CC BY
11УДК 577.212:595.753
Н.В. Воронова, М.М. Воробьева, Д.Г. жоров, С.В. Буга
ПРИМЕНИМОСТЬ МЕТОДА ПЦР-ПДРФ-АНАЛИЗА БАРКОДИНГ-
РЕГИОНА COI ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНВАЗИВНЫХ ВИДОВ
НАСЕКОМЫХ В ФАУНЕ БЕЛАРУСИ (НА ПРИМЕРЕ ТЛЕЙ РОДА
APHIS L.)
Белорусский государственный университет Беларусь, 220030, г. Минск, пр-т Независимости, 4
На основе нуклеотидных последовательностей баркодинг-региона COI разработаны ПЦР-ПДРФ-ключи для идентификации тлей A. pomi / A. spiraecola фауны Беларуси, собранных с разных кормовых растений. Был уточнен перечень кормовых растений A. pomi / A. spiraecola в условиях Беларуси.
Ключевые слова: тли, идентификация видов, баркод-регион, рестрикционные карты, Aphis pomi, Aphis spiraecola
Введение
Корректная идентификация таксономической принадлежности биологических образцов в ряде случаев может иметь принципиальное значение. Видовая диагностика, т.е. достоверное отнесение объекта к тому или иному биологическому виду, линии или биотипу, играет ключевую роль при обеспечении внешнего карантина или мониторинге распространения и численности чужеродных для фауны и флоры видов вредителей или переносчиков заболеваний человека, животных и растений. В Европе особенное значение имеет мониторинг видов-инвайдеров, поскольку в последние годы наблюдается расширение их числа, рост экономического и экологического ущерба от их внедрения как в естественные, так и в культурфитоценозы [1-3].
Инвазивные виды, как правило, приводят к появлению специфических угроз для сложившихся на этой территории сообществ живых организмов [4]. В случае с насекомыми-фитофагами, расселение которых чаще всего происходит с интродукцией их кормовых растений, - это риск их перехода на другие виды растений, которые произрастают или возделы-ваются на новой для инвайдера территории и могут оказаться пригодными для его питания. Заселение инвайдерами аборигенных растений часто сопровождается эскалацией численности вредителя, что обусловлено как отсутствием давления внутривидовой конкуренции,
так и слабым прессом со стороны хищников и патогенов [5, 6]. По этой причине распространение инвайдеров требует особого внимания со стороны исследователей.
В случае, когда морфологические ключи не предоставляют достаточной информации, как это часто бывает с сестринскими видами или при развитом внутривидовом полиморфизме, наиболее точным методом для определения таксономической принадлежности насекомых признана ДНК-идентификация. Как известно, под термином «ДНК-идентификация» понимают целую группу методов и подходов, объединенных принципом использования маркерных последовательностей ДНК в качестве основы для создания того или иного рода идентификационных ключей. Наиболее известными среди методов ДНК-идентификации видов, вероятнее всего, являются ДНК-штрихкодирование (ДНК-баркодинг) и идентификация по результатам фрагментного анализа микросателлитных повторов [7-9]. Оба метода при должном выборе объекта и задач исследования демонстрируют высокую достоверность и разрешающую способность. Сложностями, ограничивающими широту их применения, особенно для решения рутинных задач, являются дороговизна реактивов, трудоемкость и необходимость наличия некоторого дорогостоящего оборудования (в частности, секвенатора). По этой причине мы предложили иной, гораз-
до более дешевый и простой в исполнении метод идентификации видов, основанный на использовании ПЦР-ПДРФ-ключей, который хорошо зарекомендовал себя в работах, связанных с установлением видовой принадлежности у рыб, и который мы также рекомендовали использовать для идентификации видов тлей. В предыдущей работе [10] мы подробно обсуждали преимущества использования этого метода для рутинной таксономии. В настоящей статье мы проанализировали возможность использования для создания ПЦР-ПДРФ-ключей иного молекулярного маркера - гена субъединицы 1 цитохромок-сидазы с (COI), а точнее, так называемого, баркод-региона - участка гена длиной около 750 п.н. в 5'-области. Такой выбор продиктован несколькими причинами: во-первых, будучи митохондриальным, ген COI не имеет аллелей в геноме и интронов в структуре, что существенно снижает вероятность ложнопо-ложительных или ложноотрицательных результатов в процессе диагностики; во-вторых, последовательность гена COI у тлей чрезвычайно консервативна, и число гаплотипов, выявляемых у одного вида, редко достигает десяти [11, 12], что также повышает достоверность результатов, получаемых методом ПЦР-ПДРФ; в-третьих, существует несколько пар известных универсальных праймеров, позволяющих амплифицировать баркод-регион гена COI у тлей [13, 14]; и, в-четвертых, благодаря глобальному развертыванию проекта по ДНК-штрихкодированию жизни [15], последовательности баркод-региона многих видов тлей уже сегодня могут быть найдены в глобальной базе данных нуклеотидных последовательностей BOLD (1147 видов по состоянию на 2016 г.), что позволяет получать данные о внутривидовой вариабельности целевого участка генома и использовать эти данные для построения идентификационных ПЦР-ПДРФ-таблиц.
