РАЗРАБОТКА ПЦР-ПДРФ ТАБЛИЦ НА ОСНОВЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА EF1A ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ ТЛЕЙ - ВРЕДИТЕЛЕЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 577.212.3:595.753

Н.В. Воронова, В.И. Головенчик

РАЗРАБОТКА ПЦР-ПДРФ ТАБЛИЦ НА ОСНОВЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА ЕПа ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ ТЛЕЙ - ВРЕДИТЕЛЕЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

Белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр-т Независимости, 4

Введение

Тли - вредители сельскохозяйственных культур и других возделываемых растений - относятся к числу фитофагов, требующих постоянного мониторинга численности и видового состава. В фауне тлей встречаются виды и близкие формы, сходные в морфологическом отношении, но значительно различающиеся вредоносностью [1], устойчивостью [2, 3], способностью к трансмиссии фитопатогенных вирусов [4], а также специализацией к конкретным кормовым растениям. В последние годы, с развитием методов ДНК-таксономии, происходит дробление многих ранее описанных видов на комплексы морфологически идентичных видов или подвидов, в соответствии с особенностями их биологии и экологии [5, 6]. При этом вклад каждой из таких форм в суммарный пресс, оказываемый комплексом видов на их кормовые растения, как правило, невозможно установить. Контроль распространения таких форм, а также проникновения на территорию Республики Беларусь чужеродных и, в особенности, карантинных видов вредителей является одной из приоритетных задач современной сельскохозяйственной энтомологии.

Идентификация карантинных, инвазивных и высоко вредоносных видов тлей в природных сообществах вредителей представляет собой проблему, которая в ряде случаев не может быть решена без применения ДНК-технологий [7]. Как было сказано выше, морфологическая идентификация многих близких видов тлей невозможна (криптические виды) или затруднена (сиблинговые виды). В то же время, генетически гомогенные виды тлей зачастую демонстрируют высокую морфологическую пластичность при питании на разных кормовых растениях, что многократно подтверждалось в полевых исследованиях [8]

и в экспериментах [9-11]. Инвазивные виды на новых территориях могут осваивать нетипичные для них кормовые растения. В некоторых случаях происходят и закрепляются на уровне региональных популяций изменения в биологическом цикле [12]. Это также вносит дополнительную сложность в идентификацию видов у тлей. ДНК-технологии, в этом смысле, предоставляют исследователю удобный методологический инструментарий, позволяющий с высокой точностью установить видовую принадлежность не только имаго, но и личинок, а также яиц тлей.

Для видовой идентификации беспозвоночных и, в том числе, насекомых-фитофагов, чаще всего применяется метод, названный «ДНК-штрихкодирование», то есть определение видов по нуклеотидной последовательности маркерной области митохондриального генома [13]. Единственное неудобство данного метода заключается в обязательном проведении секвенирования ДНК - процедуры относительно трудоемкой и дорогостоящей, которая крайне редко может быть проведена «на местах» и требует отсылки образцов в крупные научные центры, оснащенные соответствующим оборудованием. В связи с этим актуальным представлялось предложить метод идентификации видов тлей, позволяющий разграничить вредоносные и не вредящие сельскохозяйственным и другим возделываемым растениям виды без проведения процедуры секвенирования ДНК. Подобным методом, по нашему мнению, может стать идентификация видов по ключам, разработанным на основе межвидового полиморфизма длин ре-стрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Суть метода ПЦР-ПДРФ-идентификации заключается в создании видовых идентификационных таблиц, включающих сведения о количестве и длинах ДНК-фрагментов,

образующихся в результате обработки продукта ПЦР указанными рестриктазами. При этом возможно создание ключа, представляющего собой уникальную комбинацию конкретных ферментов рестрикции, позволяющих уверенно дифференцировать близкие виды вредителей по количеству и длине образующихся рестрикционных фрагментов [14].

