CC BY
38
В1СНИК ВДНЗУ «УкраИнська медична стоматологгчна академЫ»
УДК 616-005.1-08
Черновол Н.П., Черновол П.А., Горохова В.С., Дел'ш В.Ю., Сулаева О.М. РЕАКЦ1Я ТРОМБОЦИТ1В НА АДФ - МОЖЛИВ1 ЧИННИКИ ТА КЛ1Н1ЧНЕ ЗНАЧЕННЯ 1НДИВ1ДУАЛЬНИХ РОЗБ1ЖНОСТЕЙ
Нацiональний медичний уыверситет iM. О. О. Богомольця Клiнiко-дiагностична лабораторiя, ФК «Металург» Запорiзький державний медичний унiверситет
У роботi був проведений аналiз АДФчндукованоУ агрегаци' тромбоцит'т серед 32 умовно здорових осб чоло&чо)' cmami в!ком eid 18 до 42 роюв. Встановлено широку вар'абельшсть реакци тромбо-цит'!в на АДФ у концентрацп, що викликае 50% агрега^ю при бимодальному характерi розпод'ту ознаки. Виявлено п'!ки агрегаци тромбоцит'т у д'апазон'! 30-50% i 60-80%. Анал'з агрегатограм дозволив встановити iнди&дуальнi розб1'жност1' амплтуди агрегаци, часу досягнення максимуму агрегаци, термiну виходу на плато. Також, у клькох випадках заф/'ксовано зворотнш характер агре-гац'Юно)' криво!', що в'дображае в'дсутн'ють фази стабШзацИ тромбогенеза, i можливо, обмеження дегрануляци тромбоцит'!в. Це обфунтовуе доц'тьшсть попередньо! оцнки агрегаци тромбоцит'т для передбачення ефективностi дегрануляци та секрецп бiологiчно активних молекул, що визна-чають морфогенетичний потен^ал багато'У на тромбоцити плазми. Кпючов1 слова: тромбоцити, агрега^я, багата тромбоцитами плазма.
Робота виконана в рамках НДР Науково-дослiдного шституту експериментальноТ i кпiнiчноT медицини НМУ iivi О.О. Богомольця «Вивчити меха^зми розвитку тканинних реакцЮ, ланки мiжклiтинноl взаемодП] особливостi регенеративних процеав за локального термiчного ушкодження при порушенн вуглеводного обмшу».
Вступ
Як вщомо, тромбоцити (Тц) не лпьки е кпю-човим компонентом системи гемостазу, але й регулюють процеси запалення та регенераци [2, 9]. Це визначае широке використання тромбоци-лв в якосл моделi для аналiзу механiзмiв пору-шення тромбогенеза. З шшого боку, аналiз фун-кцюнапьного стану тромбоцилв на сьогодн широко використовуеться для прогнозування пере-б^у та управпшня репаративними процесами [8, 16]. Останне лсно пов'язане з потужним морфо-генетичним потен^апом Тц, що обумовлене акумулюванням у Тц значноТ ктькосл факторiв росту, як стимулюють репаративш процеси при ушкодженш [1, 9]. Потужний морфогенетичний потен^ап Тц став активно застосовуватися в ре-генеративнш медицину прикладом чого е використання плазми або гелiв, багатих на Тц, в дерматологи, косметологи, стоматологи, травматологи, гастроентеропогп, хiрургiТ та шших гапу-зях медицини [1, 10, 15, 17]. Умовою реа^заци морфогенетичного потенщапу Тц е Тх актива^я i агрега^я, що супроводжуеться дегранупяцiею, вивiпьненням факторiв росту та iнших бiопогiчно активних речовин [2, 6, 7]. При цьому за межами доспщжень як правило залишаеться запитання, насктьки однородною е агрегацiйна активнiсть Тц, i чи завжди використання багатоТ на тромбоцити плазми (БТП) гарантуе реалiзацiю морфо-генетичних ефектiв Тц. Для вщповд на цi пи-тання було проведено дане шпотне доспiджен-ня.