В качестве моделей для исследования применимости предлагаемого подхода для идентификации видов у тлей мы использовали несколько видов рода Aphis L., широко распространенных в Беларуси и, в ряде случаев, вызывающих затруднения при идентификации этих насекомых по морфологическим признакам. В частности, мы рассмотрели пару морфологически сход-
ных видов: Aphis pomi de Geer, 1773 и Aphis spiraecola Patch, 1914. В Беларуси A. pomi принадлежит к числу основных вредителей семечковых плодово-ягодных культур (особенно в питомниках), тогда как A. spiraecola является опасным вредителем и переносчиком возбудителей вирусных заболеваний многих плодовых культур в регионах с субтропическим климатом, который в настоящее время осуществляет активную экспансию на север [16]. В условиях Центральной Восточной Европы A. spiraecola повреждает целый круг плодово-ягодных и декоративных культур [17]. Учитывая высокое морфологическое сходство этих насекомых, появление недорогих молекулярных ключей для их идентификации было бы крайне желательным. Мы не включили в анализ еще один инвазив-ный вид рода Aphis, развивающийся в Беларуси на спирее, - Aphis spiraephaga Müller, 1961, поскольку он может быть уверенно дифференцирован по морфологическим признакам [18].
Материалы и методы
Образцы тлей указанных видов были собраны в 2013-2015 гг. на территории Беларуси со спиреи (Spiraea sp.), боярышников (Crataegus sp.), кизильника блестящего (Cotoneaster lucidus Schltdl., яблонь (Malus sp.), груши (Pyrus communis L), айвы японской (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach), ирги (Amelanchier spр.). Всего для проверки гипотезы о возможности идентификации тлей A. pomi и A. spiraecola методом ПЦР-ПДРФ было отобрано по одной особи из 44 колоний тлей.
Для выделения ДНК тлей коллектировали в 96%-ный этанол и хранили в морозильной камере при температуре -20 °С. ДНК выделяли из единичных насекомых, используя коммерческий набор DNA purification Kit (Thermo scientific), модифицировав методику производителя с учетом малого объема биоматериала и плотности покровов насекомого.
Фрагмент гена COI, соответствующий бар-код-региону, получили в результате ПЦР с широко применяемыми универсальными праймерами LepF/LepR (ATTCAACCAAT-CATAAAGATATTGG / TAAACTTCTGGAT-GTCCAAAAAATCA), используя стандартный для этих праймеров протокол [19] и Taq-полимеразу (Thermo scientific). Качество и ко-
личество ПЦР-продукта оценивали визуально в 1,5%-ном агарозном геле с использованием в качестве маркера молекулярного веса 1 Kb DNA-Ladder (Thermo scientific). Учитывая, что ген COI не имеет вариабельных по длине участков, положительным считали результат, при котором на электрофореграмме обнаруживался один четкий фрагмент ДНК длиной 707 п.н.
Последовательности COI A. pomi и A. spi-raecola получилили из базы данных BOLD (www.barcodinglife.com). Всего было проанализировано 138 последовательностей A. pomi (Европа, Северная Америка, Азия и Австралия) и 227 последовательностей A. spiraecola (Северная Америка, Африка, Азия, Австралия и Южная Америка).
Поиск сайтов рестрикции в последовательностях COI тлей исследуемых видов осуществили в программе BioEdit [20]. Выбор альтернатив и содание идентификационных таблиц провели вручную по результатам анализа построенных рестрикционных карт. При наличии внутривидовых гаплотипов COI, различающихся рестрикционными картами, все ферменты рестрикции, применение которых могло бы привести к получению вариативных результатов, исключали из идентификационных таблиц.