Впервые создание идентификационных ключей на основе ПДРФ для определения видов тлей было предложено австралийскими исследователями в 2007 г. [15]. В их работе для создания ключей была использована последовательность митохондриального гена COI. Однако применение этого гена имеет ограничения, связанные с высокой консервативностью последовательности COI у тлей. Это позволило нам предположить, что использование в качестве целевого ядерного гена, обладающего известной и стабильной экзон-интронной структурой, позволит выбрать и предложить две группы рестрикционных ферментов с локализацией сайтов узнавания в консервативных (экзоны) и вариабельных (интроны) областях для идентификации менее и более близких видов соответственно. Ген

субъединицы а фактора элонгации 1 (EF1a) тлей, как было показано ранее [16], отвечает названным требованиям. Это ядерный ген, обладающий у тлей чрезвычайно консервативной интрон-экзонной структурой. Экзоны гена EF1a тлей не варьируют по длине и обладают сравнительно консервативной нуклеотидной последовательностью. В то же время интроны достаточно вариабельны, причем варьируют между видами тлей как по длине, так и по ну-клеотидному составу.

Таким образом, целью данной работы было изучить возможность создания ПЦР-ПДРФ-таблиц на основе последовательности гена EF1a, а именно, построить рестрикционные карты гена и предложить набор рестрикци-онных ферментов, позволяющих дифференцировать виды тлей - вредителей сельскохозяйственных культур и виды тех же родов, не вредящие возделываемым растениям.

Материалы и методы

В работе были использованы последовательности гена EF1a 26 видов тлей европейской фауны, встречающиеся, в том числе, в Беларуси (табл. 1).

Таблица 1

Виды тлей, включенные в анализ

Вид Ареал Повреждаемые растения Код последовательности в GenBank

Acyrt-hosiphon kondoi Shinji, 1938 Космополит Люцерна посевная, Астрагал альпийский, Клевер луговой FJ982417.1

Acyrthosiphon pisum Harris, 1776 Космополит Горох, бобы, кормовые травы семейства Бобовые (полифаг) NW 003383839.1

Aphis craccivora Koch, 1854 Космополит Тыквы, кабачки, огурцы, картофель, бобы (полифаг) EU358905.1

Aphis epilobiaria Theobald, 1927 Западная палеарктика, Ближний восток Растения рода Кипрей DQ418868.1

Aphis fаbae spp. Scopoli, 1763 Космополит Огурцы, кабачки, картофель, капуста, бобы (полифаг) JF950583.1

Aphis farinosa Gmelin, 1790 Космополит Ивы AY219726.1

Aphis hederae Kaltenbach, 1843 Космополит Плющ обыкновенный, Повилика европейская EU358913.1

Aphis idaei Van der Goot, 1912 Космополит Малина, костяника, Ежевика сизая JF950580.1

Aphis nerii, Boyer de Fonscolonbe, 1841 Космополит Растения из семейств Кутровые, Ластовневые EU358920.1

Aphis pomi de Geer, 1773 Космополит Яблони, груша, ирга JF950582.1

Aphis ruborum Borner and Schilder, 1931 Космополит Земляника, малина, Ежевика сизая, Ежевика кустистая JF950581.1

Продолжение табл. 1

Вид Ареал Повреждаемые растения Код последовательности в GenBank

Aphis salicariae Koch, 1855 Космополит Растения рода Кизил и Кипрей DQ418863.1

Aphis spiraecola, Patch, 1914 Космополит Яблони, сливы, груша, капуста, горох, бобы, картофель (полифаг) EU358925.1

Macrosiphum albifrons Essig, 1911 Космополит Растения рода Люпин DQ005154.1

Macrosiphum euphorbiae Thomas, 1878 Космополит Картофель, горох, кукуруза (полифаг) HM117788.1

Macrosiphum rosae Mordvilko, 1919 Космополит Растения семейства Розовые AY219736.1

Megoura lespedezae Essig and Kuwana, 1918 Палеарктика, Дальний восток Аморфа кустарниковая, Леспедеца двуцветная, Копеечник EU071357.1

Megoura litoralis F.P.Muller, 1952 Западная палеарктика Чина японская EU071352.1

Megoura viciae Buckton, 1876 Космополит Растения родов Чина и Горошек (полифаг) EU071353.1

Myzus persicae Sulzer, 1776 Космополит Огурцы, слива, картофель, кукуруза (полифаг) EF419312.1