Мета дослiдження
Анапiзi варiабельностi агрегацiТ Тц, яка спо-пучена i, по сутi, вiдбивае повноцшнють процесу дегрануляци та вивiпьнення тромбоцитарних морфогешв.
Об'ект i методи дослщження
У роботi проведена оцiнка доспiдження агрегаци Тц у 32 добровопь^в-чоповшв вiком вiд 18 до 42 рош. У доспiдження бупи залучен здоровi iндивiдууми. КритерiТ викпючення: захворювання серцево-судинноТ системи, печiнки, нирок, пато-погiя системи гемостазу, гос^ запапьнi захворювання, прийом пкарських препаратiв. Забiр кровi проводили вранц натще з пiктьовоТ вени з використанням системи забору венозноТ кровi S-Monovette, SARSTEDT (Нiмеччина). Отримання БТП i бщноТ' тромбоцитами плазми здшснювали стандартним методом [8] з використанням центрифуги Labofuge 200 (Ымеччина). Вимiрю-вання агрегаци Тц здшснювали спектрофотоме-тричним методом на агрегометрi РМ-2110 SOLAR (Респубпiка Бiпорусь). В якосл iндуктора агрегацiТ використовувапи АДФ (РЕНАМ, РФ) в кшцевш концентрацп 0,4 мкМ. Доспiдження агрегаци Тц проводили вiдповiдно до методики, ви-кладеноТ в шструкци до апарату [5]. При оцшц резупьталв агрегометрiТ враховувапи ступiнь i швидкють агрегаци, кiпькiсть Тц, час досягнення пку агрегацiТ. Статистичну обробку даних проводили в пакет MedCalc. Всi данi наведенi у ви-гпядi медiани (Ме) та Ытерквартильний iнтервап (1К1).
Результати дослiдження та 1х обговорення
Оцiнка параметрiв агрегаци Тц серед здорових оаб дозволила виявити ряд цкавих факлв. По-перше, незважаючи на те, що стушнь агрега-ц1Т Тц по вибiрцi був в рамках референтних зна-чень (табл.), характер розподту ознаки носив бiмодапьний характер (рис. 1) з шками в дiапа-зонi 30-50% i 60-80%. Параметри агрегаци Тц не запежапи вщ стал та вку обстежуваних, не бупи пов'язаш з кiпькiстю Тц в БТП. При цьому зафк-совано значний кореляцшний зв'язок мiж показ-
никами ступеня i швидкостi агрегацп (г=0,875; р=0,0013). По-друге, час досягнення пiку агрега-ц1Т також широко варiював, що було обумовлене наявнiстю в рядi випадкiв тривалого латентного перiоду i двофазного виходу на пiк агрегацп. Як правило, наявнiсть латентного перюду пов'язу-ють зi швидкiстю дегрануляци Тц i вивiльненням
вторинних ауто- i паракринних стимуляторiв агрегацп Тц з щiльних гранул. Виходячи з цього, можна припускати, що серед здорових оаб ю-нують широкi варiацil швидкостi та ефективност дегрануляцп при використаннi стандартних доз стимуляторiв агрегацп.
Таблиця
Показники агрегацц' Тц, ¡ндукованоГ АДФ, у здорових ос1б
Показники Ме 1К1 Мтмум Максимум
Ступшь агрегацп (%) 43,7 36,6 - 50,2 8,90 95,4
Швидкють агрегацп 52,8 47,1 - 60,1 19,0 114,8
Час (с) 179,0 73,0 - 262,4 24,0 417,0
Кiлькiсть Тц 252,1 236,6 - 262,8 173,8 354,5
&
■ч_и
>
20
15
10
0
□_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I
А
0 10 20 30 4) 50 60 70 Стугмнь агрегацП
90 100
Б
Рис. 1. Розподл показника ступеня агрегацп Тц, /ндуковано¡' АДФ (А), та його зв'язок з! швидюстю агрегацп у здорових волонтер1в (Б).