В качестве субстрата для выбранного фермента рестрикции использовали неочищенный продукт ПЦР. Рестрикцию проводили в строгом соответствии с протоколом производителя (BamHI (Thermo scientific)) в течение 3 ч. Результат рестрикции оценивали электрофорети-чески в 2,5%-ном агарозном геле, сравнением полученных фрагментов с маркером молекуляр-
HpyF3l
Lwel
BseGI iStsl
Tfil Hinfl
ного веса, а также с исходным ПЦР-продуктом, который выступал в качестве внутреннего контроля длины анализируемого фрагмента.
Результаты и обсуждение
Для построения рестрикционных карт мы использовали информацию о сайтах унавания всех ферментов рестрикции и их изошизоме-ров, доступных в соответствующих базах данных коммерческих продуктов [21]. Оказалось, что всего в последовательностях A. pomi и A. spiraecola обнаруживаются сайты рестрикции для 44 рестриктаз, однако большинство из них совпадали. После сравнительного анализа рестрикционных карт нам удалось выбрать 11 ферментов для A. pomi и 8 - для A. spiraecola, которые не имели сайтов узнавания в последовательностях второго вида, с которым необходимо проводить дифференциацию (рис. 1).
По нашему мнению, для альтернативной идентификации образцов A. pomi / A. spiraecola можно использовать любую пару рестриктаз из числа приведенных в табл. 1, при этом ферменты рестрикции должны быть выбраны таким образом, чтобы каждая имела сайт узнавания в последовательности лишь одного вида. Несложно рассчитать, что суммарное число возможных парных комбинаций равно 88.
Мы оценили эффективность использования предлагаемого подхода на практике, и установили видовую принадлежность некоторых образцов A. pomi / A. spiraecola, коллектирован-ных в Беларуси с разных кормовых растений, идентификацию которых методом морфоме-трического анализа [22] провести не удалось.
Aphis pomi
Ssil iBtsCI
Hphl Xspl
BamHI
Aphis spiraecola
Beel
Bin 1 iPlaAII |PSÍI rati BstAUl CviQI Eco31I
1 I
Рис. 1. Рестрикционные карты фрагмента COI, содержащие информацию о наличии сайтов рестрикции для набора рестрикционных ферментов, позволяющих провести альтернативную идентификацию видов A. pomi /
A. spiraecola
Таблица 1
Идентификационная ПЦР-ПДРФ-таблица для диагностики A. pomi/A. spiraecola, построенная
на основе анализа баркод-региона COI
Название фермента рестрикции Сайт узнавания фермента рестрикции Вид тли и длина образующихся фрагментов
Aphis pomi Aphis spiraecola
BamHI G/GATCC 52 + 655 -*
BseGI GGATG (2/0) 245 + 462 -
BtsCI GGATG(2/0) 351+356 -
Hinfl G/ANTC 279 + 428 -
HphI GGTGA(8/7) 288+419 -
HpyF3I C/TNAG 74 + 633 -
Lwel GCATC(5/9) 230 + 477 -
Ssil CCGC(-3/-1) 293 +414 -
StsI GGATG 253 +454 -
Tfil G/AWTC 279 + 428 -
XspI C/TAG 276 +431 -
BccI CCATC (4/5) - 284 + 423
BinI GGATC (4/5) - 74 + 633
BstAUI T/GTACA - 233 + 474
CviQI G/TAC - 234 +475
Eco31I GGTCTC(1/5) - 58 + 649
PlaAII GT/AC - 89 + 618
PsiI TTA/TAA - 171+536
TatI W/GTACW - 233 + 474
*(-) - сайт узнавания данной рестриктазы в последовательности отсутствует
хорошо визуализируются в электрофорезном геле и результаты идентификации полностью однозначны (рис. 2).
В результате мы обнаружили, что в исследованных нами сборах А. рот1 / А. spiraecola представленность обоих видов примерно одинакова (табл. 2).