Myzus varians Davidson, 1912 Космополит Сливы, яблони FJ982429.1

Rhopalosiphum maidis Fitch, 1856 Космополит Кукуруза, рожь, пшеница, просо, др. злаки AY219718.1

Rhopalosiphum nymphaeae Linnaeus, 1761 Космополит Яблони, груши, картофель, кукуруза (полифаг) EU358935.1

Rhopalosiphum padi Linnaeus, 1758 Космополит Кукуруза, картофель, пшеница, яблони, груши (полифаг) AY219719.1

Schizaphis graminum Rondani,(1847), 1852 Космополит Пшеница, рожь, ячмень, кукуруза AY219720.1

Schizaphis scirpi Passerini, 1874 Космополит Растения из рода Рогоз, Камыш, Осока EU358939.1

Последовательности гена EF1a тлей, коллек-тированных в Беларуси, были получены авторами и опубликованы ранее [16-18]. Кроме этого в работе были задействованы последовательности гена EF1a, депонированные другими исследователями в GenBank NCBI [19], за что авторы заочно выражают им искреннюю благодарность.

Анализируемый участок гена соответствовал фрагменту с 259 по 1360 нуклеотид полного гена (215-1103 нуклеотид белок-кодирующей области) и включал частично второй, третий, четвертый и частично пятый экзоны, а также лежащие между ними интроны.

Поиск сайтов рестрикции был проведен в программе BioEdit 7.2.1 [20] для ферментов, производимых компаниями Thermo Scientific и Fermentai Internati, как наиболее доступных на белорусском рынке химических реактивов.

Графические рестрикционные карты строили в программе CodonCode Aligner 4.2.7. При построении рестрикционных карт учитывались ферменты, имеющие в последовательности EF1a тлей не более двух сайтов рестрикции, как с длинными, так и с короткими сайтами узнавания, поскольку было решено, что образование в результате рестрикции большого числа коротких фрагментов может затруднять интерпретацию получаемых результатов.

В дальнейшем из анализа были исключены рестриктазы, сайты узнавания которых локализовались близко к экзон-интронной границе. Это позволило четко разграничить ферменты с сайтами узнавания в интронах и экзонах гена, с тем, чтобы исключить возможность непредвиденного столкновения со случаями внутривидового полиморфизма. Отдельно были оценены рестриктазы, отрезающие фрагменты

длиной менее 80 пар нуклеотидов, что связано с низкой возможностью для точного определения длины коротких фрагментов в агарозном геле в условиях рутинного эксперимента [5].

Результаты и обсуждение

Поиск сайтов рестрикции в последовательностях EF1a 26 видов тлей показал, что большинство проанализированных рестриктаз имели сайты рестрикции в идентичных позициях гена у разных видов тлей, что связано с общей высокой консервативностью белок-кодирующей области гена в этой таксономической группе. Как было показано ранее, межвидовая вариабельность последовательности EF1a у тлей в основном связана с появлением единичных однонуклеотидных замен в третьих позициях кодонов [16]. Данный уровень полиморфизма в большинстве случаев не обеспечивает вариабельности локализации сайтов рестрикции, достаточной для разграничения не только близких видов, но и видов относящихся к разным родам и трибам. Значительная доля рестриктаз, в особенности имеющих короткие или вырожденные сайты узнавания, имела четыре и более сайта рестрикции на указанном участке гена (табл. 2), причем эти сайты могли локализоваться как в интронах, так и в экзонах.

В последовательностях тлей разных родов одни и те же ферменты рестрикции могли вести себя как мелкощепящие или крупно-

щепящие. Например, широко применяемая мелкощепящая рестриктаза HpaII не имела или имела единственный сайт узнавания в последовательностях тлей родов Acyrthosiphon, Aphis, Macrosiphum, Rhopalosiphum и, в то же время, обнаруживала 4 сайта узнавания в последовательностях тлей родов Sitobion и Uro-leucon.

В общей сложности 118 эндонуклеаз отвечали заданным требованиям и имели не более 2 сайтов узнавания в изучаемых последовательностях тлей одного рода. После соотнесения локализации сайтов узнавания и рестрикции этих ферментов с интрон-экзонной структурой гена EF1a тлей были окончательно отобраны 38 рестриктаз (табл. 3).