Третьою цкавою знахщкою була варiабель-нють форм агрегацшних кривих. Окрiм класич-них типiв агрегатограм, варiантами гiпо- i ппера-грегацп були зафiксованi варiанти зворотноТ агрегацп за умов використання стандартно!' кон-центрацп АДФ (рис. 2). Даний варiант, по сутi, вщображае порушення фази стаб^зацп тромбо-генеза, яка реалiзуeться шляхом активацп GPNЫNа, що забезпечуе зв'язок з фiбриногеном i формування «мостиш» мiж Тц в агрегат [3, 10]. Частково такий варiант може бути пов'язаний з молодим вком волонтерiв та наявнютю значних резервних можливостей щодо механiзмiв обме-ження тромбоутворення за рахунок активацп цАМФ- i eNOS-залежних механiзмiв негативно! регуляцп тромбогенеза [2, 4]. Однак, це припу-щення вимагае фактичного пiдтвердження в по-дальших дослiдженнях.
Виявленi нами серед здорових донорiв випа-дки варiацiй агрегацп Тц, шдуковано! АДФ, по суп, вщображають прояви i роль шдивщуально! реактивностi, моделлю реалiзацil якоТ в данiй
роботi були Тц. У цьому контекст окрiм суто теоретичного аналiзу причин i механiзмiв реалiза-ц1Т рiзних варiантiв вiдповiдi на стимулятори агрегацп, не менш важливою е i практична скла-дова - можливють i алгоритм оптимiзацiT використання БТП [9, 11]. Ефекти застосування БТП обумовлеш властивостями активованих Тц, як е ноаями численних регуляторiв регенерацiT рiз-номанiтних тканин через стимуляцш стовбуро-вих та прогешторних клiтин [10, 15]. У цитоплаз-мi Тц крiм мiтохондрiй, пероксисом i включень глiкогену знаходяться 3 види гранул: а-гранули, б-гранули та Л-гранули (лiзосоми) [2, 9, 11]. До складу а-гранул входить бтьше 30 рiзних бiлкiв, що мають широкий спектр бiологiчних ефектiв, включаючи: а) регуляцiю пролiферацiT; 2) моду-ляцiю адгезiT та хемотаксису; 3) участь у реал^ зацiT плазмовоТ ланки системи гемостазу; 4) ва-зоактивна дiя; 5) iмуннi та iншi ефекти [1, 10, 17]. Ц характеристики Тц призвели до широкого використання у регенеративна медицин та косметологи БТП [1, 11].
В1СНИК ВДНЗУ «Укрсанська. медична стоматологгчна академЫ»
¡Щ
« »
at ït
it
1t-
ît-ii-.1 - '
A
В
Г
Рис. 2. BapiaHmu агрегацЮних кривих при шдукцн Тц АДФ. А - BapiaHm нормальноÏ агрегац/йно)' BidnoBidi mpoM6o^miB на АДФ, Б - приклад гтерагрегацП] В - варант зворотноТ агрегацп'у BidnoBidb на АДФ, Г - слабка зворотна агрегация mpoмбoцumiв.
Провщними складовими останньоТ е численш фактори росту, в тому чи^ VEGF, що стимулюе ангюгенез, i PDGF - фактор росту тромбоцитар-ного походження, який забезпечуе репарацш судинноТ слнки i сполучноТ тканини, стимулюе пролiферацiю мiофiбробластiв грануляцшноТ тканини та гладких мюцитв у стiнцi судин, а та-кож пiдсилюе продукцiю глкозамшоглкашв, ко-лагену та iнших елеменлв сполучноТ тканини [2, 10, 17]. Активна секретя факторiв росту та ш-ших молекул, що входять до складу гранул Тц, починаеться протягом дектькох хвилин пюля активацп Тц i протягом години видтяеться бть-ше 90% вмiсту гранул Тц [13]. Осктьки мехашз-ми агрегаци та дегрануляцiT тiсно пов'язаш мiж собою через сигнальнi шляхи, зниження або пролонгування агрегацшно! вщповд передба-чае можливiсть порушення дегрануляцп та вивн льнення бiологiчно активних речовин з Тц. Бтьш того, концентра^я i навiть спектр стимуляторiв й iнгiбiторiв морфогенезу, якi вивтьняються з Тц,
залежить вщ дм Л1карських препаралв, природи стимулюючого агента, його концентраци' та активацп р1зних п1дтип1в рецептор1в [3, 12]. Так, сти-муляц1я тромбоцитв тромбшом через PAR-1 су-проводжуеться переважним зв1льненням VEGF, тод1 як д1я тромб1ну через PAR-4 викликае сек-рец1ю ендостатину, який мае протилежний ефект на ангюгенез [14].