После проведения ПЦР и последующей обработки ПЦР-фрагментов рестриктазой ВатН1, «отрезающей» от ПЦР-продукта минимальный, в сравнении с другими предлагаемыми ферментами рестрикции, фрагмент (52 п.н.), оказалось, что различия в длине фрагментов ДНК после проведения рестрикции
800^ '
70(К ___
600^ 500——'
1 - тли, собранные с Chaenomeles japonica; 2 - тли, собранные с Malus sp.; 3 - тли, собранные со Spiraea sp.; 4 - тли, собранные с Crataegus sp.; 5 - тли, собранные с Cotoneaster lucidus; 6 - тли, собранные со Spiraea sp.; 7 -тли, собранные с Malus sp.; М - маркер молекулярного веса; P - фрагмент, обработанный рестриктазой BamHI;
К - фрагмент, не обработанный рестриктазой Рис. 2. Электрофореграммы результатов ПЦР-ПДРФ-анализа, проведенного для идентификации видов A. pomi / A. spiraecola в сборах тлей с разных кормовых растений (пример)
1 2 3 4 5 6 7 Р К
P К Р К Р к Р К Р К Р К
Таблица 2
Результаты ПЦР-ПДРФ-диагностики видов тлей в образцах, собранных с разных кормовых растений (с использованием рестриктазы ВатН1)
Кормовое растение Результаты идентификации тлей
Aphis pomi Aphis spiraecola
Spiraea sp. 1 12
Crataegus sp. 6 3
Cotoneaster lucidus 8 3
Malus sp. 4 0
Pyrus communis 2 0
Chaenomeles japonica 0 3
Amelanchier sp. 0 2
Суммарное количество для всех растений 21 23
При оценке встречаемости A. pomi и A. spi-raecola на конкретных кормовых растениях с уверенностью можно заключить, что только на спиреях преобладают A. spiraecola. В остальных случаях, учитывая ограниченный размер выборки, обоснованных заключений о преимущественной связи каждого (или какого-то одного) вида тлей с конкретным кормовым растением сделать нельзя.
Заключение
Оценка применимости и эффективности метода ПЦР-ПДРФ для идентификации тлей рода Aphis L. на яблонях, спиреях и других кормовых растениях, на которых в Беларуси регистрируются A. pomi / A. spiraecola, показала, что последовательность COI (баркод-регион) этих видов тлей обладает достаточной консервативностью на внутривидовом и вариабельностью на межвидовом уровнях, чтобы можно было разработать ПЦР-ПДРФ-ключи для идентификации этих двух видов.
На основе предлагаемого нами списка ре-стрикционных ферментов можно составить 88 ПДРФ-ключей, позволяющих идентифицировать виды A. pomi и A. spiraecola по альтернативному принципу.
С использованием предлагаемого подхода и произвольно выбранного из числа возможных ключа мы оценили встречаемость A. pomi / A. spiraecola в Беларуси на нескольких кормовых растениях, причем оказалось, что на спиреях почти исключительно преобладают A. spiraecola.
Авторы выражают искреннюю благодарность заведующему кафедрой микробиологии БГУ, профессору, д.б.н. В.А. Прокулевичу за помощь в получении результатов.
Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (проект Б15-063), а также гранта Министерства образования Республики Беларусь на выполнение НИР аспирантами и авторскими коллективами студентов на 2016 г.
Список использованных источников
1. Complex patterns of global spread in invasive insects: eco-evolutionary and management consequences / J.R. Garnas [et al.] // Biological Invasions. - 2016. - Vol. 18, N. 4. - P. 935-952.
2. Genetic Diversity and Structure of Brazilian Populations of Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae): Implications for Pest Management / K.L. Silva-Branda [et al.] // Journal of Economic Entomology. - 2015. -Vol. 108,N. 1. - P. 307-316.
3. Global Invasive Species Programme (GISP), 1999 [Electronic resourse]. - Mode of access: http: // jasper. stanford.edu/gips/. - Date of access: 01.10.2016.
4. Воробьева, М.М. Предварительные результаты изучения уровня генетического сходства инвазивных и аборигенных популяций алычовой тли (Brachycaudus divaricatae Shap.,1956) / М.М. Воробьева, Н.В. Воронова, С В. Буга // Вестник БГУ Серия 2. - 2015. -№ 3. - С. 49-55.
5. Harizanova, V. Preliminary study on the invasive Acizzia jamatonica (Hemiptera: Psyllidae) and its predators in Bulgaria / V. Harizanova, A. Stoeva, M. Mohamedova // Agricultural Science and Thechnology. - 2012. -Vol. 4 (1). - P. 56-61.
6. Epuraea imperialis (Reitter, 1877) new invasive species of nitidulidae (Coleoptera) in Europe, with a checklist of sap beetles introduced to Europe and Mediterranean areas / J. Jelinek [et al.] // Atti della Accademia Peloritana dei Pericolanti. - 2016. - Vol. 94 (2). - P. 1-24.
7. Biological indentifications through DNA barcodes / P.D.N. Hebert [et al.] // Proc. R. Soc. Lond. B. - 2003. - Vol. 270. - P. 313-321.