Все отобранные ферменты имели сайты узнавания-рестрикции в экзонах либо в экзонах и интроне на некотором удалении от ин-трон-экзонной границы (не менее 20 нуклеотидов). Рестриктазы с сайтами узнавания внутри интронов имели длинную (6 нуклеотидов) невырожденную (за исключением BfmI) последовательность узнавания. Данный факт позволил нам предположить, что случаи внутривидовой вариабельности нуклеотидной последовательности гена EF1a у тлей, в частности, вариабельность последовательности интронов, окажут минимальное влияние на результативность применения предлагаемых ПДРФ-ключей.

Фермент Сайт узнавания Количество сайтов узнавания* Фермент Сайт узнавания Количество сайтов узнавания*

AluI AG'CT 7 HpyCH4V TG'CA 5

ApoI r'AATT_y 5 HpyCH4IV A'CG T 6

BsaJI C'CnnG G 7 HpyF10VI GCn nnnnn'nGC 4

BslI CCnn_nnn'nnGG 4 MaeIII 'GTnAC_ 4

BsmAI GTCTCn'nnnn_ 5 MseI T'TA_A 9

BsrI ACTG_Gn' 6 MwoI GCnn_nnn'nnGC 4

BstF5I GGATG_nn' 4 NciI CC's_GG 5

BstNI CC'w_GG 6 NlaIII _CATG' 4

Csp6I G'TA_C 4 PspGI 'CCwGG_ 6

CviJI rG'Cy 13 RsaI GT'AC 4

FatI 'CATG_ 4 ScrFI CC'n_GG 7

HphI GGTGAnnnnnnn_n' 6 StyD4I 'CCnGG_ 10

HpaII C'CG_G 4 TaiI _ACGT' 6

Таблица 2

Эндонуклеазы рестрикции, имеющие четыре и более сайта узнавания в последовательностях Е¥1и тлей

Продолжение табл. 2

Фермент Сайт узнавания Количество сайтов узнавания* Фермент Сайт узнавания Количество сайтов узнавания*

Нру81 GTn'nAC 5 TaqI Т'Ш А 4

Нру188Ш ТС'пп GA 5 Tsp509I 'ААТТ 15

НруСН4Ш АС^Т 4 TspRI _nnCAsTGnn' 4

* - приведено максимально наблюдаемое количество сайтов рестрикции конкретного фермента в последовательностях EF1a тлей исследованных видов

Таблица 3

Локализация в последовательностях Е¥1а тлей сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, использованных для разработки ПЦР-ПДРФ-ключей

Экзоны Интроны

Фермент* Сайт узнавания Фермент* Сайт узнавания

BauI (BssSI) CACGAG AanI (Рву^ ТТА'ТАА

BseDI (ВваЛ) см. табл. 2 BfmI (SfcI) C'TryAG

BseLI (Вв11) см. табл. 2 DraI ТТТ'ААА

BseSI (Вте1581) GkGCmC SspI ААТ'АТТ

ВвЫ2361 (BstUI) Ш'Ш LguI (SapI) GCTCTTC

Вв1Х1 CCAnnnnnnTGG VspI (AseI) АТ'ТААТ

BsuRI (НаеШ) GG'CC - -

Свр61 (CviQI) См. табл. 2 - -

DpnI GA'TC - -

Есо1301 (StyI) C'CwwGG - -

Eco81I (Вви361) CC'TnAGG - -

EcoRI G'AATTC - -

FspBI (BfaI) C'TAG - -

ШпП (BsaHI) Gr'CGyC - -

HindШ A'AGCTT Экзоны и интроны

НраИ C'CGG Фермент* Сайт узнавания

HphI GGTGA НМ (НшРП) ^ШС

HpyF3I (Ddel) C'TnAG HhaI GCG'C

KpnI GGTAC'C Mph1103I (№П) ATGCA'T

MboI 'GATC TaqI См. табл. 2

MspI (Нра!) C'CGG - -

PaeI (SphI) GCATG'C - -

RsaI см. табл. 2 - -

SsiI (АсП) С'С GC - -

TaaI (НруСН4Ш) ACn'GT - -

ТгаП Т'ТАА - -

XbaI T'CTAG_A - -

XapI (ApoI) См. табл. 2 - -

* - в таблице приведены дополнительные варианты названий ферментов, что связано с различной кодировкой названий изошизомеров в используемых в данной работе компьютерных программах для рестрикционного анализа

