CC BY
65
УДК 577.212.3:595.753 СОЗДАНИЕ ПДРФ-ТАБЛИЦ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ ТЛЕЙ РОДОВ MACROSIPHUM, MYZUS, RHOPALOSIPHUM, ТРЕБУЮЩИХ ПОСТОЯННОГО МОНИТОРИНГА
В.И. Головенчик, БГУ
Одной из наиболее значимых проблем современной селекции растений является проблема вирусного вырождения сортов. Основным фактором в процессе вирусной потери сортов являются насекомые-фитофаги, в частности, тли -активные переносчики фитопатогенных вирусов. Известно, что виды тлей различаются как степенью
вредоносности, так и активностью трансмиссии вирусов, что предполагает проведения различающихся по интенсивности защитных мероприятий. Морфологическое определение видов в ряде случаев затруднено, в связи с чем нами предложены ПЦР-ПДРФ-таблицы на основе гена EF1a для идентификации 8 видов тлей европейской фауны, относящихся к числу видов, требующих постоянного мониторинга.
Ключевые слова: тли, вредители сельскохозяйственных растений, идентификация видов, ПДРФ, EF1a
UDC 577.212.3:595.753 CREATION OF THE PCR-RFLP TABLES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF APHIDS OF MACROSIPHUM, MYZUS, RHOPALOSIPHUM GENERA, WHICH ARE REQUIRED TO BE CONSTANTLY MONITORED
Golovenchik V.I., Belarusian State University vika.polovenchik@mail.ru
экономически One of the most economically significant " problems of the plant breeding is a problem of a viral degeneration of grades. The main factor in the process is a viral transfer by phytophagous insects, particularly aphids are the very active vectors of plant pathogenic viruses. It is known that the different species of aphids vary in both the degree of plant damage and activeness of virus transmission that must influence on the intensity of the plant protective measures. The morphological species identification can be difficult in some cases; that is why we proposed the PCR-RFLP tables based on EP1a gene sequence to identify 8 aphid species of the European fauna, which are among the species, that require to be under constant monitoring.
Keywords: aphids, pests of agricultural crops, species identification, RFLP, EF1a
Постоянный мониторинг численности и видового состава тлей -одна из важнейших задач современной энтомологии. Сложность в решении данной проблемы состоит в том, что среди тлей отмечается большое число труднодифференцируемых видов, что исключает применение морфологического метода идентификации. В то же время точное определение видов крайне важно, так как сходные виды могут существенно различаться вредоносностью и, как следствие, требуют применения различных по интенсивности защитных мероприятий. Поэтому в настоящее время на первое место вышли методы ДНК-идентификации видов, в частности, определение по ПДРФ-ключам.
пДРФ-ключи представляют собой уникальную комбинацию ферментов рестрикции, позволяющих дифференцировать близкие виды вредителей по количеству и/или длине образующихся рестрикционных фрагментов [1].
Как известно, тли относятся к числу наиболее активных векторов фитопатогенных вирусов и наносят серьезный экономический ущерб сельскому хозяйству. Представители родов МаогоБ1рЬит, Мугиэ, ^ора!ов1рЬит, часто регистрирующиеся в Центральной и Восточной Европе, поражают такие ценные культивируемые растения, как пшеница, рожь, картофель, яблони, груши и др. Данные роды включают в себя комплексы труднодифференцируемых видов и форм, которые могут существенно различаться вредоносностью и приуроченностью к конкретным кормовым растениям.
Целью нашей работы было разработать ПЦР-ПДРФ-таблицы на основе последовательности гена ББ1а для идентификации видов тлей рода Маогов1рЬит, Мугив, ИЬора!ов1рЬит.
В качестве целевого гена для создания ПДРФ-таблиц был выбран ядерный ген субъединицы альфа-фактора элонгации 1 (ББ1а). Как было показано ранее [2], этот ген имеет как консервативные, так и вариабельные участки, что позволяет на его основе создать ПДРФ-таблицы, пригодные для идентификации видов разной степени таксономической удаленности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы последовательности ББ1а 8 видов тлей европейской фауны (табл.1), расшифрованные сотрудниками кафедры зоологии БГУ [3, 4] и полученные из международной базы данных ОепБапк ЫОБ!.
Таблица 1- Видь тлей, включе нные в анализ
Вид Ареал Повреждаемые Код
Macrosiphum rosae Космополит Растения семейства AY2i9736.i
M. euphorbiae Космополит Картофель, горох, HMii77SS.i
IM. albifrons Es sig, Космополит Растения рода Люпин DQ005i54.i
Myzus persicae Космополит Огурцы, слива, EF4i93i2.i
IM. verians Космополит Соивы,яблони FJ982429.i
Rhopalosiphum Космополит Кукуруза, рожь, AY2i97iS.i
mh. nymphaeae L. , Космополит Яблони, груши, EU35S935.i
Rh. padi L., i758 Космополит Кукуруза, картосфель, AY2i97i9.i
Был проанализирован фрагмент гена с 259 по 1360 нуклеотид, включающий участок со второго по пятый экзоны, а также лежащие между ними интроны.
