CC BY
40
yEQP + PQP + EQP + IQP пролиферативная активность клеток достоверно превышала пролиферативную активность в соответствующих культурах в контроле, и клеточный прирост составил, соответственно, 5,21 (2,5—12,73) и 4,17 [1,6-5,45), р<0,05).
Выводы. Культивирование ММСК в присутствии комбинации ростовых факторов, включающей как минимум VEGF и FGF, для индукции эндотелиальной диф-френцировки, приводит к статистически значимому увеличению экспрессии культурами эндотелиальных маркеров CD31 и CD34 и уменьшению экспрессии маркера ММСК CD90 по сравнению с другими способами культивирования. Культивирование в дифферен-цировочной среде, содержащей комбинацию четырех факторов роста VEGF, FGF, IGF и EGF, позволяет добиться оптимальных результатов с точки зрения клеточного прироста и индукции экспрессии эндотелиальных маркеров.
Г.С. Лобынцева 1, В.А. Шаблий а, М.Д. Кучма 1,
Д.В. Лобынцев 1
Программа криоконсервирования и морфофункциональная характеристика популяции клеток, выделенных из эмбриональной печени
1ООО «Институт клеточной терапии», Киев, Украина 2 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина
G.S. Lobyntseva, V.A. Shabliy, M.D. Kuchma, D.V. Lobyntsev A programme of cryoconservation and morphofunctional characterization of a cell population derived from an embryonic liver
Для разработки программы криоконсервирования гемопоэтических клеток эмбриональной печени использован метод многофакторных экспериментов 23, при выполнении которого варьировали следующие факторы: концентрацию криопротектора, скорость замораживания до температуры кристаллизации и длительность выдержки (адаптации) на этапе кристаллизации образца. Это позволило выявить закономерности взаимодействия параметров криоконсервирования и сформулировать гипотезу об устранении основных механизмов криоповреждения путем варьирования скоростями снижения температуры, концентрацией криопротектора, инициацией процесса кристаллизации и температурными остановками для изменения характера кристаллообразования в замораживаемом объекте. Функцией отклика служила сохранность клеток-предшественниц грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ).
Как показали результаты экспериментов, область исследованных режимов является оптимальной и позволяет получить сохранность КОЕ-ГМ от 50 до 90%. При устранении влияния неконтролируемых параметров максимальное количество колоний и кластеров (95—98%) после криоконсервирования образуют ге-мопоэтические клетки, замороженные с криопротектором ДМСО (0,4—0,7 моль/л), со скоростью охлаждения 0,5—1,5°С/мин., инициацией кристаллообразования и 10—минутной выдержкой при температуре адаптации — 5—10°С. Этот режим был проверен многократными экспериментами при замораживании кроветворных клеток эмбриональной печени.
В эмбриональной (плодной) печени 6—12-ти недельной гестации кроме кроветворных клеток-предшествен-ниц содержатся мезенхимальные и эндотелиальные клетки, гепатобласты. При длительном культивировании
на различных подложках и средах росли колонии стро-мальных клеток печени (гепатобластов, мезенхимальных и эндотелиальных клеток). Путем иммунофеноти-пирования было установлено, что при культивировании в бессывороточной среде вырастали колонии, состоящие из компактно собранных сферических клеток и гепатобластов. Также наблюдался рост компактных колоний, состоящих только из властных сферических клеток. При культивировании размороженной суспензии печеночных клеток в среде ДМЕМ с 15% фетальной бычьей сыворотки были получены монослой МСК и колонии звездчатых клеток печени. Также было исследовано наличие жизнеспособных эндотелиальных клеток в препарате криоконсервированной фетальной печени человека. При посеве клеток в среду с ростовыми факторами EGF, VEGF на коллагене вырастали колонии эндотелиальных клеток с последующим образованием монослоя.
Таким образом установлено, что разработанная программа позволяет сохранить все клетки-предшественницы, содержащиеся в эмбриональной и плодной печени ранних сроков гестации.
М.О. Мавликеев, А.В. Табанакова, А.А. Трондин,
Г.О. Певнев, Г.Р. Бурганова, И.М. Газизов,
М.С. Калигин, А.А. Гумерова, А.П. Киясов Иммуногистохимическое исследование мышечной ткани в норме и у пациентов с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей после аутотрансплантации стволовых клеток периферической крови
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия mikhail.mavlikeev@yahoo.com
М.О. Mavlikeev, A.V.Tabanakova, A.A.Trondin, G.O. Pevnev,
G.R. Burganova, I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, A.A. Gumerova,
A.P. Kiasov
Immunohistochemical analysis of normal skeletal muscles and after peripheral blood stem cells transplantation in patients with peripheral arterial disease
Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) характеризуются прогрессирующей ишемией тканей, устойчивой к традиционному хирургическому и консервативному лечению и ведущей к инвалидизации пациентов с высоким риском ампутации конечностей. Доклиническими исследованиями доказана высокая эффективность клеточной терапии ХОЗАНК. Целью нашего исследования было выявление морфологических изменений в мышечной ткани пациентов с ХОЗАНК до и после аутотрансплантации стволовых клеток периферической крови (СКПК) по сравнению с мышечной тканью здоровых людей. Исследование проведено в 2009—2010 гг. на базе Республиканской Клинической Больницы Минздрава Республики Татарстан и кафедры нормальной анатомии Казанского государственного медицинского университета в рамках Республиканской программы «Внедрение клеточной медицины в Республике Татарстан в 2008 году».