Сравнительный анализ расположения сайтов рестрикции в последовательности гена EF1a у тлей одного рода показал, что в некоторых случаях не удается подобрать композицию из рестриктаз, отвечающих заданным условиям (конкретный производитель, малое число сайтов рестрикции, достаточная длина фрагментов рестрикции, локализация сайтов узнавания вдали от интрон-экзонных границ и т. д.), так, чтобы получить индивидуальный ПДРФ-ключ для всех анализируемых видов. В таких случаях было предложено проводить дифференциацию между видами, поражающими одни и те же кормовые растения. В частности, в роде Aphis L. такие группы видов образовали A. cracciv-ora, A. spiraecola и A. fabae spp., поражающие тыквенные, пасленовые и бобы; A. idaei и A. ruborum, питающиеся на малине и ежевике; а также A. pomi и A. spiraecola, вредящие яблоням и грушам. Как и ожидалось, оказалось возможным провести взаимную дифференциацию этих видов, проведя сравнительный анализ расположения сайтов рестрикции (рис. 1).

Подобный подход, в соответствии с которым ПДРФ-ключи могут быть построены для видов, питающихся на конкретных кормовых растениях, без учета других видов из тех же таксономических групп, может быть оправдан, поскольку большинство видов тлей имеют достаточно четко очерченный круг кормовых растений. Несмотря на то, что многие виды из числа вредителей сельскохозяйственных и иных возделываемых растений являются полифагами, тем не менее,

разграничение этих видов на группы, ассоциированные с конкретными хозяйственно значимыми (или хозяйственно не значимыми, когда речь идет о вторичных кормовых растениях, представляющих собой резервуар для видов-вредителей) растениями в большинстве случаев возможно. Так, например, виды рода Rhopalosiphum Koch - Rh. nympha-eae, Rh. padi и Rh. maidis - могут совместно поражать картофель, кукурузу и пшеницу. Однако с яблонями ассоциированы только Rh. padi, способность питаться на яблонях Rh. nymphaeae в настоящее время находится под вопросом, а Rh. maidis на яблонях не развиваются [21]. Таким образом, в случае с Rh. nymphaeae, Rh. padi и Rh. maidis необходимо иметь ключ, позволяющий уверенно идентифицировать все три вида, для того, чтобы они могли быть дифференцированы на вторичных кормовых растениях. Как показано, совместное применение рестриктаз EcoRI, AanI и Hin61 позволит идентифицировать все три вида на картофеле, пшенице или других злаках (рис. 2).

В будущем данный подход может быть применен для создания каталогов ПДРФ-таблиц для комплексов вредителей конкретных сельскохозяйственных культур.

Для всех видов тлей, включенных в анализ, была составлена общая ПДРФ-таблица, в которой представлены только рестрикта-зы, позволяющие однозначно идентифицировать каждый из видов (табл. 4). Количество таких рестриктаз варьировало от 4 - для рода Macrosiphum до 16 - для рода Aphis.

Aphis craccivora

Xbal . FspBI

Aphis fabae spp.

Hhal HpyFSI

, I---.

Aphis idaei Trull Aphis ruborum

Dral Trull I Hinll I

ill II i

Aphis pomi Aphis spiraecola Baul Psel

FspBI Mph11031

i i i и i i i

Рис. 1. Сравнительные рестрикционные карты последовательности гена EF1a тлей рода Aphis L., повреждающих одни и те же кормовые растения: тыквенные, пасленовые, бобы - A. craccivora, A. spiraecola, A. fabae spp.; малину, ежевику - A. idaei, A. ruborum; яблони, груши - A. pomi, A. spiraecola.

