CC BY
2
Профилактическая токсикология и гигиеническое нормирование
С Н. М. БЕЛЯЕВА. Г. А. МАТЧИН, 2002 УДК 614.7:616*006.04-02:615.277.4|-092.9
Н. М. Беляева, Г. А. Матчин
РАЗВИТИЕ ОПУХОЛЕЙ В ПОЧКАХ КРЫС ПРИ ПРЕРЫВИСТОМ ВВЕДЕНИИ МЕТИЛХОЛАНТРЕНА И НИТРОЗОДИМЕТИЛАМИНА
Оренбургская государственная медицинская академия
Одной из актуальных проблем современности является проблема взаимоотношения человека и среды его обитания. К неблагоприятным факторам внешней среды относят и химические канцерогенные вещества, пути воздействия которых на организм многообразны — через воздух, воду, продукты питания. По выражению Л. М. Шабада, "Проблема загрязнения нашей планеты канцерогенными веществами является частным случаем диалектики взаимоотношений человека и природы ..."
Общепризнано, что увеличение дозы канцерогена (до известного предела) сопровождается усилением канцерогенного эффекта. Обычно для индукции опухолей необходимо введение определенного количества канцерогенного вещества, которое зависит от вида применяемого канцерогена. Однако и малые дозы канцерогенных веществ сами по себе способны вызвать развитие злокачественных опухолей, хотя при этом значительно удлиняется латентный период и снижается частота их возникновения. Доказано, что при длительном введении канцерогена происходит сложение эффектов отдельных доз и теоретически безопасных доз канцерогенов не существует [4, 7, II, 15. 18, 20].
Главная же опасность действия канцерогенных веществ в малых дозах заключается не столько в непосредственной индукции опухолей, что встречается довольно редко, сколько в том, что под их влиянием в тканях возникают определенные изменения, которые в последующем могут быть усилены дополнительным действием как различных неканцерогенных, так и канцерогенных факторов, что в конечном итоге может привести к развитию опухолей.
Ряд авторов показали, что введение экспериментальным животным канцерогенов как одного вида, так и разных по механизму действия с перерывом во введении вызывало как увеличение числа развившихся опухолей, так и более быстрое их появление. Это явление было названо сенсибилизацией. Явление сенсибилизации с 1950 по 1970 г. изучали в лаборатории И. М. Неймана. В итоге было сформулировано следующее положение: "... во-первых, контакт ткани с канцерогенным агентом, даже весьма незначительный, не остается бесследным, так как
создает выраженное предрасположение к развитию опухоли, если организм в дальнейшем подвергается действию канцерогенного фактора; во-вторых, это предрасположение не ограничено местом сенсибилизации, а в какой-то мере распространяется на весь организм; в-треть-их, эта сенсибилизация сохраняется длительное время" [9]. Термин "сенсибилизация" подвергался критике и затем исчез из литературы, а феномен усиления бластомо-генного эффекта при разных модификациях эксперимента изучается. Введено понятие "фракционирование" [11], показано усиление бластомогенеза при воздействии канцерогенных веществ в разные периоды жизни организма — при антенатальной сенсибилизации и постна-тальном разрешающем воздействии канцерогена. В онкологическом эксперименте изучение проблемы доза-эффект требует учета многих показателей: суммарной и разовой доз канцерогена, общего времени его воздействия и интервала между воздействиями.
Целью настоящей работы было экспериментальное исследование канцерогенного эффекта в почках крыс 2 разных по механизму действия канцерогенных веществ при их прерывистом введении.