Материал и методы. В исследовании были использованы биопсии пациентов с ХОЗАНК и аутопсийный материал от лиц без хронической артериальной недостаточности нижних конечностей в качестве контроля. Тридцати пациентам с ХОЗАНК была произведена
внутримышечная аутотрансплантация СКПК, мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором. Парафиновые срезы аутопсийного материала и биоптатов икроножной мышцы пораженной конечности, полученных до начала клеточной терапии и через 3 мес. после трансплантации СКПК окрашивали иммуногистохимически с антителами к маркерам эндотелия (С031, С034, фактор фон Виллебрандта) и антителами к миогенину — маркеру активированных клеток-сателлитов. Далее производили морфометрический анализ образцов, подсчитывали число мышечных волокон и капилляров и определяли плотность капиллярной сети.
Результаты исследования. Результаты иммуногис-тохимического окрашивания показали рост плотности капиллярной сети на 25% (соотношение «число капилляров/число мышечных волокон» возрастает после аутотрансплантации с 1,6+0,15 до 2,0+0,12; р<0,001). Средняя плотность капиллярной сети мышечной ткани в аутопсийном материале составила +
от лиц без признаков хронической артериальной недостаточности нижних конечностей и в биоптатах мышечной ткани до введения стволовых клеток мы наблюдали единичные клетки-сателлиты с цитоплазматическим окрашиванием миогенина, через 3 мес. после аутотрансплантации СКПК их количество увеличивалось, появлялись клетки-сателлиты с мио-генин-позитивным ядром — признаком поздней стадии дифференцировки. Также мы наблюдали слияние клеток-сателлитов с образованием мышечных трубочек и новых мышечных волокон.
Количество капилляров на одно мышечное волокно
3 .
— —
Контроль До введения СК Через 3 мес. после
введения СК
* р < 0,001
Вывод: ХОЗАНК приводит к значительному снижению плотности капиллярной сети мышечной ткани, аутотрансплантация СКПК ведет к улучшению васку-ляризации ишемизированной конечности путем нео-ангиогенеза, а также активации миосателлитов и формированию новых мышечных волокон, что способствует восстановлению функции ишемизированной конечности. Аутотрансплантация СКПК является перспективным методом терапии ХОЗАНК.
В.Е. Мамонов, Н.В. Сац, И.Н. Шипунова,
А.Е. Бигильдеев, Д.А. Свинарева, Н.В. Проскурина,
М.М. Ряшенцев, А.Г. Чемис, Н.И. Дризе Роль мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из костного мозга в восстановлении больших костных дефектов
Учреждение Российской Академии медицинских наук Гематопогический Научный Центр РАМН,
Москва, Россия ndrize@yandex.ru
V.E. Mamonov, N.V. Sats, I.N. Shipounova, A.E. Bigildeev,
□.A. Svinareva, N.V. Proskurina, M.M. Riashentsev,
A.G. Chemis, N.I. Drize
Part of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in repair of big bone defects
Показано, что мультипотентные мезенхимные стро-мальные клетки (ММСК) способны дифференцироваться in vitro в клетки кости, хряща, жировой ткани. Для восстановления больших незаживающих дефектов кости используют носители из синтетических или натуральных биоматериалов. Комбинация ММСК с различными носителями может значительно улучшить восстановление больших костных повреждений. Целью данной работы было изучить дифференцировочный потенциал ММСК in vivo, а также эффективность регенерации кости с помощью биоматериала в комбинации с ММСК после трансплантации в место повреждения лучевой кости кролика.
Материал и методы. ММСК получали из костного мозга кроликов. Остеогенную дифференцировку ММСК индуцировали in vitro в течение 4 сут. (остео-ММСК). Одну десятую часть трансплантируемых ММСК транс-дуцировали с помощью концентрированного (108 вирусных частиц/мл) LeGO вектора третьего поколения, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (EGFP), и 1/10 часть остео-ММСК — с помощью LeGO вектора, кодирующего красный флуоресцентный белок (mCherry). В область повреждения (резекция 1 см лучевой кости) имплантировали аутогенные ММСК или ММСК в комбинации с остео-ММСК, губкой ИНДОСТ (POLYSTOM) и гранулами PRODENS® (WMT). За динамикой изменений в области резекции следили в течение 52 нед. Каждые 4 нед. проводили рентгенологические исследования поврежденных конечностей. Через 6, 12, 26^ 29 и 52 нед. новообразованные участки кости и окружающей соединительной ткани анализировали на наличие маркированных клеток методом ПЦР, морфологию изучали на гистологических срезах.
Результаты. В течение 7 мес. не наблюдалось никаких видимых изменений в регенерации повреждения у контрольных животных, в отсутствие клеток и носителей. Имплантация только губки ИНДОСТ (POLYSTOM) и гранул PRODENS® без ММСК также не приводит к образованию костной ткани в области резекции. После трансплантации остео-ММСК с носителями в области повреждения уже через 6 нед. наблюдался остеогенез, присутствие маркированных клеток было выявлено в новообразованной костной и соединительной тканях. Не было выявлено отличий в регенерации кости между ММСК и остео-ММСК через 12 нед. Маркированные клетки в новообразованной кости выявлялись в обоих случаях. Клетки, несущие зеленый белок, обнаруживались в фасции, хрящевой и костной тканях. К этому времени формируется костная мозоль, окружающая место дефекта. Через полгода