Таблица 4

ПЦР-ПДРФ-таблица на основе последовательности гена ЕР1а для идентификации видов тлей

Вид Рестрикгазы

BseSI Csp6I Hindlll Rsal Sspl Taal Vspl Xapl

Acyrthosiphon kondoi 438, 655 42,116, 935 262, 279, 552 42, 117, 934 n 386, 707 n 166, 927

A. pi sum n n n n 467, 635 179, 386, 537 335,767 n

Baul Bshl236I BstXI Csp6I Dral Eco81I Hhal Hinll

Aphis craccivora n n n 42, 116, 951 20, 304, 785 n n 108, 363,638

A. gossypii n n 401, 703 n 20, 304, 780 n n 412, 692

A. fabae n n n 42, 116, 938 19, 304, 773 n 283,813 n

A. farinosa n n n 42, 116, 950 23, 304, 781 164, 944 n n

A. idaei n n n n 325, 783 n n n

A. nerii n 325, 785 n 42, 116, 952 461, 649 n 113, 997 n

A. pomi n n n n 23, 304, 791 n n n

A.salicariae n n n n 304, 338, 469 n n n

A. spiraecola 200, 909 n 138, 171, 800 42, 116, 951 23, 304, 782 n n n

A. ruborum n n n n n n n 420, 694

HphI HpyF3I FspBI Trull Lgul Mphll03I Pael Xbal

Aphis craccivora n n 125, 984 n n n n 126, 983

A. gossypii n n 328, 776 n n n n n

A. fabae n 142, 954 n n n n n n

A. farinosa n 122, 164, 822 n n 611,497 n n n

A. idaei n n n 298, 324, 486 n n n n

A. nerii n n n n n n n n

A. pomi n n n n n n n n

A. salicariae 332, 779 n n n n n n n

A. spiraecola n 362, 747 526, 583 n n 283, 826 211, 898 n

A. ruborum n n n n n n n n

AanI Bfml BseDI Vspl — — — —

Macrosiphum albifrons n n n 309, 335,466 — — — —

M. euphorbiae 658, 448 n n n — — — —

Продолжение табл. 4

Вид Рестриктазы

Аап1 Вйп1 ВзеБ1 Увр1 — — — —

М. гоА'ае п 135, 982 п 341, 776 — — — —

ВвиМ Есо1301 ЕсоМ НЬа1 Нт61 НтсПП Крп1 МрЫ1031

Megoura ШогаШ 93, 127, 870 227, 863 п 158, 932 160, 930 540, 550 п 283, 807

М. Ызрейегае 127, 374, 579 163, 917 166, 914 149, 255, 784 139, 157, 784 259, 274, 547 438, 642 п

М. утае 93, 127, 870 227, 863 п 158, 932 160, 930 540, 550 п 283, 807

вер! Тая1 — — — — — —

М. ШогаНй 455, 635 327, 763 — — — — — —

М. Ызрейегае п п — — — — — —

М. утае 455, 635 327, 763 — — — — — —

ВвиМ Свр61 Брп1 НЬа1 Нт61 НтсПП НруР31 МЬо1

Мугив уапат 220, 286, 596 42, 116, 944 109, 993 п п п 185, 917 107, 995

М. репчсае п п 109, 138, 851 153, 945 155, 943 552, 272, 274 п 107, 138, 853

МрЫ1031 Ява! Таа1 Тая1 — — — —

М. уапат 441,661 42, 117, 943 386,716 170, 193, 739 — — — —

М. репчсае п п 78, 301,719 п — — — —

Аап1 ВзЬ12361 ЕсоМ Нт61 НраП Мзр1 Хар1

ШораЬьчркит ттсИй п п 166, 939 п 253, 852 253, 852 п п

Ек. путркаеае п п 166, 937 156, 947 90, 252, 761 90, 252, 761 п 166, 937

Ек. расИ 331,775 203, 903 п п 90, 254, 762 90, 254, 762 201, 905 п

ВсП Брп1 Бга1 НруР31 МЬо1 Хар1 — —

$сЫ2арЫ8 А'СПр! п п 111,991 п п 166, 936 — —

X graminum 107, 999 109, 138, 859 455,651 176, 930 107, 138, 861 п — —

п - сайт узнавания данной рестриктазы в последовательности отсутствует

Рис. 2. Сравнительные рестрикционные карты последовательности гена EF1a тлей рода Rhopalosiphum Koch,

