит к улучшению васкуляризации ишемизированной конечности путем стимуляции развития микроциркуляторного русла, вероятно, за счет прямой дифференцировки ГСК в эндотелиоциты, слияния этих клеток с эндотелиоцитами, а также стимуляции роста капилляров секретируемыми паракринными факторами.
Увеличение плотности капиллярной сети приводит к активации пролиферации и дифференцировки миосателлитов, их слиянию с образованием мышечных трубочек и юных мышечных волокон. Можно предположить, что введенные ГСК могут дифференцироваться в миосателлиты, нельзя исключить также их слияния со зрелыми поврежденными мышечными
волокнами реципиента или паракринного стимулирующего влияния. В совокупности неоангиогенез и происходящая на его фоне регенерация мышечных волокон с участием активированных миосателлитов приводят к улучшению клинических показателей.
Предложенная методика стимуляции ангиогенеза посредством имплантации ГСК, выделенных из периферической крови, является безопасной и эффективной для лечения дистальных форм заболеваний периферических артерий при хронической артериальной недостаточности II Б степени. Полученные результаты позволяют рекомендовать расширение показаний к ее применению за счет больных с критической ишемией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Савельев B.C., Кошкин В.М. Критическая ишемия нижних конечностей. М.: Медицина. 1997; 160 с.
2. Selvin E, Erlinger TP. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 2004; 10; 110 (6): 738-43.
3. Adam DJ, Beard JD, Cleveland T, et al. Bypass versus angioplasty in severe ischaemia of the leg (BASIL): multicentre, randomised controlled trial. Lancet. 2005; 366: 1925-1934.
4. Хорев Н.Г., Елыкомов В.А., Залозный Д.А. Терапевтический клеточный ангиогенез в лечении заболеваний периферических артерий. Ангиология и сосудистая хирургия. 2011; 17(2): 36-44.
5. Niels van Royen, PhD; Stephan H. Schirmer, Bektas Atasever at al. START Trial: A Pilot Study on STimulation of ARTeriogenesis Using Subcutaneous Application of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor as a New Treatment for Peripheral Vascular Disease. Circulation. 2005; 112: 1040-1046.
6. Gardner R. Stem cells and regenerative medicine: Principles, prospects and problems. C. R. Biol. 2007; 330: 465-473.
7. Mauro A. Satellite cells of skeletal muscle fibres. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961; 9: 493-495.
8. Поспелов А.Л. Способность гемопоэтических клеток костного мозга к ангиогенезу утрачивается с возрастом. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006; 3 (5): 11.
9. Rainier Aquino, Christopher Johnnides, Michel Makaroun, Jeffrey C. Whittle et al. Natural history of claudication: Long-term serial follow-up study of 1244 claudicants J Vasc Surg 2001; 34: 962-70.