Даш факти диктують необх1дн1сть поперед-ньоТ оц1нки агрегац1йних характеристик БТП перед ïï кл1н1чним застосуванням з метою стиму-ляцп' регенеративних процеав.
Висновки та перспективи подальших досль джень
У здорових осiб можливi рiзнi варiанти агре-гацiйноï вщпов^д Тц на АДФ, що в^зняеться за амплiтудою, швидкiстю, тривалiстю латентного перюду, повнотою агрегацiï. Попередня оцшка даних параметрiв може бути корисна для про-гнозування морфогенетичних ефеклв БТП.
А
Б
Лiтература
1. Ахмеров Р.Р. Регенеративная медицина на основе аутопогич-ной плазмы. Технология Plasmolifting / Р.Р. Ахмеров. - М. : ГЭОТАР-медиа, 2014. - Режим доступа http://plasmobook.ru/
2. Баринов Э.Ф. Молекулярные механизмы тромбогенеза / Э.Ф. Баринов, О.Н. Супаева // Кардиология. - 2012. - Т. 52 (12). -С. 45-56.
3. Баринов Э.Ф. Роль пуриновых рецепторов тромбоцитов в регуляции гемостаза / Э.Ф. Баринов, О.Н. Супаева // Клин. паб. диагностика. - 2012. - № 11. - С. 30-35.
4. Баринов Э.Ф. Пуриновые рецепторы и ассоциированные с ними сигнальные системы в регуляции функционирования тромбоцитов / Э.Ф. Баринов, О.Н. Супаева, T.A. Твердохпеб // Кардиология. - 2014. - Т. 54 (2). - С. 56-62.
5. Инструкция к реагенту АДФ http://www.renam.ru/dokumentaciya/ instrukcii/issledovanie-funkcii-trombocitov/instrukciya-po-ispolzovaniyu-adf-1mmol-l/view.
6. Anitua E. Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration / E. Anitua, I. Andia, B. Ardanza // Thromb. Haemost. - 2004. - Vol. 91. - Р. 4-15.
7. Arnoczky S. P. Platelet-rich plasma to augment connective tissue healing: making sense of it all / S. P. Arnoczky, O. Caballero, Y.N. Yeni // J. Am. Acad. Orthopaed. Surg. - 2010. - Vol. 18 (7). - Р. 445-448.
8. Barinov E. Platelet aggregation measurement for assessment of hemostasis failure mechanisms in patients with gastroduodenal ulcer bleeding / E. Barinov, O. Sulaieva, Y. Lyakch [et al.] // Clin. Exp. Gastroenterol. - 2013. - Vol. 6. - Р. 139-148.
9. Brass L. Understanding and Evaluating Platelet Function / L. Brass // Hematology. - 2010. - Vol. 10. - Р. 387-396.
Ре
РЕАКЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ НА АДФ - ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ РАЗЛИЧИЙ
Черновол Н.П., Черновол П.А., Горохова В.С., Делий В.Ю., Сулаева О.Н. Ключевые слова: тромбоциты, агрегация, богатая тромбоцитами плазма.