развивающихся на картофеле и злаках

Отчасти это зависело от количества видов одного рода, включенных в анализ. Большое количество видов в роде Aphis потребовало привлечения большего числа ферментов рестрикции для создания уникального ключа для каждого из видов. Другим аспектом, влияющим на количество предлагаемых ферментов, было различие в степени консервативности последовательности EF1a в разных родах тлей. Поскольку из анализа были почти полностью изъяты рестриктазы, сайты узнавания которых локализовались в интронах гена, полиморфизм расположения сайтов рестрикции одних и тех же рестрик-таз в последовательностях разных видов был ограничен высокой консервативностью ну-клеотидной последовательности экзонов гена EF1a у тлей [16]. Так в роде Macrosiphum и близком к нему роде Schizaphis большинство рестриктаз у разных видов тлей имели сайты узнавания в идентичных позициях последовательности. Тем не менее, для всех исследованных родов, используя предложенную таблицу, можно составить ключ, состоящий из двух-трех ферментов рестрикции, который позволит дифференцировать целевые виды тлей.

Заключение

Последовательность гена EF1a у тлей оказалась достаточно информативной для создания ПДРФ-ключей для идентификации видов, в том числе, принадлежащих к одному роду. Даже при исключении из анализа ферментов, сайты узнавания которых локализуются в ин-тронах гена или близко к интрон-экзонной границе, а также так называемых мелкоще-пящих рестриктаз, вариабельность картины расположения сайтов рестрикции на последо-

вательности гена EF1a у тлей всех задействованных в исследовании родов оказалась достаточной для создания идентификационной ПЦР-ПДРФ-таблицы.

ПЦР-ПДРФ-ключи, предполагающие одновременное использование двух-трех ферментов рестрикции для повышения точности получаемого результата, могут быть разработаны как для каждого рода в отдельности, так и для близких видов, ассоциированных с конкретными кормовыми растениями. В ряде случаев оправдан именно такой подход, что связано с приуроченностью большинства видов тлей к конкретному перечню кормовых растений, во-первых, и частой направленностью работ в области карантина и защиты растений на изучение и мониторинг численности вредителей конкретных культур, во-вторых.

Данные факты позволяют заключить, что метод идентификации видов на основе ПЦР-ПДРФ-ключей может оказаться полезным инструментом при работе с тлями - вредителями сельскохозяйственно-ценных и иных возделываемых культур растений.

Авторы выражают искреннюю благодарность доктору биологических наук, профессору С.В. Буге за предоставленные образцы насекомых, кандидату биологических наук В.П. Курченко, доктору биологических наук, профессору В.А. Прокулевичу и заведующему лабораторией биотехнологии кафедры микробиологии биологического факультета БГУ М.И. Потаповичу за помощь в проведении исследования.

Работа выполнена при поддержке гранта № Б13-062 Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований.

Список использованных источников

1. Fauna Europaea: Fauna Europaea version 2.6. [Electronic resource] / Stichting Axademisch Rekencentrum Amsterdam (SARA). - Mode of access: http://www.faunaeur.org. - Date of access: 10.11.2013.

2. Grain aphid clones vary in frost resistance, but this trait is not influenced by facultative endo-symbionts / P. Lukasik [et al.] // Ecological Entomology. - 2011. -Vol. 36, Iss. 6. - P. 790-793.

3. Shufran, K.A. Genetic changes within an aphid clone: homogenization of rDNA intergen-ic spacers after insecticide selection / K.A. Shufran, Z.B. Mayo, T.J. Crease // Biological Journal of the Linnean Society. - 2003. - Vol. 79. -P. 101-105.

4. Жукова, М.И. Тли на картофеле в Беларуси и средства борьбы с ними / М.И. Жукова // Ахова раслш. - 2000. - № 4. - С. 16-18.

5. Molecular and morphometric data indicate a new species of the aphid genus Rhopalosiphum (Hemiptera: Aphididae) / I. Valenzuela ^t al.] // Ann. Entomol. Soc. Am. - 2009. - Vol. 102(6). -P. 914-924.