Опыты выполнены на 892 белых беспородных кры-сах-самцах массой 160—180 г. Длительность наблюдения составляла 8—10 мес. Опухоли почек в первой серии индуцировали введением метилхолантрена (МХ), во второй — нитрозодиметиламина (НДМА). Сенсибилизацию к МХ вызывали введением малой дозы этого вещества в почку с разрешающим воздействием в виде смазываний кожи раствором этого канцерогена. В почку вводили 1 мг МХ в стерильном подсолнечном масле. Доза МХ была выбрана на основании исследований |5], которые показали, что для индукции опухолей почек крыс необходимо введение 6—10 мг МХ. Мы рассчитывали, что доза 1 мг МХ должна быть недостаточной для индукции опухолей, но достаточной для сенсибилизации к повторному введению канцерогена. Все животные этой серии были разделены на 5 групп. Крысам 1-й группы вводили в почку 1 мг МХ (сенсибилизирующее воздействие), через 2 мес кожу межлопаточной области смазывали раствором этого же канцерогена (дополнительное, разрешающее воз-
Таблица I
Число опухолей при введении МХ
Время наблюдения (в мес от начала опыта)
через 6 мес через 10 мес
Группа животных число забитых животных число животных, подвергнутых пато-гистологическому исследованию число животных с предо-пухолевыми изменениями число забитых и павших животных число животных, подвергнутых патогисто-логическому исследованию число животных с опухолями в почках
1-я (сенсибилизированные с разрешающим
введением МХ на кожу) 30 7 6 40 28 14
2-я (сенсибилизированные без разрешающе-
го введения на кожу) 30 8 2 30 15 Нет
3-я (введение в почку подсолнечного масла
и воздействие на кожу МХ) 16 8 Нет 30 6
4-я (воздействие на кожу канцерогеном) 22 5 и 12 7 п
Таблица 2
Число опухолей в почках крыс при введении НДМА
Группа животных Число крыс в опыте Число крыс, доживших до сроков исследования Время появления первой опухоли, нед Число развившихся опухолей Число опухолей на 1 крысу % появления опухолей в почках
1-я (введение НДМА двумя курсами с перерывом 8 нед) 180 119 17 S1 0,73 ± 0,04* 68
2-я (1 курс НДМА) 145 111 25 42 0,31 ± 0,096 37,8
3-я (введение НДМА двумя курсами без перерыва) 210 99 25 46 0,51 ± 0.05* 46,4
4-я (интактные) 147
Всего животных 682 329 169
Примечание. Звездочка — достоверно по сравнению с показателями 2-й группы.
действие). Крысам 2-й группы вводили только сенсибилизирующую дозу МХ в почку без последующего смазывания кожи. Крысам 3-й группы вводили в почку 0,1 мл растворителя МХ — подсолнечного масла, через 2 мес кожу межлопаточной области у этих животных смазывали раствором канцерогена. Крысам 4-й группы проводили только смазывание кожи раствором канцерогена. Смазывание кожи межлопаточной области крыс 1-й, 3-й и 4-й групп проводили по одинаковой схеме 0,5% бензольным раствором МХ 2 раза в неделю в течение 16 нед. В 5-й группе были интактные, здоровые животные. Па-тогистологическому и биохимическому исследованию почки крыс подвергали через 6 и 10 мес после начала опыта. Результаты этой серии представлены в табл. 1.
Как показали результаты опытов, через 6 мес после начала опыта у 6 из 7 животных 1-й группы в почках наблюдались выраженные предопухолевые изменения в виде обширных овально-клеточных пролифератов и наличия участков кистозно-расширенных почечных канальцев. У животных 2-й группы в этот период предопухолевые изменения имели место лишь в 2 случаях. В более поздние сроки, через 10 мес после начала опыта, опухоли в почках найдены лишь в 1-й группе: из 40 оставшихся в живых крыс опухоли найдены у 14. В основном это были полиморфно-клеточные саркомы. В опухолевых клетках в большом количестве были видны фигуры митоза, часто атипичные митозы. У крыс 2-й группы ни в одном случае опухолей в почках не найдено, у 6 из 15 животных, подвергнутых патогистологическому исследованию, найдены предопухолевые изменения в виде овально-клеточных пролифератов и кистозно-расширенных канальцев. Почки крыс 3-й группы имели обычное строение, встречались лишь небольшие склеротические изменения на месте инъекции подсолнечного масла.
Таким образом, предварительное воздействие МХ (введение в почку в небольшой дозе, недостаточной в изучаемый период для индукции опухолей почки) с последующими аппликациями этого вещества на кожу привело к усилению бластомогенного эффекта, что выражалось как в раннем появлении предопухолевых изменений, так и в более частом развитии опухолей в месте первичного введения МХ (в почке).
Анализ полученных результатов в первой серии затруднялся тем, что большинство опухолей, развившихся в почках крыс под действием МХ, было саркомами, поэтому вторую серию опытов провели с использованием НДМА. Нитрозамины, как известно, имеют техническое применение в различных сферах производства, об этом известно с самого начала их изучения (при вулканизации резины, в текстильном производстве и др.). Канцерогенные свойства нитрозосоединений доказаны для 40 видов животных, нитрозамины относятся к наиболее сильнодействующим канцерогенам окружающей среды [2—4, 13, 14]. Особый интерес представляет то, что фракционирование дозы НДМА изменяет его органотропность: введение рег 05 высоких разовых доз приводит к разви-
тию опухолей почек, тогда как малые дозы при длительном введении вызывают опухоли печени. Трудно объясним факт отсутствия опухолей печени при коротком курсе введения НДМА, хотя уровень алкилирования ДНК и особенно уровень образования 06-метилгуанина в печени значительно выше, чем в почках.