8. Identification of aphid species (Hemiptera: Aphididae: Aphidinae) using a rapid polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism method based on the cytochrome oxidase subunit I gene / I. Valenzuela [et al.] // Australian Journal of Entomology. - 2007. -Vol. 46. - P. 305-312.
9. Identification of the population structure of Myzus persicae (Hemiptera: Aphididae) on peach trees in China using microsatellites / J. Li [et al.] // Journal of Insect Science. - 2015. -Vol. 15, N. 1. - P. 2-9.
10. Воронова, Н.В. Разработка ПЦР-ПДРФ таблиц на основе последовательности гена EF1a для идентификации видов тлей -вредителей сельскохозяйственных растений / Н.В. Воронова, В.И. Головенчик // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. -Минск: Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 2015. - Т. 19. - С. 100-109.
11. Воробьева, М.М. Генетическая структура вида Macrosiphum gei Koch, 1855 в Беларуси / М.М. Воробьева, П.К. Супра-нович, Н.В. Воронова // Факторы экспериментальной эволюции: материалы XI Меж-дунар. научно-практич. конф., 12-16 сент. 2016 г. / Одесский национальный ун-т им. И.И. Мечникова (ОНУ). - Одесса, 2016. - С. 36-41.
12. Воробьева, М.М. Генетическая вариабельность аборигенных и инвазивных видов
тлей родов Macrosiphum Pass. и Brachycaudus van der Goot / М.М. Воробьева, П.К. Супра-нович, Н.В. Воронова // Труды БГУ - 2014. -Т. 8, Ч. 2. - С. 135-142.
13. Species identification of aphids (Insecta: Hemiptera: Aphididae) through DNA barcodes / R.G. Foottit [et al.] // Molecular ecology resources. - 2008. - Vol. 8, N. 6. - P. 1189-1201.
14. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates / O. Folmer [et al.] // Molecular Biology and Biotechnology. -1994. - Vol. 3, N. 5. - P. 294-299.
15. DNA barcoding and the associated PhylAphidB@se website for the identification of European aphids (Insecta: Hemiptera: Aphididae) / A. Coeur d'Acier [et al.] // PLoS ONE. - 2014. - Vol. 9, N. 6. - P. 1-16.
16. Blackman, R.L. Aphids of the world trees. An identification and information guide / R.L. Blackman, V.F. Eastop. - London: CAB International, 1994. - 1024 p.
17. Holman, J. Host plant catalog of aphids. Palaearctic region / J. Holman. - Berlin: Springer Science, 2009. - 1216 p.
18. Горленко, С.В. Устойчивость древесных интродуцентов к биотическим факторам / С.В. Горленко, А.И. Блинцов, Н.А. Панько. -Минск: Наука и техника, 1988. - 189 с.
19. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera / M. Hajibabaei [et al.] // PNAS. - 2006. - Vol. 103. - P. 968-971.
20. Hall, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence aligment editor and analysis program for Windows 95/98/NT / T.A. Hall // Nucleic acids Symposium series. - 1999. -N. 91. - P. 95-98.
21. Roberts, J.R. Restriction enzymes and their isoschizomers / J.R. Roberts // Nucleic Acids Research. - 1988. - Vol. 16. - P. 271-313.
22. Жоров, Д.Г. Проблема морфометри-ческой идентификации зеленых тлей рода Aphis L., повреждающих деревья и кустарники семейства Rosaceae в зеленых насаждениях Беларуси / Д.Г. Жоров // Вестник БГУ. Серия 2. - 2016. - № 2. - С. 67-74.
N.V. Voronova, M.M. Varabyova, D.G. Zhorov, S.V. Buga
APPLICABILITY OF PCR-RFLP KEYS BASED ON COI BARCODE
REGION FOR THE IDENTIFICATION OF INVASIVE SPECIES IN THE INSECT FAUNA OF BELARUS (ON EXAMPLE OF APHIDS
OF GENUS APHIS L.)
Belarusian State University Belarus, 220030, Minsk
PCR-RFLP keys based on COI barcode region for the identification of A. pomi / A. spiraecola samples collected from different host-plants in Belarus were developed. The list of A. pomi / A. spiraecola fodder plants in the Belaru-sian conditions has been updated.
Key words: aphids, species identification, barcode region, restriction map, Aphis pomi, Aphis spiraecola
Дата поступления статьи 10 октября 2016 г.