6. Molecular phylogeny reveals the existence of two sibling species in the aphid pest Brachy-caudus helichrysi (Hemiptera: Aphididae) / J. Piffaretti [et al.] // Zoologica Scripta. - 2012. -Vol. 41 - P. 266-280.

7. Evidence of superclones in Australian cotton aphid Aphisgossypii Glover (Aphididae: Hemiptera) / Y. Chen [et al.] // Pest Manag. Sci. -2013. - Vol. 69. - P. 938-948.

8. Воронова, Н.В. Морфологическая и экологическая гетерогенность в комплексе Macrosiphum gei Koch, 1855 (Rhynchota: Ho-moptera: Aphididae) / Н.В. Воронова, С.В. Буга // Вестник Могилевского государственного университета им. А.А. Кулешова. - 2010. -№ 1(35). - С. 89-99.

9. Воронова, Н.В. Пример адаптационного полиморфизма у тлей, принадлежащих к комплексу Macrosiphum rosae/knautiae/silvati-cum (Rhynchota: Homoptera: Aphididae) / Н.В. Воронова, С.В. Буга // Вестник Гродненского государственного университета им. Я. Купалы. Серия 5. - 2011. - № 1(112). - С. 111-117.

10. Шапошников, Г.Х. Динамика клонов, популяций и видов и эволюция / Г.Х. Шапошников // Журнал общей биологии.-1978. - Т. XXXIX, № 1. - С. 15-33.

11. Шапошников, Г.Х. Морфологическая дивергенция и конвергенция в эксперименте с тлями / Г.Х. Шапошников // Энтомологическое обозрение. - 1965. - Т. 44, Вып. 1. - С. 3-25.

12. Вредители сельскохозяйственных культур и лесных насаждений: в 3 т. / под общ. ред. В.П. Васильева. - 2-е изд. - Киев: Урожай, 1987. - 3 т.

13. Biological identifications through DNA barcodes / P.D.N. Hebert [et al.] // Proc. R. Soc. Lond. B. - 2003. - Vol. 270. - P. 313-321.

14. Zand, A.J. Determining morphological behaviors and genetic variety of rose aphids using RAPD and RFLP-PCR molecular markers /

A.J. Zand, S. Gavanji // Int. J. Agri Crop Sci. -2013. - Vol. 5 (5). - P. 487-492.

15. Identification of aphid species (Hemiptera: Aphididae: Aphidinae) using a rapid polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism method based on the cytochrome oxidase subunit I gene / I. Valenzuela [et al.] // Australian Journal of Entomology. - 2007. -Vol. 46. - P. 305-312.

16. Вариабельность структуры и нуклео-тидного состава гена EF^ у тлей (Hemiptera: Sternorrhyncha: Aphidoidea) / Н.В. Воронова [и др.] // Труды БГУ - 2013. - Т. 8, Ч. 1. - С. 183-192.

17. Воронова, Н.В. Эффективность использования маркеров с ядерной локализацией в филогенетических исследованиях тлей (Rhynchota; Homoptera: Aphididae) / Н.В. Воронова,

B.П. Курченко, С.В. Буга // Доклады НАН Беларуси. - 2011. - Т. 55, № 6, - С. 87-92.

18. Воронова, Н.В. Подбор молекулярно-генетических маркеров для видовой диагностики тлей и построения филогенетических систем/ Н.В. Воронова, В.П. Курченко, С.В. Буга // Труды Белорусского государственного университета. - 2011. - Т. 6, Ч. 1. - С. 181-192.

19. GenBank / D.A. Benson [et al.] // Nucleic Acids Research. - 2008. - Vol. 36. - Database issue D25-D30. doi:10.1093/nar/gkm929.

20. Hall, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT / T.A. Hall // Nucleic acids symposium series. - 1999. -N. 91. - P. 95-98.

21. Holman, J. Host plant catalog of aphids. Palaearctic region / J. Holman. - Berlin: Springer Science, 2009. - 1216 p.

Дата поступления статьи 14 мая 2014 г.