Согласно данным литературы, необходимым условием индукции опухолей почек под действием НДМА является введение канцерогена в большой разовой дозе — от 5 до 10 мг на 1 кг массы животного, оптимальной дозой для развития опухолей в почках является доза, составляющая 150—200 мг/кг массы животного [1, 16, 17, 19]. По данным работы [17|, доза НДМА, равная 50 мг/кг массы, вызывает появление опухолей в почках у 50% животных. Исходя из перечисленных данных, мы выбрали суммарную дозу НДМА, равную 60 мг/кг массы. НДМА растворяли в питьевой воде непосредственно перед введением таким образом, чтобы разовая доза его, равная 6 мг/кг, содержалась в 1 мл воды |6]. Водный раствор канцерогена вводили в пищевод с помощью металлического зонда ежедневно. Все животные этой серии были разделены на 4 группы, из которых 3 были опытными, в 4-й группе находились интактные животные. Всех подопытных животных "сенсибилизировали" 5-дневным курсом введения НДМА. Затем крысам 1-й и 3-й групп проводили второй курс, "разрешающее" воздействие канцерогена. Различие между 1-й и 3-й группами животных заключалось в том, что в 1-й группе "разрешающее" введение НДМА проводили через 8 нед после "сенсибилизирующего", а в 3-й группе — непосредственно вслед за первичным. Крысам 2-й группы дополнительно канцероген не вводили. Таким образом, в 1-й и 3-й группах животных доза введенного НДМА была одинаковой и составляла 60 мг/кг. Однако в 1-й группе животных эту дозу вводили дробно в 2 приема с 8-недельным перерывом, тогда как в 3-й группе канцероген вводили одним курсом без перерыва.
В период введения НДМА в результате его токсического действия крысы резко теряли в массе (на 30—40%), при этом часть животных погибали. При вскрытии погибших животных находили кровоизлияния в печени и почках. При микроскопическом исследовании найдены обширные центролобулярные некрозы. В течение еще 2 нед после окончания введения канцерогена часть животных погибали от вторичной легочной инфекции и интоксикации. Число животных, погибших от этих причин, было наибольшим в 3-й группе, т. е. перерыв во введении НДМА не изменил органотропность, но снизил токсичность.
Результаты исследования по прерывистому введению НДМА представлены в табл. 2.
Первая опухоль в 1-й группе была найдена на 17-й неделе опыта, тогда как во 2-й и 3-й группах — через 25 нед. К концу опыта (через 8 мес) наибольшее число опухолей также было в 1-й группе. Так, из 119 крыс этой группы, оставшихся в живых после окончания введения НДМА, опухоли в почках развились у 81 (68%). Наи-
меньшим число опухолей было во 2-й группе: из 111 крыс опухоли найдены лишь у 42 (37,8%). Из 99 крыс 3-й группы опухоли в почках обнаружены у 46. Опухоли в почках были двух видов: эпителиальные и мезенхималь-ные [12]. Эпителиальные опухоли были в виде одного или нескольких узлов, расположенных в толще почек, иногда опухолевые узлы достигали 3—4 см в диаметре, по гистологическому строению они представляли собой аденокарциномы различной степени зрелости. Анапла-стические опухоли достигали 8 см в диаметре. Часто опухоли определялись в обеих почках, нередко имели место одновременно несколько опухолевых узлов. Поэтому проведен анализ не только количества опухолей, но и площади опухолевых узлов. Анализ площади опухолевых узлов проводили с помощью проекции гистологического препарата на лист бумаги (х 20). Площадь проекции всего среза почек и опухолевых узлов измеряли сантиметровой сеткой, разделенной на миллиметры, учитывали узлы диаметром не менее 0,5 мм. Количество пролифе-ратов было значительно меньше во 2-й группе, чем в 1-й и 3-й, т. е. меньшая доза привела к меньшему числу опухолей. Особый интерес представляет различие в количестве опухолей между крысами 1-й и 3-й групп, которые получили одну и ту же дозу НДМА, но с перерывом 8 нед. У этих животных различалась выраженность опухолевого процесса, что выражалось как во времени появления первой опухоли (на 8 нед раньше), так и в большем количестве пролифератов на 1 крысу.
Таким образом, хотя доза НДМА, выбранная нами на основании данных литературы, оказалась достаточно эффективной для самостоятельной индукции опухолей у животных 2-й группы, количество опухолей в почках крыс было значительно меньше, чем в 1-й группе. Эффект введения в организм НДМА в сенсибилизирующей и разрешающей дозе с перерывом не был результатом простой суммации доз, так как во 2-й группе животных, несмотря на воздействие канцерогена в той же дозе, но без перерыва, количество развившихся опухолей было меньше, а время до появления первой опухоли — больше. Итак, одна и та же канцерогенная доза, разделенная во времени, оказалась более канцерогенной. По выражению И. М. Неймана, "Время как бы заменяет дозу" [9].