В работе был проведен анализ АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у 32 условно здоровых лиц мужского попа в возрасте от 18 до 42 пет. Выявлена широкая вариабельность реакции тромбоцитов на АДФ в концентрации, вызывающей 50% агрегацию, при бимодальном характере распределения признака. Пики агрегации тромбоцитов зарегистрированы в диапазоне 30-50% и 60-80%. Анализ агрегатограмм позволил установить индивидуальные различия амплитуды агрегации, времени достижения максимума агрегации, срока выхода на плато. Кроме того, в ряде случаев зафиксирована обратимая агрегация тромбоцитов, отражающая отсутствие фазы стабилизации тромбогенеза, и вероятно, нарушение дегранупяции тромбоцитов. Это обосновывает целесообразность предварительной оценки агрегации тромбоцитов для прогнозирования эффективности дегранупяции и секреции биологически активных молекул, определяющих морфогенетический потенциал богатой тромбоцитами плазмы.
Summary
PLATELETS REACTION TO ADP-POSSIBLE MECHANISMS AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF INDIVIDUAL DIVERSITY Chernovol N.P., Chernovol P.A., Gorokhova V.S., Delii V.Yu., Sulaieva O.N. Key words: platelets, aggregation, platelet-rich plasma.
ADP-induced platelet aggregation was measured and assessed in 32 healthy male individuals aged 18 -42. We found put wide variability of platelets response to ADP in a concentration causing 50% aggregation and bimodal distribution of variance. We also detected the peaks of platelet aggregation occurred within the range of 30-50% and 60-80%. The assessment of platelet aggregometry revealed individual differences of aggregation amplitude, time to reach a peak of aggregation and plateau. In addition, in several cases we recorded reversible aggregation curve, reflecting the lack thrombus stabilization phase. As stable aggregation is associated with activation and degranulation process, such variability of aggregation may reflect individual differences in granules secretion. This grounds the necessity for preliminary assessment of platelets aggregation to predict the effectiveness of degranulation and secretion of biologically active molecules which determine the morphogenetic potential of platelet rich plasma.
10. Compos R. Platelet-rich plasma in skin ulcer treatment / R. Compos, D.N. Parraza, A.F. Barandiaran // Wounds. - 2013. - Vol. 25 (9). - P. 256-262.
11. Eppley B. L. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing / B. L. Eppley, J. E. Woodell, J. Higgins // Plastic Reconstr. Surg. - 2004. - Vol. 114. - P. 1502-1508.
12. Etulain J. Platelet-mediated angiogenesis is independent of VEGF and fully inhibited by aspirin / J. Etulain, C. Fondevila, S. Negrotto [et al.] // Br. J. Pharmacol. - 2013. - Vol. 170 (2). - P. 255-265.
13. Jonnalagadda D. Platelet secretion is kinetically heterogeneous in an agonist-responsive manner / D. Jonnalagadda, L.T. Izu, S.W. Whiteheart // Blood. - 2012. - Vol. 120 (26). - P. 5209-5216.
14. Ma L. Proteinase-activated receptors 1 and 4 counter-regulate endostatin and VEGF release from human platelets / L. Ma, R. Perini, W. McKnight [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2005. - Vol. 102 (1). - P. 216-220.
15. Shani S. Platelet rich concentrate promotes early cellular proliferation and multiple lineage differentiation of human mesenchymal stromal cells in vitro / S. Shani, R.E. Ahmad, S.V. Naveen [et al.] // Sci. World. J. - 2014. - Vol. 2014. - P. 845293.
16. Sulaieva O. Relationship between leukocytes recruitment and risk of rebleeding in patients with peptic ulcers / O. Sulaieva, V. Deliy, S. Zharikov // Pathophysiology. - 2015. - Vol. 22 (4). - P. 175-182.
17. Xu F.T. Effect of activated autologous platelet-rich plasma on proliferation and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro / F.T. Xu, H.M. Li, Q.S. Yin // Am. J. Transl. Res. - 2015. - Vol. 7 (2). - P. 257-270.
!ферат