Поиск сайтов рестрикции был проведен в программе BioEdit для ферментов, производимых компаниями Thermo Scientific и Fermentai Internati. Графические рестрикционные карты строили в программе Codon Code Aligner.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе работы было исследовано 87 эндонуклеаз, которые имели не более 2 сайтов узнавания в изучаемых последовательностях тлей данных родов; 65 из изученных рестриктаз были исключены из анализа так как либо имели сайты узнавания в идентичных позициях гена, либо располагались близко к интрон-экзонной границе. В итоге были
отобраны 22 рестриктазы: 3 имели сайты узнавания в интронах, 15 - в экзонах, 4 - как в экзонах, так и в интронах. Для выбранных ферментов была создана общая определительная ПДРФ-таблица и построены рестрикционные карты.
В ходе сравнительного анализа рестрикционных карт было показано, что одновременное использование нескольких ферментов позволяет дифференцировать различные виды тлей одного рода. В частности, совместное применение рестриктаз EcoRI, AanI и Ып61 позволяет идентифицировать все три вида тлей рода ^ора!ов1рЬит, регистрируемых на картофеле, пшенице или других злаках (рис. 1).
/?/7ора/оз/р/7Ш7 расИ
Р11юра1оз1р11ит та^'я
I I
РИюра1о81р11ит путрЬаеае
Рисунок 1 - Идентификационные рестрикционные карты фрагмента гена EF1a тлей рода Rhopalosiphum
Виды рода Мугиэ, питающиеся на сливах, можно идентифицировать, используя одну из 4 предлагаемых рестриктаз, каждая из которых имеет сайты узнавания в последовательностях гена только одного вида (рис. 2).
Мугиэ уапапэ
ввит_ввит мрмюз_
±
1
Мугив ретсае
Рисунок 2 - Идентификационные рестрикционные карты фрагмента гена EF1a, позволяющие дифференцировать Myzus регаюае и Myzus varians
Виды рода Масгов1рЬит, питающиеся на картофеле, горохе и кукурузе, позволяет определить совместное использование ферментов VspI, AanI и BfmI (рис. 3).
Масгов1рЬит а!Ь1^опв
_Уэр!_У5р1_
Масгоэ'фЬит еирЬогЫае
Масгоэ'фЬит говае
Рисунок 3 - Идентификационные рестрикционные карты фрагмента гена EF1a тлей рода Macrosiphum
Таким образом было показано, что на основе последовательности гена EF1a для всех исследуемых родов удалось составить ПДРФ-ключи,
которые позволяют уверенно дифференцировать виды тлей родов Macrosiphum, Myzus, Rhopalosiphum, часто регистрируемые в Центральной и Восточной Европе и относящиеся к числу опасных вредителей сельскохозяйственных культур.
Заключение
Последовательность гена EF1a у тлей оказалась достаточно информативной для создания ПДРФ-ключей для идентификации видов тлей, в том числе морфологически труднодифференцируемых.
Результаты данного исследования будут включены в методическое пособие по ДHK-идeнтификации видов - вредителей сельскохозяйственных растений, которое будет рекомендовано для использования специалистами в области защиты растений.
Работа выполнена при поддержке гранта № Б13-062 Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Воронова, H.B. Вариабельность структуры и нуклеотидного состава гена EF^ у тлей (Hemiptera:Sternorrhyncha: Aphidoidea) I H.B. Воронова [и др.] II Труды БГУ. - 2Gi3. - Т. 8, Ч. 1. - С. i83-i92.
2. Воронова, H.B. Подбор молекулярно-генетических маркеров для видовой диагностики тлей и построения филогенетических систем I H.B. Воронова, В.П. Курченко, C.B. Буга II Труды Белорусского государственного университета. - 2Gi i. - Т. 6, Ч. 1. - С. 181-i92.
3. Воронова, H.B. Эффективность использования маркеров с ядерной локализацией в филогенетических исследованиях тлей (Rhynchota; Homoptera:Aphididae) I H.B. Воронова, В.П. Курченко, С.В. Буга!! Доклады HAH Беларуси. - 2Gii. - Т. 55, № 6, - С. 87-92.
4. Zand, A.J. Determining morphological behaviors and genetic variety of rose aphids using RAPD and RFLP-PCR molecular markers I A.J.Zand, S. Gavanji II Int. J.Agri. Crop Sci. - 2Gi3. - Vol. 5 (5). - P. 4B7-492.