Вопрос о дозе канцерогена постоянно обсуждается. Так, в работе [14) различают следующие виды доз. Суперканцерогенные или токсические дозы, например ДМБА, которые вызывают значительную смертность животных в сравнительно ранние сроки, а число животных с опухолями не превышает 30—40%. Оптимальными канцерогенными дозами следует считать те, которые вызывают 100% опухолей. Субканцерогенные дозы — это те, которые вызывают лишь такое число опухолей, которое несколько отличается от количества спонтанных и находится на границе статистической значимости. Субканцерогенные дозы опасны тем, что меняют и, возможно, надолго реакцию ткани на последующие канцерогенные воздействия. Наконец, в рамках данного опыта и определенной экспериментальной модели можно показать наличие и неканцерогенных доз.
Что касается механизма найденных нами соотношений суммарной дозы НДМА и перерыва в его введении, то можно предположить, что использованная нами доза НДМА является субканцерогенной, поскольку приводит к развитию опухолей в почках у 30% животных 2-й группы, она изменяет функционирование генома и включает комплекс адаптивных реакций клеток, в том числе реакцию гена MDR1 [8, 10]. Ген MDR1 принято считать геном "стресса", который отвечает за синтез белка Р-гли-копротеина. Р-гликопротеин обеспечивает адаптивные реакции клетки на токсические внешние воздействия и
функционирует как мембранная "помпа" для выброса из клетки токсичных веществ, в том числе и канцерогенных, и на этом фоне повторное введение канцерогена приводит к усилению бластомогенного эффекта.
Литература
1. Бенеманекий В. В., Литвинов Н. Н. // Вопр. онкол. — 1969. - Т. 15, № 9. - С. 59-64.
2. Боговский П. А.. Веттинг К. // Гиг. и сан. — 1988. — № 4. - С. 58-63.
3. БыкорезА. И., Рубенчик Б. Л., Слепян Э. И. Экология и рак. — Киев, 1985.
4. Друкрей Г. // Механизмы канцерогенеза. — М., 1961.
- С. 143-171.
5. Коган А. X., Михина 3. П. // Вопр. онкол. — 1969. — Т. 15, № 9. - С. 69-71.
6. Кожевникова Е. П., Цинберг Е. Д., Беляева Н. М. и др. // Там же. - 1984. - Т. 30, № 4. - С. 60-65.
7. Литвинов Н. Н. // Гиг. и сан. - 1987. - № 7. — С. 50-53.
8. Лихтенштейн А. В., Шапот В. С. // Пат. физиол. — 1998. - № 3. - С. 25-44.
9. Нейман И. М. // Вопр. онкол. - 1965. - Т. 11, № 7.
- С. 63-87.
10. Окулов В. Б., Зубова С. Г. // Там же. - 2000. - Т. 46, № 5. - С. 505-511.
11. Турусов В. С. // Экспер. онкол. — 1984. - Т. 6, № 3.
- С. 15-20.
12. Фель В. Я., Швембергер И. И. Морфологическое и иммунологическое изучение цитодифферениировки экспериментальных опухолей. — Л., 1963.
13. Худолей В. В. Канцерогены: характеристика, закономерности, механизмы действия. — СПб, 1999.
14. Шабад Л. М. Методы определения и изучения бла-стомогенных химических веществ. — М., 1970.
15. Шабад Л. М. О циркуляции канцерогенов в окружающей среде. — М., 1979.
16. Швембергер И. Н. // Вопр. онкол. — 1965. — Т. 11, № 1. - С. 34-39.
17. Швембергер И. Н. // Там же. - 1967. - Т. 13, № 1. -С. 97-105.
18. Druckrey Н. Ц Berlin Heidelberg. - New York, 1967.
- P. 60-78.
19. Hadjilow D. // Z. Krebsforch. - 1968. - Bd 91, N 1.
- S. 59-62.
20. РоеI W. E. // J. Natl. Cancer Inst. - 1960. - Vol. 25.
- P. 1265-1277.
Поступила 21.12.01
Summary. Experiments on 892 non-inbred male rats studied the development of renal tumors in the animals intermittently administered two substances different in the mechanism of carcinogenic action. Renal pre-injection of melhylcholan-therene (MC) in a small dose insufficient to induce renal tumors in the study period, followed by dermal applications of this agent was shown to enhance a blastomogenic effect, as manifested by both early occurrence of precarcinogenic changes and early development of renal tumors at the site of primary injection of MC into the kidney. The effect of ni-trosodimethylamine (NDMA) intermittently injected in a ne-phrotropic dose was studied in the second series of the experiments. The intermittent injection of NDMA in courses during 8 weeks gave rise to renal tumors in the early period, caused increases in the number of tumors and in the area of renal tumor proliferates. The mechanism of enhanced renal blastomogenesis is discussed in terms of the mechanisms responsible for initiation and progression.
